《实验四血清球蛋白的提纯幻灯片.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验四血清球蛋白的提纯幻灯片.ppt（25页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、实验四血清球蛋白的提纯第1页，共25页，编辑于2022年，星期五第三次实验报告总结实验报告包括实验目的、原理、操作、结果、结论与讨论实验目的、原理、操作、结果、结论与讨论五部分。原理写得不完整。电泳及影响因素；血清中蛋白质主要有5种，由于蛋白质具有两性解离，在pH=8.6缓冲溶液中，各蛋白质带负电荷，在电泳中向正极移动；血清中各种蛋白质等电点和分子量不同，在同一电泳过程中运动速度不同而分离；血清蛋白质能与氨基黑10B特异性结合而显现出蓝色，并将各条带剪下溶解于碱性溶液中，测定吸光度值则可以计算各蛋白相对含量。实验结论与讨论（不要自问自答，不要分1、2、3.，不要重复原理，不要写思考题，不要写注
2、意事项）给出结论给出结论（注意样品是兔血清，与人血清比较的话，需要说明人和兔血清含量可能有所差异。需要说明人和兔血清含量可能有所差异。）结合结果分析结合结果分析（1.膜条上各条带分离好不好？什么原因造成的？2.结果中各蛋白质百分含量，说明哪些原因可能会造成各蛋白百分含量偏离正常值？）错别字太多。错别字太多。第2页，共25页，编辑于2022年，星期五请同学们清洗自己小组以下用品每个小组：每个小组：层析柱（层析柱（1支）支）比色板（比色板（2块）块）玻璃棒（玻璃棒（1支）支）离心管离心管（1支）支）滴管滴管 （2支）支）烧杯烧杯 （2个）个）试管试管 （13支）支）注意实验过程中每用一次清洗一次！
3、第3页，共25页，编辑于2022年，星期五问题1.血清蛋白质的分类？血清蛋白质的分类？清蛋白、清蛋白、1球蛋白、球蛋白、2球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白球蛋白2.分离纯化蛋白质的方法？分离纯化蛋白质的方法？电泳、透析及超滤、有机溶剂沉淀、盐析、免疫沉淀、层析、超速离心法等电泳、透析及超滤、有机溶剂沉淀、盐析、免疫沉淀、层析、超速离心法等3.盐析？层析？透析？盐析？层析？透析？加入中性盐破坏蛋白质稳定因素而使其沉淀（加入中性盐破坏蛋白质稳定因素而使其沉淀（水化膜和电荷层水化膜和电荷层）利用各组分理化性质不同而分离（本实验是利用利用各组分理化性质不同而分离（本实验是利用组分分子大小不同组分
4、分子大小不同而分离）而分离）半透膜把大小分子分开半透膜把大小分子分开4.本实验盐析所用硫酸铵饱和度是多少？本实验盐析所用硫酸铵饱和度是多少？33%5.定性检测蛋白质和铵根离子的方法？定性检测蛋白质和铵根离子的方法？缩二脲反应（紫红色）缩二脲反应（紫红色）或者或者 与磺柳酸反应生成白色沉淀与磺柳酸反应生成白色沉淀 纳氏试剂（黄色或棕色）纳氏试剂（黄色或棕色）第4页，共25页，编辑于2022年，星期五一.实验目的 1.1.掌握蛋白质分离纯化方法；掌握蛋白质分离纯化方法；2.2.掌握盐析、凝胶层析、透析法分离纯化蛋白质掌握盐析、凝胶层析、透析法分离纯化蛋白质 的基本原理；的基本原理；3.3.熟悉离心
5、机的操作；熟悉离心机的操作；4.4.熟悉蛋白质、熟悉蛋白质、NH4+NH4+定性检测的方法。定性检测的方法。第5页，共25页，编辑于2022年，星期五分离纯化蛋白质的方法分离纯化蛋白质的方法沉淀法沉淀法盐析法盐析法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法层析法层析法电学法电学法电泳法电泳法等电聚焦等电聚焦离子交换层析离子交换层析吸附层析吸附层析凝胶过滤（分子筛）凝胶过滤（分子筛）亲和层析亲和层析离心离心膜分离技术膜分离技术透析透析超滤超滤第6页，共25页，编辑于2022年，星期五二.实验原理 本实验是应用相同浓度的硫酸铵反复盐析分离血本实验是应用相同浓度的硫酸铵反复盐析分离血清中的清中的-球蛋白，再利用凝
6、胶层析法除盐，即可球蛋白，再利用凝胶层析法除盐，即可得到比较纯的得到比较纯的-球蛋白。球蛋白。采用盐析法分离清蛋白（主要是清蛋白），再用采用盐析法分离清蛋白（主要是清蛋白），再用透析方法除去小分子物质。透析方法除去小分子物质。第7页，共25页，编辑于2022年，星期五二.实验原理（一）盐析（salting-out）定义：定义：加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳定因素并加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳定因素并使其从溶液中沉淀析出的现象。使其从溶液中沉淀析出的现象。原理原理:破坏蛋白质两个稳定因素：破坏蛋白质两个稳定因素：水化膜和电荷层水化膜和电荷层中性盐：中性盐：(NH(NH4 4)2 2SOSO4
7、4、NaNa2 2SOSO4 4、NaClNaCl等。等。优点：优点：蛋白质不变性，常用方法。蛋白质不变性，常用方法。第8页，共25页，编辑于2022年，星期五二.实验原理（二）透析（dialysis）定义：定义：利用半透膜把大小分子分开。利用半透膜把大小分子分开。利用半透膜把大小分子分开。利用半透膜把大小分子分开。透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。物质不能通过半透膜的性质，达到分
8、离的方法。物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。其利用半透膜原理，通过扩散、对流体内各种有害以及多余其利用半透膜原理，通过扩散、对流体内各种有害以及多余其利用半透膜原理，通过扩散、对流体内各种有害以及多余其利用半透膜原理，通过扩散、对流体内各种有害以及多余的代谢废物和过多的电解质移出体外，达到的代谢废物和过多的电解质移出体外，达到的代谢废物和过多的电解质移出体外，达到的代谢废物和过多的电解质移出体外，达到净化血液净化血液净化血液净化血液的目的，的目的，的目的，的目的，并且达到纠正水电解质并且达到纠正水电解质并且达到纠正水电解质并且达到纠正水电解质及
9、酸碱平衡的目的。及酸碱平衡的目的。及酸碱平衡的目的。及酸碱平衡的目的。临床应用：临床应用：血液透析血液透析 第9页，共25页，编辑于2022年，星期五二.实验原理（三）层析（chromatography）层析技术层析技术是利用混合物中各组分是利用混合物中各组分物理化学性质物理化学性质（如（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的差别，使各组分在支持物上集中分布分配系数等）的差别，使各组分在支持物上集中分布在不同区域，借此将各组分分离在不同区域，借此将各组分分离。按层析的原理不同可以分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层
10、析凝胶层析和亲和层析。（教程P25）凝胶是一类具有三维空间多孔网状结构的物质（分子大小不同）小分子进入凝胶颗粒的微孔中，流程长，下移速度慢流程长，下移速度慢；大分子不能进入凝胶颗粒的微孔中去，只能分布在颗粒的间隙中，所以流程短，向下流程短，向下移动速度快移动速度快。第10页，共25页，编辑于2022年，星期五二.实验原理凝胶层析法（凝胶层析法（根据分子大小差异而分离根据分子大小差异而分离）第11页，共25页，编辑于2022年，星期五二.实验原理（四）离心（centrifuge）离心技术离心技术是利用是利用离心力，离心力，依据物质的依据物质的沉降系数、沉降系数、扩散系数和浮力密度差异扩散系数和浮
11、力密度差异而进行物质的分离、浓而进行物质的分离、浓缩和分析的一种技术。缩和分析的一种技术。第12页，共25页，编辑于2022年，星期五二.实验原理离心操作要领离心操作要领1 1、根据待离心的溶液性质及体积、根据待离心的溶液性质及体积选择合适的离心管选择合适的离心管。装载液体时要。装载液体时要按各种离心机操作说明进行。无盖离心管不能装的太满。密封按各种离心机操作说明进行。无盖离心管不能装的太满。密封的或有盖离心管常要求装满，以免离心管变形。的或有盖离心管常要求装满，以免离心管变形。2 2、检查离心管套筒、检查离心管套筒是否完好是否完好、套筒内有没有、套筒内有没有软胶垫或棉花软胶垫或棉花。3 3、
12、精确地平衡离心管及其内容物（配平）。、精确地平衡离心管及其内容物（配平）。4 4、平衡后的离心管和内容物（包括套筒）应、平衡后的离心管和内容物（包括套筒）应对称放置对称放置。5 5、启动离心时离心速度、启动离心时离心速度由慢到快由慢到快。第13页，共25页，编辑于2022年，星期五二.实验原理（五）检测蛋白质、NH4+的方法检测蛋白质检测蛋白质 缩二脲试剂：溶液显缩二脲试剂：溶液显紫红色紫红色 20 20磺柳酸磺柳酸 ：有白色沉淀产生：有白色沉淀产生检测检测NHNH4 4+纳氏试剂：纳氏试剂：黄色或棕色黄色或棕色第14页，共25页，编辑于2022年，星期五三.实验操作 1 1、盐、盐 析析 2
13、 2、透、透 析析 3 3、层、层 析（脱盐）析（脱盐）4 4、检、检 测测第15页，共25页，编辑于2022年，星期五1、盐析取离心管一支加入血清取离心管一支加入血清2ml加入加入2ml PBS，摇匀摇匀逐滴加入逐滴加入pH7.2饱和饱和(NH4)2SO4 2ml,摇匀摇匀上清液（主要含清蛋白）上清液（主要含清蛋白）倾入试管中倾入试管中静置静置10分钟，再离心（分钟，再离心（2000转转/分）分）10分钟分钟沉淀用沉淀用1ml PBS搅拌溶解搅拌溶解逐滴加逐滴加饱和饱和(NH4)2SO4 0.5ml,摇匀摇匀倾弃上清液（主要含倾弃上清液（主要含、球蛋白）球蛋白）沉淀即为初步纯化的沉淀即为初步
14、纯化的球蛋白球蛋白透透 析析脱脱 盐盐静置静置10分钟，再离心（分钟，再离心（2000转转/分）分）10分钟分钟用于配平用于配平用于配平用于配平样品为猪血清样品为猪血清第16页，共25页，编辑于2022年，星期五2、透析清蛋白清蛋白 换换 水水透析袋刚放入水中时透析袋刚放入水中时,立即取立即取袋外液体检查有无袋外液体检查有无NH4；每隔每隔4分钟检查一次，共分钟检查一次，共3次，次，比较比较NH4透出的情况。透出的情况。约约0.5小时，检查袋外液体的小时，检查袋外液体的NH4情况；情况；取袋外液取袋外液2滴，置于小试管中，然后滴滴，置于小试管中，然后滴加加20磺柳酸磺柳酸12滴，观察有无沉淀产
15、生。滴，观察有无沉淀产生。水水 水水 第17页，共25页，编辑于2022年，星期五3、层析 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10上样上样球蛋白，球蛋白，PBS PBS 1010滴滴溶解溶解 装柱装柱 装柱前用装柱前用滤纸片滤纸片堵住层析堵住层析柱下口，防止下端玻纱堵塞柱下口，防止下端玻纱堵塞葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G25，柱，柱 高高3/42/3柱长柱长流速：每分钟流速：每分钟10滴左右滴左右 加入洗脱剂加入洗脱剂PBS 10ml 收集收集20滴换一滴换一支试管支试管第18页，共25页，编辑于2022年，星期五 层析后洗脱液检测层析后洗脱液检测每组两块比色板每组两块比色板,洗净备用。洗净备用。
16、一块在各孔滴加纳氏试剂（检测一块在各孔滴加纳氏试剂（检测NHNH4 4+）,另一块滴加缩二脲试剂（检另一块滴加缩二脲试剂（检测蛋白质）测蛋白质）。若发现有显色反应此孔显色剂弃用。若发现有显色反应此孔显色剂弃用。检测蛋白及铵根离子不用滴管检测蛋白及铵根离子不用滴管,避免污染避免污染,直接用试管倾倒直接用试管倾倒。用用“-”表示无现象，用表示无现象，用“+”,“+”,“+”等表示颜色深等表示颜色深浅浅。回收凝胶回收凝胶第19页，共25页，编辑于2022年，星期五四.实验结果(用+-号表示，不写颜色)表表1.层析后洗脱液的显色结果层析后洗脱液的显色结果表表2.透析后的袋外溶液显色结果透析后的袋外溶液
17、显色结果试管编号试管编号12345678910缩二脲试剂缩二脲试剂检测后现象检测后现象纳氏试剂检纳氏试剂检测后现象测后现象检测次数检测次数123456试试 剂剂纳氏试剂纳氏试剂纳氏试剂纳氏试剂纳氏试剂纳氏试剂纳氏试剂纳氏试剂纳氏试剂纳氏试剂20%磺柳酸磺柳酸现现 象象检测人：检测人：时间：时间：检测人：检测人：时间：时间：第20页，共25页，编辑于2022年，星期五五.注意事项.正确使用正确使用离心机离心机。.装柱时检查层析柱下端是否有装柱时检查层析柱下端是否有滤纸片，是否漏水滤纸片，是否漏水。.装柱后凝胶装柱后凝胶均一、无断层，无气泡，柱床面平整均一、无断层，无气泡，柱床面平整。.柱床面保持
18、有缓冲液柱床面保持有缓冲液。.层析加样时动作缓慢轻柔，层析加样时动作缓慢轻柔，不要破坏柱床面的平整不要破坏柱床面的平整。.每用一次滴管，请用水清洗干净，防止试剂及被测样每用一次滴管，请用水清洗干净，防止试剂及被测样品交叉污染品交叉污染。7.7.两人一组，分工协作。两人一组，分工协作。第21页，共25页，编辑于2022年，星期五思考1.1.为什么硫酸铵能够使蛋白质沉淀？为什么硫酸铵能够使蛋白质沉淀？2.2.本实验盐析所用盐的饱和度是多少？本实验盐析所用盐的饱和度是多少？为什么能够沉淀为什么能够沉淀-球蛋白？球蛋白？3.3.如何证明分离纯化的样品是何种蛋白质？如何证明分离纯化的样品是何种蛋白质？4
19、.4.两步盐析之后，沉淀中含有哪些物质？两步盐析之后，沉淀中含有哪些物质？5.5.层析结果好坏的判断标准是什么？层析结果好坏的判断标准是什么？6.6.透析时，烧杯中出现蛋白质说明什么问题？透析时，烧杯中出现蛋白质说明什么问题？第22页，共25页，编辑于2022年，星期五 预习实验五实验五 细胞核的分离与核酸的鉴定细胞核的分离与核酸的鉴定1.核酸的基本组成核酸的基本组成2.DNA和和RNA结构及分布区域结构及分布区域3.核酸理化性质核酸理化性质4.实验原理及操作实验原理及操作5.实验中采用了几种离心方法实验中采用了几种离心方法第23页，共25页，编辑于2022年，星期五教学大纲一 教学目的 学习综合利用盐析、凝胶层析、透析等多种实验 技术对蛋白质进行分离纯化的方法。二 教学要求 （一）掌握盐析、凝胶层析、透析法分离纯化蛋白质的基本原理。（二）熟悉实验操作及注意事项，蛋白质及NH4定性检测的几种方法。第24页，共25页，编辑于2022年，星期五蛋白质稳定因素蛋白质稳定因素水化膜水化膜电荷层电荷层水化膜水化膜电荷层电荷层水化膜水化膜中性盐（中性盐（(NH4)2SO4）第25页，共25页，编辑于2022年，星期五