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1、实验八感受态细胞的制实验八感受态细胞的制备与转化备与转化第1页，共23页，编辑于2022年，星期五实验目的1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。3.学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。第2页，共23页，编辑于2022年，星期五实验原理l转化(Transformation)是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。第3页，共23页，编辑于2022年，星期五转化中的受体细胞转化中的受体细胞l转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的
2、变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用RM符号表示。第4页，共23页，编辑于2022年，星期五l转化方法：电击法、CaCl2、RuCl等化学试剂法l感受态细胞：的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过时细胞的状态。l转化细胞(转化子)：带有异源DNA分子的受体细胞(Transformant)。实验原理第5页，共23页，编辑于2022年，星期五实验原理实验原理l本实验以 E.coli DH5 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗
3、氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。第6页，共23页，编辑于2022年，星期五抗Amp宿主细菌宿主细菌含含Amp培养基培养基第7页，共23页，编辑于2022年，星期五影响转化率的因素影响转化率的因素 l细胞生长状态和密度。l转化的质粒DNA的质量和浓度。l试剂的质量。l防止杂菌和其它外源DNA的污染。第8页，共23页，编辑于2022年，星期五实验仪器 第9页，共23页，编辑于2022年，星期五超净工作台超净工作台第10页，共23页，编辑于2022年
4、，星期五台式高速冷冻离心机台式高速冷冻离心机第11页，共23页，编辑于2022年，星期五恒温空气摇床恒温空气摇床第12页，共23页，编辑于2022年，星期五恒温培养箱培养皿第13页，共23页，编辑于2022年，星期五实验试剂v大肠杆菌DH5vLB培养基，v0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）v氨苄青霉素vpUC18质粒第14页，共23页，编辑于2022年，星期五实验步骤实验步骤菌株活化感受态细胞制备外源DNA的转化第15页，共23页，编辑于2022年，星期五实验步骤 菌株活化1.用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5，在LB培养基平板表面划线，于37培养16小时2.挑取一个单菌落，转到35mlL
5、B培养基中，于37培养35小时3.将培养液全部转到100mlLB培养基中培养23小时，到OD6000.30.4第16页，共23页，编辑于2022年，星期五实验步骤 感受态细胞制备4.将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置1530min5.4000rpm离心5min,弃上清6.加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min7.4000rpm离心5min,弃上清8.加入0.2ml预冷的0.1mol/lCaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15的甘油可70长期保存第17页，共23页，编辑于2022年，星期五实验步骤 转化l取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞
6、中，于冰上放置30minl于42水浴90Sl冰上放置2minl加入800lLB液体培养基于37培养1小时l将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上l将平板放置于37恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果第18页，共23页，编辑于2022年，星期五对照组对照组 对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5l 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。第19页，共23页，编辑于2022年，星期五转化率转化率统计每个培养皿中的菌落数。转
7、化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数菌落数稀释倍数转化反应原液总体积涂板菌液体积 转化频率（转化子数每mg质粒DNA）转化子总数质粒DNA加入量(mg)感受态细胞总数对照组菌落数稀释倍数菌液总体积涂板菌液体积 感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数 第20页，共23页，编辑于2022年，星期五实验结果第21页，共23页，编辑于2022年，星期五实验报告实验报告l写明实验目的、实验原理、仪器、材料与试剂l详细列出实验步骤；l画出实验结果的示意图并做分析，计算转化效率。第22页，共23页，编辑于2022年，星期五1.在制备感受态细胞的实验中要注意哪些在制备感受态细胞的实验中要注意哪些 细节？细节？2.影响感受态细胞转化效率的因素有哪些？影响感受态细胞转化效率的因素有哪些？思考题思考题 第23页，共23页，编辑于2022年，星期五