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1、实验八实验八 大肠杆菌感受态细胞的大肠杆菌感受态细胞的制备与转化制备与转化实验目的1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。 实验原理l转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。 转化中的受体细胞转化中的受体细胞l 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用 RM 符号表示。 l转化方法：电击法、
2、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法l感受态细胞：的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。l转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。 实验原理实验原理实验原理l本实验以 E.coli DH5 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。 pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细
3、胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。 影响转化率的因素影响转化率的因素 l细胞生长状态和密度。 l转化的质粒 DNA 的质量和浓度。 l试剂的质量。 l防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。 实验仪器 台式高速冷冻离心机台式高速冷冻离心机恒温培养箱培养皿实验试剂v 大肠杆菌DH5v LB培养基，v 0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）v 氨苄青霉素v pUC18质粒 实验步骤实验步骤 菌株活化 感受态细胞制备 外源DNA的转化实验步骤 菌株活化1.用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5，在LB培养基平板表面划线，于37培养16小时2.挑取一个单菌落，转到35ml LB培养基中，于37培养35小时3
4、.将培养液全部转到100ml LB培养基中培养23小时，到OD6000.30.4实验步骤 感受态细胞制备4.将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置1530min5.4000rpm离心5min,弃上清6.加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min7.4000rpm离心5 min,弃上清8.加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15的甘油 可70长期保存实验步骤 转化l 取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30minl 于42水浴90Sl冰上放置2minl加入800l LB液体培养基于37培养1小时l
5、将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上l将平板放置于37恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果对照组对照组 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5l 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。转化率转化率统计每个培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化子总数菌落数稀释倍数转化反应原液总体积涂板菌液体积 转化频率（转化子数每mg质粒DNA）转化子总数质粒DNA加入量(mg) 感受态细胞总数对照组菌落数稀释倍数菌液总体积涂板菌液体积 感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数 实验结果实验报告实验报告l写明实验目的、实验原理、仪器、材料与试剂l详细列出实验步骤；l画出实验结果的示意图并做分析，计算转化效率。1. 在制备感受态细胞的实验中要注意哪些在制备感受态细胞的实验中要注意哪些 细节？细节？2. 影响感受态细胞转化效率的因素有哪些？影响感受态细胞转化效率的因素有哪些？思考题思考题