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1、实验四福林酚试剂法测定血清总蛋白第1页，共27页，编辑于2022年，星期五n 学习测定蛋白质浓度的测定方法学习测定蛋白质浓度的测定方法n 学习绘制标准曲线及用标准曲线求待学习绘制标准曲线及用标准曲线求待测物质含量的方法测物质含量的方法实验目的实验目的第2页，共27页，编辑于2022年，星期五蛋白质浓度测定蛋白质浓度测定u双缩脲法双缩脲法u微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法uFolin-Folin-酚试剂法酚试剂法u 紫外吸收法紫外吸收法实验原理实验原理 第3页，共27页，编辑于2022年，星期五双缩脲反应：双缩脲反应：在碱性条件下，双缩在碱性条件下，双缩脲可与铜离子结合生成脲可与铜离子结合生成紫紫红
2、色化合物红色化合物。双缩脲法测定蛋白质双缩脲法测定蛋白质H2N-CO-NH2+NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 NH3双缩脲双缩脲第4页，共27页，编辑于2022年，星期五 具有两个或两个以上具有两个或两个以上肽键肽键的化合物皆有双缩脲反的化合物皆有双缩脲反应，颜色深浅与其浓度成正比，可用比色法进行测定。应，颜色深浅与其浓度成正比，可用比色法进行测定。本法操作简单，重复性好，干扰物质少。但缺本法操作简单，重复性好，干扰物质少。但缺点是灵敏度较低点是灵敏度较低 测定蛋白质范围为测定蛋白质范围为1-10mg1-10mg第5页，共27页，编辑于2022年，星期五微量凯氏定氮法微
3、量凯氏定氮法 含氮化合物与浓硫酸共热分解产生氨，氨与硫酸反应生成含氮化合物与浓硫酸共热分解产生氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。硫酸铵在强碱作用下分解生成氨；用水蒸汽蒸馏法硫酸铵。硫酸铵在强碱作用下分解生成氨；用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，所将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，所用无机酸的量相当于被测样品中氨的量，从而可计算样品的用无机酸的量相当于被测样品中氨的量，从而可计算样品的含氮量。含氮量。蛋白质含氮量通常在蛋白质含氮量通常在16%16%左右，将测得的含氮量乘左右，将测得的含氮量乘上上6.256.25，便得到该样品的蛋白质含量。，便得到该样品的蛋
4、白质含量。第6页，共27页，编辑于2022年，星期五 FolinFolin酚试剂法酚试剂法(Lowry(Lowry法法)Step 1Step 1碱性条件下蛋碱性条件下蛋白质与铜作用白质与铜作用生成蛋白质生成蛋白质铜复合物铜复合物蛋白质铜蛋白质铜复合物使磷复合物使磷钨酸钨酸磷钼酸磷钼酸还原还原蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可使酚试剂中的蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可使酚试剂中的磷钨酸磷钨酸 磷钼酸磷钼酸还原而呈蓝色还原而呈蓝色显色反应显色反应(蓝色蓝色)。在一定条件下，蓝色强度。在一定条件下，蓝色强度(A A660660)与蛋白质的量成正比例与蛋白质的量成正比例Step 2Step 2第7页，共27页
5、，编辑于2022年，星期五u 优优 点点:u 缺缺 点点:操作简便灵敏度高操作简便灵敏度高有蛋白质特异性的影响；有蛋白质特异性的影响；受多种因素干扰受多种因素干扰可检测的最低蛋白质量达可检测的最低蛋白质量达5 5 g/ml，通常测定范，通常测定范围是围是25-250 25-250 g/ml 第8页，共27页，编辑于2022年，星期五干扰物质干扰物质干扰物质干扰物质蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖TrisTris缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液硫酸胺硫酸胺硫酸胺硫酸胺酚类酚类酚类酚类尿素尿素尿素尿素柠檬酸柠檬酸柠檬酸柠檬酸胍胍胍胍硫酸钠硫酸钠硫酸钠硫酸钠三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸三氯乙酸乙醇乙醇乙醇乙醇丙酮丙酮丙酮丙酮C
6、HAPSCHAPSEDTAEDTAEGTAEGTAHEPESHEPESTriton X-100Triton X-100dithiothreitoldithiothreitol第9页，共27页，编辑于2022年，星期五实验器材与试剂实验器材与试剂 大试管、刻度吸量管、恒温水浴箱大试管、刻度吸量管、恒温水浴箱 722E型分光光度计型分光光度计 试剂甲，试剂乙试剂甲，试剂乙 标准蛋白溶液（标准蛋白溶液（250g/ml）待测血清（稀释待测血清（稀释500倍）倍）第10页，共27页，编辑于2022年，星期五空白空白(1)(1)(2)(2)(3)(3)(4)(4)(5)(5)(6)(6)待测管待测管 （7
7、 7）标准蛋白溶液标准蛋白溶液(250(250 g/ml)g/ml)-0.20.20.40.40.60.60.80.81.01.0待测血清待测血清1.01.0蒸馏水蒸馏水1.01.00.80.80.60.60.40.40.20.20 0-试剂甲试剂甲3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0 取取7 7支洁净试管，按下表加入试剂支洁净试管，按下表加入试剂 实验步骤实验步骤第11页，共27页，编辑于2022年，星期五 混匀后室温放置混匀后室温放置2020分钟分钟在各试管中分别加入试剂乙在各试管中分别加入试剂乙0.3mL0.3mL3030分钟后以空白管为对
8、照测其吸光值分钟后以空白管为对照测其吸光值(660nm660nm)立即摇匀立即摇匀第12页，共27页，编辑于2022年，星期五l 标准曲线法标准曲线法l 标准管对照法标准管对照法 计算及绘制标准曲线计算及绘制标准曲线第13页，共27页，编辑于2022年，星期五u 朗伯比尔定律：朗伯比尔定律：A=c l：摩尔吸光系数：摩尔吸光系数 c：溶液的浓度：溶液的浓度 l：液层的厚度：液层的厚度 A：物质的吸光度：物质的吸光度 当某单色光通过溶液时，其能量就会被当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于比色原
9、理度有一定的比例关系，也即符合于比色原理-朗伯朗伯-比耳比耳定律定律 第14页，共27页，编辑于2022年，星期五l 标准曲线法标准曲线法 在分光光度计测定范围内，配制一系列已知不在分光光度计测定范围内，配制一系列已知不同浓度的标准溶液，在特定波长条件下分别测出其同浓度的标准溶液，在特定波长条件下分别测出其吸光度值。吸光度值。以以吸光度值吸光度值为纵坐标，为纵坐标，相应的溶液浓度相应的溶液浓度为为横坐标在坐标纸上作出一条吸光度与浓度成正比，横坐标在坐标纸上作出一条吸光度与浓度成正比，并且通过原点的直线，即并且通过原点的直线，即标准曲线标准曲线，也称，也称C-AC-A曲线曲线第15页，共27页，
10、编辑于2022年，星期五C CA A标标准准曲曲线线C CX XA AX X C CX X为根据待测样品的吸光值查标准曲线所得的蛋白质为根据待测样品的吸光值查标准曲线所得的蛋白质浓度浓度0C C2 2C C3 3C C4 4C C5 5C C6 6A A2 2A A3 3A A4 4A A5 5A A6 6第16页，共27页，编辑于2022年，星期五在图上查出待测管的浓度后，按下列公式进行计在图上查出待测管的浓度后，按下列公式进行计算：算：待测血清蛋白含量待测血清蛋白含量=C7 74.34.31（g/L）500500M7 7（g g）50010001000或者或者=第17页，共27页，编辑于2
11、022年，星期五注意事项注意事项 作一条标准曲线至少要作一条标准曲线至少要5 5个点个点 被测物与标准物应在相同条件下测定被测物与标准物应在相同条件下测定 标准曲线中标准物浓度有一定的线性范围，应使标标准曲线中标准物浓度有一定的线性范围，应使标准曲线范围在被测物质浓度的准曲线范围在被测物质浓度的1/21/22 2倍之间，并使吸倍之间，并使吸光度在光度在0.050.051.01.0范围为宜范围为宜第18页，共27页，编辑于2022年，星期五待测血清蛋白含量待测血清蛋白含量=A A待测待测待测待测A A标准标准标准标准 C标准标准标准标准500500V标准标准标准标准V V待测待测（g/L）注：注
12、：V V标准标准为标准管加入标准蛋白质的体积为标准管加入标准蛋白质的体积 V待测待测为待测管加入的待测血清的体积为待测管加入的待测血清的体积 选一管与待测管吸光度相近的作为标准管，选一管与待测管吸光度相近的作为标准管，根据公式计算：根据公式计算：l 标准管对照法标准管对照法第19页，共27页，编辑于2022年，星期五标准管标准管待测管待测管实验结果实验结果第20页，共27页，编辑于2022年，星期五管号管号1234567OD660nm00.1210.2500.3350.4400.5250.320MXAXM7 7（g g）50010001000C血清血清血清血清=149（g）=7474.5（g/
13、Lg/L）第21页，共27页，编辑于2022年，星期五管号管号1234567OD660nm00.1210.2500.3350.4400.5250.320C血清血清血清血清=人血清中蛋白质的正常范围为人血清中蛋白质的正常范围为60-80g/L60-80g/L0.3200.3200.335 0.250.60.61 1A待测待测待测待测A A标准标准标准标准 C标准标准标准标准500500V V标准标准V V待测待测=71.6 g/L第22页，共27页，编辑于2022年，星期五 标准曲线法比标准管法精确，可消除各标准曲线法比标准管法精确，可消除各种原因引起的偏离吸收定律而造成的误差，种原因引起的偏离
14、吸收定律而造成的误差，但是制作比较费时。但是制作比较费时。临床应用：临床应用：可用于成批样品的测定，简便省时可用于成批样品的测定，简便省时第23页，共27页，编辑于2022年，星期五 血清总蛋白含量关系到血液与组织间水分血清总蛋白含量关系到血液与组织间水分的分布情况，在机体脱水的情况下，血清总蛋的分布情况，在机体脱水的情况下，血清总蛋白质含量升高，而在机体发生水肿时，血清蛋白质含量升高，而在机体发生水肿时，血清蛋白含量下降，所以测定血清蛋白质含量具有临白含量下降，所以测定血清蛋白质含量具有临床意义。床意义。临床意义：临床意义：第24页，共27页，编辑于2022年，星期五思考题思考题u 什么叫标准曲线？什么叫标准曲线？u 绘制标准曲线有何实用意义？绘制标准曲线有何实用意义？第25页，共27页，编辑于2022年，星期五 实验项目实验项目 实验原理实验原理 试剂和器材试剂和器材 操作方法（主要步骤）操作方法（主要步骤）结果分析结果分析 思考题思考题请按时交实验报告！第26页，共27页，编辑于2022年，星期五实验五实验五 酶法测血清葡萄糖酶法测血清葡萄糖预预 习习第27页，共27页，编辑于2022年，星期五