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1、 QTRAP质谱仪和 LightSight软件在药物杂质和降解产物分析的应用 解决方案解决方案 对降解产物进行结构鉴定是新药开发中必不可少的一部分。降解产物的结构信息有助于促进开发稳定性更好的新化合物，而且也利于设计更稳定的新剂型。目前 LC/UV 仍然是用于检测及定量降解产物的常用技术。然而，当在稳定性考察或应激反应中检测到未知降解产物时，LC/UV 技术则无法对其进行鉴定分析。因此，通常采用 LC/MS 手段来获得化合物的分子量信息，并通过 MS/MS 数据表征化学结构。在 LC/UV 方法中，通常采用不挥发性缓冲液（如磷酸盐缓冲液）作为流动相来分离感兴趣的降解产物。然而由于其对灵敏度和耐
2、用性产生比较大的影响而不适用于质谱仪上。在本文中，我们将展示一个降解产物的鉴定分析方案，该方案无需改动流动相条件，就能将标准的 LC/UV 实验方法移植到 LC-MS/MS平台上，并结合 LightSight软件简单快速地鉴定降解产物。实验内容实验内容 使用 LightSight软件和 4000 QTRAP质谱仪对奥美拉唑的酸性和碱性降解产物进行鉴定和表征。USP的标准 LC 方法采用磷酸缓冲盐流动相进行 LC/UV 分析。本实验将在不改变任何流动相条件的情况下将该方法转移到 4000 QTRAP系统上。通常，为了鉴定降解产物需要开发一个相对比较复杂的 LC/MS 方法。然而，如果 LC/MS
3、 和 LC/UV 分析采用同一 LC 方法，则可直接将由质谱分析所得降解产物的鉴定和确认结果与其 LC/UV 结果信息相关联，且不需要重新验证新的 LC 方法。样品前处理：酸降解：将 10 N 盐酸添加至奥美拉唑溶液中（奥美拉唑浓度 0.2 mg/mL，溶液为含 10 mM 硼酸钠，pH9.2 的水和乙腈的混合溶液（比例为 3:1）。5 分钟后，加入 10 N 的氢氧化钠中和该溶液。碱降解：将 10 N 的氢氧化钠加入到奥美拉唑溶液中（0.2 mg/mL）。15 min 后，加入 10 N 的盐酸中和该溶液。液相色谱条件：溶剂 A：乙腈；溶剂 B：含 1.5 mM 磷酸二氢钠，7.9 mM 磷
4、酸氢二钠，pH 值7.75 的水溶液；梯度：0-20 分钟维持 25A，20-25 分钟 25-60A，25-28 分钟维持 60A，28.01 分钟是 60-25A，28.1-35 分钟维持 25A；流速：0.8 mL/min；色谱柱：Zorbax Extend C18 4.6150 mm；仪器：Agilent 1100 自动进样器配二元液相泵；质谱条件：4000 QTRAP，ESI 正离子模式软件：LightSight软件，Analyst软件实验结果 LightSight软件：通过样品/对照品对比鉴定降解产物利用全扫描 MS 数据对降解产物进行鉴定通常需要采用手动对比，整个过程非常繁琐。由
5、于在总离子流谱图（TIC）中无法轻易确定色谱峰，所以必须采用降解产物的提取离子流图（XIC），通过比较样品和对照品的 XIC 图找出差异并对其进行鉴定。虽然这些差异可能是潜在的降解产物，但仍然需要通过查看质谱图和确认 MS/MS 信息的方式对其进行进一步的研究。当使用 磷酸盐缓冲溶液时，由于缓冲盐本身的干扰，使得分析工作变得更加繁琐复杂。整个分析过程可能需要数天时间，具体时间则取决于谱图的复杂性。但是，利用 LightSight软件，数分钟内即可完成降解产物的鉴定工作（见图 1）。在本项研究中，仅需 1 小时就能鉴定和确认其 14 个降解产物，而相同的工作手动完成则需要大约 20 小时，若采用
6、 LC/UV 方法，更是需要耗时几个星期来进行标准品合成。图 1.LightSight软件自动鉴定复杂混合物中未知降解产物。降解产物分析表 1 总结了利用 LightSight软件所鉴定的奥美拉唑在酸性、碱性条件下产生的主要降解产物。图 2 展示了一些降解产物的可能结构。本实验通过采用 LightSight软件比较奥美拉唑与降解产物的 MS/MS 数据，推测出可的降解产物结构。图 2.奥美拉唑降解产物的结构示意图 表 1.奥美拉唑在酸性和碱性条件下产生的主要降解产物列表 由于离子化抑制和干扰，磷酸盐缓冲液通常不能应用到质谱仪上。但是 Turbo V源的强耐用性设计允许使用不挥发性缓冲溶液，并且
7、不用担心分析降解产物的过程中会损失灵敏度。虽然有时候灵敏度会有一定的降低，但是灵敏度会达到一个比较稳定的状态。为了突出这一点，在长达 8 个小时的连续采样过 程的开始和结尾阶段分别进样分析酸降解样品。实验结果表明，即使仪器接口和离子源均被磷酸钠所覆盖，灵敏度也没有受到损失（图 3 和表 2）。图 3.在磷酸盐缓冲液作为流动相的环境下，开始采集的数据与持续采集 8 小时后的数据灵敏度对比（m/z 298 的 XIC 图）表 2.在磷酸盐缓冲液作为流动相的环境下，开始采集的数据与持续采集 8 小时后 m/z 298峰面积和峰高的对比（图 3）总结总结 LightSight软件的设计呈现了一个简单，
8、清晰的工作流程，其能有效地支持代谢研究者们从事代谢物的鉴定工作。虽然代谢物研究是其主要工作流程，但出色的样品与对照品的对比功能使 LightSight软件适合任何类型的差异分析工作；其中降解物和杂质的分析研究就是最好的例子。传统的手动数据处理过程不仅枯燥乏味、冗长耗时，并且还需要面对由磷酸盐缓冲液干扰所造成的额外麻烦。LightSight软件使得从峰浏览到获得 MS/MS 数据来鉴定降解产物的整个过程更加高效。得益于皮实耐用的 Turbo V离子源技术，LC-MS/MS 方法可以在整个研究过程中使用不挥发性缓冲液，而不用担心损失系统性能。参考文献参考文献 1.Wu,Y.,The use of liquid chromatography-mass spectrometry for the identification of drug degradation products in pharmaceutical formulations.Biomed.Chrom.,14,384-396(2000).2.Rossi,D.T.and Sinz,M.W.,Mass Spectrometry In Drug Discovery,Marcel Dekker Inc.,New York,2002,p 130.