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1、基金项目:国家自然科学基金(30600683)资助 Supported by theN ationalNatural Science Foundation ofChina(30600683)?Corresponding author?s e?mai,l xh_bjb 论著 假肥大型进行性肌营养不良患者的基因型、表型分析及随访研究张艳芝1,熊!晖1?,王小竹2,王!硕1,罗!静1,王静敏1,姜玉武1,常杏芝1,潘!虹1,齐建光1,李万镇1,袁!云3,吴希如1(1.北京大学第一医院儿科,北京 100034;2.北京大学医学遗传中心;3.北京大学第一医院神经内科)摘!要 目的:总结假肥大型进行性肌营
2、养不良(Duchenne/Beckermuscular dystrophy,DMD BMD)患者的临床特征并进行基因诊断,分析基因型与表型的关系,以提高其诊疗水平。方法:收集整理 90例患者的临床资料,提取外周血基因组 DNA,采用多重连接探针扩增(multiplex ligation?dependent probe amplification,M LPA)的方法进行抗肌萎缩蛋白基因 DMD 突变的检测,对未检测到缺失或重复的患儿扩增其肢带型肌营养不良 2I型(li mb girdle mus?cular dystrophy,LGMD2I)致病基因 FKRP的外显子,然后进行 DNA直接测序,
3、并随访患者病情变化。结果:从临床确诊的 90例 DMD/BMD患者中检测出 58例 DMD 基因外显子缺失(64.44%,58/90),9例外显子重复(10.00%,9/90),检出突变的 34例患儿的母亲中 17例(50%,17/34)为缺失/重复的杂合性改变。对 23例未检测到 DMD 基因重复或缺失的患儿进一步直接测序 FKRP基因编码序列,未发现致病突变。对 14例患儿按照国外文献方案进行小剂量泼尼松短期间歇治疗,随访发现短期内激素治疗未见明显疗效,因例数及疗程不够尚不能得出结论;其中 1例患儿母亲再次怀孕后在北京大学第一医院行产前诊断,经 MLPA检测羊水细胞,诊断胎儿为女性携带者。
4、结论:本组病例显示,DMD 基因缺失突变主要发生在热点区 45 54外显子之间,重复突变主要发生在基因的 5 端。识别DMD BMD的临床特征及基因突变的类型有助于提高对该病的认识,判断预后。MLPA 作为一种简便快速的诊断方法可对 DMD BMD进行基因诊断,检出携带者,更好的进行遗传咨询。关键词 肌营养不良;核酸探针;基因扩增;基因缺失中图分类号 R746.2!文献标识码 A!文章编号 1671?167X(2010)06?0661?06do:i 10.3969/.j issn.1671?167X.2010.06.014Genotype,phenotype analysis and foll
5、ow?up study on patientswith Duchenne/Bec?ker muscular dystrophyZHANG Yan?zhi1,X IONG Hui1?,WANG X iao?zhu2,WANG Shuo1,LUO Jing1,WANG Jing?m in1,JIANG Yu?wu1,CHANG X ing?zhi1,PAN hong1,Q I Jian?guang1,LIW an?zhen1,YUAN Yun3,WU Xi?ru1(1.Depart ment of Pediatrics,Peking University FirstHospita,l Beijin
6、g 100034,China;2.Peking University Center ofM edicalGenetics;3.Department ofNeurology,Peking University F irstHospital)ABSTRACT!Objective:To i mprove the diagnosis and management of Duchenne/Becker muscular dys?trophy(DMD/BMD).M ethods:Clinical features of 90 cases of DMD/B MD were collected.Genom i
7、cDNA was extracted using standard procedures from the peripheral blood leukocytes,and multiplex liga?tion?dependent probe amplification(MLPA)was applied to detectDMD gene to identify genetic muta?tion.For those patients whose deletion/duplication mutation was not identified,FKRP gene mutationanalysi
8、s was performed using PCR?DNA direct sequence.All the cases were followed up.Results:Among the 90 cases of clinically diagnosedDMD/BMD,exonsdeletion ofDMD wasdetected in 58 cases(64.44%),and exons duplication in 9(10.00%).Among the 34 mothers w ith an affected boy butw ithout previous genetic confor
9、 mation,17 were confir med to be carriersw ith gene deletion/duplication.None of the 23 cases,w ithout detectedDMD gene deletion/duplication,carried FKRP gene mutation.Fourteen children were given short?ter m interm ittent prednisone therapy(0.75 mg/kg daily during thefirst 10 days of eachmonth).The
10、 coursewas not long enough and the sa mple size was too small to con?clude any benefits or side effects.Prenatal diagnosiswas provided for one mother in her next pregnancydetecting a female carrier fetus.Conclusion:DMD gene deletionsm ainly occurs between exons 45 and54,while duplicationsmostly at 5
11、?ter m inus.Identification of the characteristics and types of genemuta?tionmay facilitate the recognition and prognosis prediction of DMD/BMD.MLPA is a non?complex andquick diagnostic tool for DMD/BMD and its carriers,and also helpful in genetic counseling.KEY WORDS!Muscular dystrophy;Nucleic acid
12、probes;Gene a mplification;Gene deletion 661 北京大学学报(医学版)JOURNAL OF PEK I NG UN I VERSI TY(HEALTH SCI ENCES)!Vo.l 42!No.6!D ec.2010!假肥大型进行性肌营养不良是一种严重的神经肌肉疾病,分为杜氏肌营养不良(Duchennemusculardystrophy,DMD)和贝克肌营养不良(Becker muscu?lar dystrophy,BMD),是以缓慢进行性加重的对称性肌无力和肌萎缩为特点的遗传性肌肉病变,主要累及骨骼肌,可伴静止性认知障碍和心肌损害 1;二者在男性新
13、生婴儿中的发病率分别是 1/3 500和1/12 000 2,其中 DMD病情严重,预后不良,一般 5岁前发病,6岁后出现行走困难,13岁前丧失行走能力而依赖轮椅生活,20岁左右因呼吸衰竭或心力衰竭而死亡;BMD病情变化多样,进展相对缓慢,在首次发病 15 20年后仍可有行走能力,研究发现二者均是由于抗肌萎缩蛋白基因(dystrophin基因,亦称DMD 基因)突变所致,其主要的突变类型为基因的部分 缺失 或重 复,占 全部 突变 基因 的 50%70%3。由于本病目前尚无有效治疗方法,故高效、准确的 DMD致病基因的检测、携带者的检出、产前诊断及遗传咨询成为预防本病的关键。早期干预,采取以糖
14、皮质激素为主的综合治疗措施可改善患儿生活质量,延长寿命。多重连接探针扩增(multiplexligation?dependent probe amplification,MLPA)是利用可与样本 DNA正确杂交并被连接酶连接的特异性探针进行扩增和半定量分析 4,是针对基因缺失或重复最有效的检测技术。本研究对收集到的 90例DMD/BMD病例进行临床特征的总结,并采用MLPA方法对患者进行 DMD 基因突变的检测,对部分患者采用特异抗体免疫组织化学染色以探讨 DMD患者临床表现与抗肌萎缩蛋白的表达及基因型的关系。1!资料与方法1.1!研究对象收集自 2007年 3月至 2010年 3月就诊于北京
15、大学第一医院儿科门诊、经临床诊断为 DMD/BMD患者 90例,其中 DMD患者 73例,BMD患者 17例,均为无血缘关系男性,父母非近亲结婚。患者绝大部分为汉族(4例患儿的母亲为蒙古族)。纳入标准:(1)男孩;(2)儿童期隐匿起病;(3)进行性对称性肢体无力,近端重于远端,姿势和步态异常(Gower征阳性);(4)血清肌酸激酶(CK)显著增高,或无(3)所述症状,而仅化验检查提示 CK增高的婴幼儿;(5)肌电图提示肌源性损害。本研究经北京大学第一医院伦理委员会批准,所有检查均获得患者及家属的知情同意。1.2!研究方法1.2.1!临床分析及随访!对 90例患者病历记载的发病特点、临床表现、辅
16、助检查、病理检查资料,以及糖皮质激素的治疗效果进行回顾,随访结果分为缓解组(平卧起身站立时间减少,用力肺活量增加,独自上标准楼梯 4格,跑步 9m 所需时间减少,摔跤减少,心脏功能好转,CK水平下降)和无缓解组(病情进行性进展,跑步 9 m 所需时间无减少,摔跤增多,用力肺活量无增加,CK水平无下降,心脏功能无改善)。1.2.2!基因组 DNA的提取!采集患儿及其母亲外周血各 5mL,采用盐析法提取基因组 DNA。1.2.3!MLPA检测 5!取样品 DNA 20 500 ng,98#变 性 5 m in,与 MLPAP034/P035 探针 混合 物(P034/P035探针混合物和 MLPA
17、 buffer)60#杂交16 h以上,加入连接混合物(Ds H2O、连接缓冲液 A、连接缓冲液 B 和连接酶?65),54#连接 15 m in,98#变性 5m in灭活连接酶。取 5?L连接产物,在60#时加入 PCR混合物(FAM?引物、DNA聚合酶、酶溶解缓冲液和 Ds H2O),按试剂盒提供的条件行PCR,PCR 产物经 ABI310 测序仪进行片段分析(MLPAP034/P035试剂盒购自 MRC?HOLLAND 公司)。1.2.4!肌肉分子病理 6!对部分患者取腓肠肌进行开放性活检,所取组织经异戊烷预冷后在液氮中冰冻固定,冰冻切片,片厚 6?m,行常规组织学和酶组织化学染色,另
18、行特异抗体免疫组织化学染色。抗层粘连蛋白?2(la m inin?2,又称 merosin)单克隆抗体为 Che m icon公司产品,抗 dystrophin中央棒状区(Dys?C)、N?末端(Dys?N)、R?末端(Dys?R)单克隆抗体为 Novocastra公司产品。免疫组织化学染色采用 SP?9002过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒进行。1.2.5!随访!对临床确诊为 DMD/BMD的 90例患者进行至少 5个月(5月至 3年)的随访,随访内容主要包括运动能力的改变,CK水平,心电图及超声心动图的动态变化,糖皮质激素的治疗情况等。泼尼松的治疗剂量及方法采用 0.75 mg/(kg
19、 d),每月口服 10 d,停用 20 d 7。1.3!统计学分析采用 SPSS 14.0软件进行数据分析,计量资料用均数 标准差表示,计数资料用例数、百分数表示。对不同年龄患者的 CK水平比较采用 SNK?q检验,根据患者年龄分为 3组(1组年龄小于 4岁,2组年龄大于等于 4岁小于 9岁,3组年龄大于等于 9 662 北京大学学报(医学版)JOURNAL OF PEKI NG UN I VERSI TY(HEALTH SCIENCES)!Vo.l 42!No.6!Dec.2010岁)。对糖皮质激素的短期治疗效果分析采用卡方检验,以 P 0.05为差异具有统计学意义。2!结果2.1!临床表现
20、90例患者就诊年龄 0.5 21.0岁,平均为 7.2 4.2岁,11例有明确家族史,符合 X连锁隐性遗传。均隐匿起病,因出生后运动发育落后就诊 16例;肢体无力、走路姿势异常、上下楼梯困难 49例;仅 CK显著升高 25例。8例伴轻度智能减退。截止到随访日期,6例已丧失行走能力,丧失行走能力的年龄为 910岁。体格检查提示所有患者均有不同程度盆带肌及四肢近端为主的肌力减退,随着病情进展,四肢近端肌群有不同程度萎缩。就诊时 71例中膝腱反射减弱 53例,完全消失 18例,其中 15例伴严重关节挛缩;大部分可见腓肠肌假性肥大(仅 3例无肥大/饱满)。1例病程中出现急性脑梗塞(表 1)。表 1!D
21、MD/BMD患者临床表现、辅助检查(n)Table 1!Clinical and auxiliary examination of DMD/B MD patients(n)!DMDBMDM ental retardation62Family history(+)92V isit reason!Li mbs powerless3613!G row th backwards160!CK increasing232Patella tendon reflex!D efluxio145!D amp144!Elicit294E MG!Myogenic lesion434!Nor mal110G ower
22、design(+)178G astrocnem ius changement!Hypertrophy4513!Satiation90!Nor mal122.2!辅助检查2.2.1!血清肌酸激酶水平!所有患者血清 CK、LDH、AST、ALT 均有不同程度的增高,尤以 CK增高最显著。本组患者 CK为 2 667 21 460U/L(正常值 26 200U/L),其中 1例患儿(后证实为 DMD基因 44 52外显子缺失)于出生后 15 d检测 CK 即12 902U/L。1组 CK为(12 603.10 8 593.00)U/L,2组 CK为(12 217.36 8 956.98)U/L,3组
23、 CK为(6 544.45 6 643.10)U/L。1、2组 CK水平显著高于 3组(F总=4.587,P总=0.017,P1,3=0.005,P2,3=0.016)。2.2.2!肌电图检查!58例患者进行了肌电图检测,其中 54例提示肌源性损害,4例未见特征性改变。2.2.3!肌活检及免疫组织化学染色!25例进行了肌活检检查,24例为肌营养不良改变,1例表现为坏死性肌病。主要病理变化为肌纤维出现不同程度肥大、萎缩、坏死、再生以及间质脂肪、结缔组织增生。对 6例患者进行免疫组织化学染色可见肌膜下dystrophin蛋白表达减少,4例完全缺失(图 1),2例部分缺失。2.2.4!心脏改变!部分
24、患者行心电图和超声心动检查,检查年龄 2.5 7岁。行心电图检查的 40例中 7例显示 ST?T 段改变,2例示完全/不完全房室传导阻滞,4例分别有左心室高电压、左心室扩大及短P?R征,27例未见异常。行超声心动检查的 27例患者,2例提示二尖瓣/三尖瓣返流,1例有心房和心室肥厚,4例有不同程度心脏扩大,其中 2例为全心扩大,伴有心功能的减低,20例未见异常。2.3!MLPA基因突变检测对 90例患儿进行 DMD 基因突变检测,所有阳性结果均经重复验证。58例检测到外显子缺失,9例检测到外显子重复,23例未见异常(表 2)。58例外显子缺失的患者中,单个外显子缺失 9例(均经过该外显子直接测序
25、进一步验证非点突变);大片段缺失(多于 10个外显子)10例(图 2)。同时对 34例检测出基因缺失/重复的患者母亲进行检测(图2),17例(50.00%)为 DMD 基因突变携带者,均未见临床症状。1例先证者母亲再次怀孕后在北京大学第一医院进行产前诊断,经检测胎儿为女性携带者,突变区域与先证者及其母亲相同。Schwartz等 8报道表型为 DMD/BMD的散发男性病例,经基因诊断证实其中部分患者为 FKRP 基因突变导致的肢带型肌营养不良 2I型,因此我们针对未检测到异常的 23例(25.56%)患儿进一步进行 FKRP 基因编码序列的直接测序,未发现致病突变,与日本报道相似 9。2.4!随
26、访情况对所有患者要求在正规的康复中心康复师指导下进行康复训练。对于出现心脏扩大的患儿均给予 663 张艳芝,等!假肥大型进行性肌营养不良患者的基因型、表型分析及随访研究血管紧张素转换酶抑制剂类药物或联合使用 受体阻滞剂,另外辅以辅酶 Q10,1?6?二磷酸果糖等以改善心肌营养代谢及能量供应。对确诊为扩张型心肌病者,加用地高辛等。完成随访的 55例患者中,14例采用激素治疗,至少服用 3个月(6个月至 3年)且服用剂量及方法相同 7,8例病情无进展,其中 3例在服药 3个月后病情有所减轻,表现为 CK下降,肌力较服药前增加;6例病情仍有缓慢进展,表现为肌无力加重,运动能力降低,心脏扩大等。同期
27、41例未服药患者 22例病情无明显进展,19例病情进展,故短期随访发现激素对延缓病情进展尚未见明显效果(!2=0.051,P=0.821)。随访发现表型为 DMD者大多是由 DMD 基因框外突变所致,而表型为 BMD者则大多为框内缺失引起(表 2)。表 2!DMD/BMD基因检测结果及阅读框改变(n)Table 2!G enetic detection and reading framechangement of DMD/B MD(n)!DMDBMDG ene detection!D eletion4810!Duplication63!Nor mal194Reading frame chang
28、ement!In?frame113!Out?frame43103!讨论3.1!DMD/BMD临床特征DMD/BMD是常见的累及骨骼肌的致死性小儿神经肌肉病,呈 X连锁隐性遗传。DMD发病率高,患者一般在 20岁左右因心力衰竭/呼吸衰竭而死亡。患儿常于儿童期起病,由于起病隐匿,早期容易误诊,现总结本组病例的临床特征:(1)大多为散发病例,可有家族史,男性发病,女性携带;(2)起病隐匿,病情进展缓慢,患儿多在生后即存在肌肉病变的证据,婴幼儿期表现为独走迟缓,2 6岁出现症状,期间有一段平台期(即症状无变化),10岁左右失去行走能力;(3)典型临床表现:走路踮脚尖,步行鸭步态,上、下楼梯困难,蹲下、
29、站起困难,Gower征(+),以腓肠肌为主的肌肉假性肥大;以四肢近端肌、盆肌为主的肌力下降,膝腱反射减弱或消失(跟腱反射可保存多年),可伴有静止性智力低下;(4)辅助检查:血清肌酶升高,在早期和进展期显著增高,以 CK最为明显,可达到正常值的 50 100倍以上,以后逐渐下降;肌电图提示肌源性损害;肌活检显示肌纤维肥大、萎缩以及坏死和再生,随着病情的进展,结缔组织逐渐增多,免疫组化染色可见 dystro?phin蛋白完全或部分缺失;随着病情发展逐渐出现心功能的异常。本组病例中 3例患者未见腓肠肌肥大/饱满,但经基因检查确诊为 DMD/BMD,因此腓肠肌的肥大不能作为临床诊断的排除标准;进行肌电
30、图检查的58例患者中有 4例未见异常,可能与发病早期肌电图改变不明显等因素有关,但不能排除患者年龄小,不能配合及肌电图检测的误差等;随着病情的进展,CK水平有下降趋势,如小于 4岁组、大于等于 4岁小于 9岁组的 CK水平均明显高于大于等于 9岁组(P 0.05),这是随着病情进展,破坏的肌纤维被结缔组织及脂肪组织取代,运动能力逐渐丧失所致。尚未发现有 CK水平明显降低的患者,可能与部分患者随访时间相对较短有关。1例患儿(后证实为DMD基因 50 54外显子缺失)在 11个月时急性起病,肌无力,竖头困难,不能独坐,横纹肌溶解,经大剂量甲泼尼龙冲击及水化、碱化尿液治疗后病情明显恢复,但 CK持续
31、增高,肌活检提示大片的肌纤维坏死,免疫组织化学染色提示 dystrophin完全缺失。随着病情发展 DMD患者均会出现心肌损害,心电图可表现为窦性心动过速、完全性/不完全性左、右束支传导阻滞,左心室高电压、心室肥厚、部分导联 ST?T改变等,晚期可因心脏扩大、心力衰竭而危及生命 10。本组病例中心脏受累者少,与年龄尚小、病程短有关。激素短期治疗后虽部分早期患者肌力有所增加,运动能力有明显改善,但是统计数据未显示差异有统计学意义,因例数及疗程不够尚不能得出结论。病程长、症状重者服用激素的疗效低于病程短、症状轻者,提示激素在病程早期应用可以减轻症状,但对于处于疾病后期者不能延缓病情进展。激素为主的
32、综合治疗需要患儿家长的长期配合,2005年美国神经病学会和小儿神经病学会发布治疗指南,推荐DMD患者使用泼尼松 0.75 mg/(kg d)7,多项研究均认为长期激素治疗(至少 3年)可延长步行能力 2 5年,增强心肺功能,延长 DMD患者的寿命和改善生活质量 11。因此,国内有待开展多中心、长期的以激素治疗为主的综合规范治疗,另外,激素疗效与基因突变类型是否相关尚需积累更多的病例,进一步的随访研究。664 北京大学学报(医学版)JOURNAL OF PEKI NG UN I VERSI TY(HEALTH SCIENCES)!Vo.l 42!No.6!Dec.20103.2!MLPA检测 D
33、MD基因缺失/重复DMD/BMD是由 DMD 基因突变所致,DMD 基因的突变约有 1/3系新生突变;大部分突变为基因内缺失,在所有突变中,基因缺失占 55%65%,重复占 5%15%,点突变占 35%左右 3,12。本研究采用 MLPA技术对 90例临床诊断为 DMD/B MD的患者行基因检测,67例患者有不同程度的基因缺失/重复,检出率为 74.44%(67/90)。58例基因缺失的患者中,36例(62.08%,36/58)位于 45 54外显子,10例位于 2 20外显子(17.24%,10/58),7例为大片段缺失(12.07%,7/58),其余 5例为其他外显子的缺失,缺失主要集中在
34、中央热点区 45 54外显子。重复(9例)主要集中在 2 20外显子,与国内及日本文献报道接近 5,12。在 12例单个外显 665 张艳芝,等!假肥大型进行性肌营养不良患者的基因型、表型分析及随访研究子的缺失/重复中,9例为单个外显子缺失,其中 4例为 45外显子缺失;3例为单个外显子重复。同时对发现基因突变的 34例患者的母亲进行基因检测,发现有 17例(50.00%)为 DMD 突变携带者,且突变区域与先证者突变区域一致,由此可见,MLPA在DMD/BMD基因突变检测上较传统 PCR方法优越,不仅可以检测出基因缺失,也可以检测到基因重复,同时还可以准确地检出女性携带者。本组检测中携带者的
35、检出率稍低于文献报道,样本量小尚不能得出结论。1例未发现有基因的重复/缺失突变的患者在其他医院进行 DMD 基因测序分析,发现 67外显子的无义突变。在本组未发现基因重复/缺失的病例中有 4例有明确的家族史,临床表现与遗传方式符合 DMD。目前国内外学者通过变性高效液相色谱(denaturing high perfor mance liquid chromatogra?phy,DHPLC)分析结合测序技术对 DMD/B MD患者非缺失/重复突变的筛查取得了一定的进展 13-14。MLPA、DHPLC及直接测序技术等在 DMD 基因突变检测方面的应用将会为 DMD/BMD的基因诊断提供更多的信息
36、,从而更好地为临床诊断提供依据 15。3.3!基因型与表型的关系Dystrophin及其 相关 蛋 白复 合 体(dystrophyGAP?associated protein,DGC)将细胞外基质与细胞膜下骨架蛋白连接起来,在肌细胞膜内外构成了坚固的网架结构系统,在保护肌细胞膜结构完整、维持肌细胞正常收缩功能中起重要作用。一旦 dystro?phin缺失,DGC明显降低,肌细胞破坏,导致肌纤维坏死及肌肉组织纤维化,表现为假性肌肥大及肌萎缩。阅读框假说有助于区分 DMD/B MD,病情严重程度关键取决于这种突变是否会破坏阅读框结构 3,12。保持阅读框完整的突变(框内突变)表型为 BMD,而
37、DMD患者,基因突变通常破坏了阅读框,产生不稳定 RNA,截短的抗肌萎缩蛋白在肌肉中很快降解。本组 67例基因异常患者中符合阅读框假说者有 46例(68.66%,46/67,表 2)。进行肌活检的 6例患者临床表现与基因检测结果均提示为DMD,而肌肉免疫组化染色 4例提示 dystrophin完全缺失,2例部分缺失。我们推测临床表现严重程度不仅与阅读框的改变有关,还与基因突变位点所在功能结构域有关。由于本病目前尚无特效治疗方法,对于独走年龄延迟的男孩、仅有激酶升高而临床症状不典型的婴幼儿应坚持长期随访,做到早识别、早诊断。研究 DMD/B MD基因型与表型的关系,可以为揭示 DMD/B MD发
38、病的分子机制提供理论基础,有利于临床医师对肌萎缩综合征进行确诊,从而更好地为 DMD/BMD 患者提供遗传咨询和产前诊断。目前,国外对 DMD患者的治疗有很多进展,尤其是基于明确的基因诊断的基因治疗 16,因此,建立规范、系统的 DMD/BMD患者分子诊断流程,并在确切的分子诊断基础上开展进一步治疗迫在眉睫。参考文献 1 Bushby K,F inkelR,Bir nkrantDJ,et a.l D iagnosis andmanage?ment of Duchenne muscular dystrophy,part 1:diagnosis,andphar macological and ps
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