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1、第十一章第十一章 工业微生物菌种复壮与保藏工业微生物菌种复壮与保藏第一节 菌种的退化与复壮第二节 工业微生物菌种的保藏退化的自发性：微生物菌种在传代繁殖中受环境条退化的自发性：微生物菌种在传代繁殖中受环境条件的影响，多数情况下会出现退化。退化不是突然件的影响，多数情况下会出现退化。退化不是突然发生的，而是从量变到质变的逐步演变的过程。发生的，而是从量变到质变的逐步演变的过程。退化的可延缓性：要求菌种永远不退化是不可能的，退化的可延缓性：要求菌种永远不退化是不可能的，但积极采取措施，可使菌种优良特性延缓退化。但积极采取措施，可使菌种优良特性延缓退化。延缓退化的思路：在了解菌种退化原因后，减少传延
2、缓退化的思路：在了解菌种退化原因后，减少传代，科学保藏，经常纯化分离。代，科学保藏，经常纯化分离。保藏方法通常有两类：保藏方法通常有两类：一类保藏时间较短，如琼脂营养斜面等一类保藏时间较短，如琼脂营养斜面等另一类保藏时间较长，如沙土法等另一类保藏时间较长，如沙土法等 保藏方法的基本原理是抑制菌种的代谢活动，使之保藏方法的基本原理是抑制菌种的代谢活动，使之停止繁殖，处于休眠状态。停止繁殖，处于休眠状态。第一节第一节 菌种的退化与复壮菌种的退化与复壮一、菌种退化的定义一、菌种退化的定义生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良菌株，由生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良菌株，由于进行移接传代或保藏之后，
3、群体中某些生理特征于进行移接传代或保藏之后，群体中某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象。和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象。二、菌种退化的原因二、菌种退化的原因(一一)基因突变基因突变(二二)连续移代连续移代(三三)培养和保藏条件的影响培养和保藏条件的影响(一一)基因突变基因突变1.基因突变导致菌种退化基因突变导致菌种退化2.质粒脱落导致菌种退化质粒脱落导致菌种退化(二二)连续移代连续移代(三三)培养和保藏条件的影响培养和保藏条件的影响不良培养条件如营养成分、温度湿度、不良培养条件如营养成分、温度湿度、pH值、通气量等和值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发低
4、保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发低产基因型菌株的出现，而且会造成低产基因和高产基因细产基因型菌株的出现，而且会造成低产基因和高产基因细胞的数量比发生变化。胞的数量比发生变化。培养基条件影响不同类型细胞或细胞核的数量培养基条件影响不同类型细胞或细胞核的数量培养基也会影响菌种形态特征和培养特征培养基也会影响菌种形态特征和培养特征不良的环境，如温度、湿度、不良的环境，如温度、湿度、pH值、氧气等都会不同程度值、氧气等都会不同程度的引起菌种退化。的引起菌种退化。三、菌种退化的防止三、菌种退化的防止1.尽量减少传代：减少自发突变的几率。尽量减少传代：减少自发突变的几率。2.菌种经常纯化：
5、菌种经常纯化：3.创造良好培养条件：适合原种的生长。创造良好培养条件：适合原种的生长。4.用单核细胞移植传代：孢子。用单核细胞移植传代：孢子。5.采用有效的菌种保藏方法：数量性状。采用有效的菌种保藏方法：数量性状。四、菌种的复壮及其方法四、菌种的复壮及其方法(一一)菌种复壮的原理菌种复壮的原理人们通过人工选择法分离筛选出那些原有优良性状的个体，使人们通过人工选择法分离筛选出那些原有优良性状的个体，使菌种获得纯化，这一过程即复壮。菌种获得纯化，这一过程即复壮。“狭义复壮狭义复壮”：在菌种已发生退化的情况下，通过：在菌种已发生退化的情况下，通过纯化分离和测定生产性能等方法，从退化群体中找纯化分离和
6、测定生产性能等方法，从退化群体中找出少数尚未衰退的个体，进一步繁殖，以达到恢复出少数尚未衰退的个体，进一步繁殖，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种消极措施。该菌种原有典型性状的一种消极措施。“广义复壮广义复壮”：在菌种的生产性能尚未退化前就经：在菌种的生产性能尚未退化前就经常有意识地进行纯种分离与生产性能的测定工作，常有意识地进行纯种分离与生产性能的测定工作，以保持菌种稳定的生产性状，甚至使其逐步提高的以保持菌种稳定的生产性状，甚至使其逐步提高的一种积极措施。一种积极措施。(二二)菌种复壮的主要方法菌种复壮的主要方法1.纯种分离纯种分离2.淘汰法：低温处理淘汰法：低温处理3.宿主体内复壮法：寄
7、生性微生物宿主体内复壮法：寄生性微生物第二节第二节 工业微生物菌种的保藏工业微生物菌种的保藏一、菌种保藏一、菌种保藏1.定义：在广泛收集实验室和生产菌种、菌株的基础上，定义：在广泛收集实验室和生产菌种、菌株的基础上，将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不污染以便于将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不污染以便于研究、交换和使用的目的。研究、交换和使用的目的。2.菌种保藏方法的共同特点菌种保藏方法的共同特点(1)挑选典型菌种的优良纯种，最好采用休眠体；挑选典型菌种的优良纯种，最好采用休眠体；(2)创造一个适合长期休眠的环境条件，如干燥、低温、缺氧、创造一个适合长期休眠的环境条件，如干燥、低温、缺
8、氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度调节剂等。避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度调节剂等。3.常用的菌种保藏方法常用的菌种保藏方法(1)斜面保藏方法斜面保藏方法(2)液体石蜡保藏法液体石蜡保藏法(3)干燥保藏法干燥保藏法(4)冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏法(5)真空干燥法真空干燥法(6)液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法(7)液相保藏法液相保藏法(1)斜面保藏方法斜面保藏方法主要影响因素：主要影响因素：A.菌种保藏培养基菌种保藏培养基a.营养成分贫乏，氮源略多，而糖类少；营养成分贫乏，氮源略多，而糖类少；b.培养基交替：保藏斜面在传代过程中，营养贫培养基交替：保藏斜面在传代过程中，营养贫乏和丰富
9、培养基交替使用，有利于保持菌种的优乏和丰富培养基交替使用，有利于保持菌种的优良特性；良特性；c.碳、氮源：配制斜面保藏培养基时，要选择那碳、氮源：配制斜面保藏培养基时，要选择那些不易引起菌种回复突变的碳、氮源；些不易引起菌种回复突变的碳、氮源；d.斜面保藏培养基最好用植物等天然有机物浸出斜面保藏培养基最好用植物等天然有机物浸出汁配制，有利于保持菌种活性。汁配制，有利于保持菌种活性。B.培养条件培养条件优点优点简便有效，特别适合于非长期保藏的菌种以及不能简便有效，特别适合于非长期保藏的菌种以及不能采用低温干燥方法保藏的菌种。采用低温干燥方法保藏的菌种。缺点缺点A.存在自发突变：由于斜面含有营养和
10、水分，菌种存在自发突变：由于斜面含有营养和水分，菌种生长繁殖未完全停止，代谢活动仍微弱进行。生长繁殖未完全停止，代谢活动仍微弱进行。B.移植代数多：比其他保藏方法多，易发生变异和移植代数多：比其他保藏方法多，易发生变异和引起退化；引起退化；C.传代频繁：不仅影响菌种质量，也容易造成杂菌传代频繁：不仅影响菌种质量，也容易造成杂菌污染；污染；D.水分蒸发：造成浓度增高，渗透压加大，易引起水分蒸发：造成浓度增高，渗透压加大，易引起菌种退化甚至死亡。菌种退化甚至死亡。(1)(1)斜面保藏方法斜面保藏方法(2)液体石蜡保藏法液体石蜡保藏法其实是斜面保藏的一种方式，它比斜面保藏的好处是因为其实是斜面保藏的
11、一种方式，它比斜面保藏的好处是因为在斜面中加入石蜡油，保存期间可以防止培养基水分蒸发在斜面中加入石蜡油，保存期间可以防止培养基水分蒸发并隔绝氧气，克服了斜面保藏的缺点。并隔绝氧气，克服了斜面保藏的缺点。(3)干燥保藏法干燥保藏法自然界中不少微生物由于可产生孢子或芽孢，在干燥环境自然界中不少微生物由于可产生孢子或芽孢，在干燥环境中抵抗力强，不易死亡，因此把菌种接种到一些适宜的载中抵抗力强，不易死亡，因此把菌种接种到一些适宜的载体上，人为创造干燥环境，能够达到菌种保藏的目的。体上，人为创造干燥环境，能够达到菌种保藏的目的。常用干燥保藏方式常用干燥保藏方式砂土保藏法砂土保藏法滤纸条保藏法滤纸条保藏法
12、无水硅胶保藏法无水硅胶保藏法麸皮保藏法麸皮保藏法(4)冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏法用保护剂制备菌悬液，然后将含菌样快速降至冰冻状态，减用保护剂制备菌悬液，然后将含菌样快速降至冰冻状态，减压抽真空，使冰升华成水蒸气排出，从而使含菌样脱水干燥，压抽真空，使冰升华成水蒸气排出，从而使含菌样脱水干燥，并在真空状态密封瓶口隔绝空气，造成无氧的真空环境，置并在真空状态密封瓶口隔绝空气，造成无氧的真空环境，置于低温保存。于低温保存。(5)真空干燥法真空干燥法(6)液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法(7)液相保藏法液相保藏法A.蒸馏水保藏法蒸馏水保藏法B.磷酸盐缓冲液保藏法磷酸盐缓冲液保藏法C.食盐溶液保藏法食
13、盐溶液保藏法二、菌种保藏注意事项二、菌种保藏注意事项1.保藏菌种要用良好的培养基，采用新鲜培养的菌种；保藏菌种要用良好的培养基，采用新鲜培养的菌种；2.操作中应严格无菌操作；操作中应严格无菌操作；3.注意保藏菌种的制备质量注意保藏菌种的制备质量4.为防止菌种退化，应创造最适宜的保藏条件；为防止菌种退化，应创造最适宜的保藏条件；5.严格控制传代次数；严格控制传代次数；6.恢复培养时，应移接到保藏前相同培养基上进行培养，恢复培养时，应移接到保藏前相同培养基上进行培养，以维持优良性能的稳定性。以维持优良性能的稳定性。工业微生物育种学工业微生物育种学总结总结主要内容主要内容定向培育与选种定向培育与选种诱变育种诱变育种杂交育种杂交育种代谢控制育种代谢控制育种基因工程育种基因工程育种原理原理基因突变基因突变诱发突变诱发突变遗传、生长遗传、生长代谢控制代谢控制基因体外重组基因体外重组方法方法分离、出发菌株分离、出发菌株诱变、杂交诱变、杂交筛选筛选保藏保藏