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1、液相色谱培训教材 天津兰博实验仪器设备有限公司 2011.04主要内容液相色谱仪的基本原理液相色谱仪的操作过程与一般规则LabAlliance 液相色谱仪组成与使用方法常见使用故障及维护 液相色谱仪的基本原理早在年，俄国的植物学家茨维特将含有植物色素的石油醚溶液倒入一根内部填充着碳酸钙粉末的玻璃管中，再不断用石油醚淋洗，随着石油醚的不断下降，玻璃管中形成了不同颜色的谱带，从而成功地将不同的色素分离开来。“色谱”也就由此而得名。淋洗用的石油醚称为流动相，玻璃管中的碳酸钙称为固定相，玻璃管称为色谱柱，后来这种方法广泛地应用于多种混合物的分离，并成为一种很重要的仪器分析方法。色谱法(chromato
2、graphy)是一种物理、化学的分离、分析方法。它利用混合物各组分在互相接触的固定相和流动相中有不同的分配比（或吸附能力的差异），当两相作相对运动时，这些组分在两相中多次反复分配平衡，从而使各组分得到分离，然后按顺序被检测。液相色谱仪原理示意图流动相进样器色谱柱工作站时间检测器组分从色谱柱流出时，检测器响应信号大小随时间变化所形成的曲线叫色谱图，它是定性、定量分析和评价色谱分离情况的基本依据液相色谱仪需要了解的几个概念液相色谱仪需要了解的几个概念保留时间（tR）：自进样至出现色谱峰最高点所用的时间，称为保留时间，以分钟Min为单位峰高（h）：色谱峰顶点与基线之间的垂直距离。以mv或mAu表示。
3、峰面积（）：由峰和峰底之间围成的面积。峰面积被用作定量分析的指标。理论塔板数(TP)：色谱的柱效参数之一,用于定量表示色谱柱的分离效率液相色谱仪的操作过程与注意事项液相色谱分析流程-开机平衡1.开机：依次打开泵、检测器、柱温箱、自动进样器、工作站电源，在电脑上双击工作站图标进入工作站主界面。2.用5%甲醇（或5%乙腈）冲洗色谱柱15分钟3.换上流动相，设定好参数（波长，柱温，流速，采样时 间等）后开泵，平衡系统大约30分钟到小时三聚氰胺1.对于三聚氰胺的检测，波长设为240nm,柱温400C,流速1.0ml/min，采样时间设为20-30min（根据出峰时间而定）2.平衡时间以基线走平为准，只
4、要基线平直就可以运行进样程序。液相色谱分析流程-进样分析1.按国标要求进不同浓度标样，得到一系列谱图，用浓度与峰面积的值导出线性方程。计算该线性方程的R2值2.进处理好的样品。得样品峰谱图。3.将样品峰面积代入线性方程和国标公式，计算含量。得到样品中被测物的含量。液相色谱分析流程-冲洗系统1.进完样品后，将流动相换成5%甲醇水溶液冲柱1小时，目的是为了彻底洗去系统中残留的缓冲盐2.将5%甲醇水溶液换成100%甲醇冲洗30分钟。3.停泵，关机，关电源。液相色谱分析流程-冲洗系统注意：1.做完实验后系统中存在含盐流动相的情况下，万万不可直接将甲醇或乙腈导入系统中，因为大部分缓冲盐在甲醇或乙腈中是不
5、溶的，从而导致盐析出，损坏仪器。2.用5%甲醇而不用纯水是为了保护色谱柱。液相色谱分析流程-三聚氰胺平衡，冲洗方法 针对三聚氰胺的流动相中含有的离子对缓冲盐的情况，我们建议在做完实验之后用同样比例不含盐的乙腈：水=15:85或是10:90冲洗系统1小时，然换成50：50的乙腈：水冲洗30分钟后关机，再次做实验时，直接用流动相平衡系统即可。长时间不用时，再用纯甲醇冲洗，保存。操作注意事项-流动相1.流动相须现用现配。2.使用HPLC级或相当于该级别的流动相，并要先经0.45m薄膜过滤。3.如有仍有气泡产生，还需超声15分钟。4.在使用仪器过程中，注意贮液瓶里的流动相是否够用，在一次分析中，不要加
6、注流动相，加注或更换后需重新平衡。操作注意事项-电源1.电压需保持稳定，配3KW净化稳压电源防止电压不稳对仪器造成伤害。2.地线。必须确保独立地线已连接好，否则会增加基线噪声，造成灵敏度下降，甚至无法分析。3.不能短时间内反复开关机。尤其是紫外检测器，两次开关机时间间隔5分钟以上。4.由于液相色谱组件较多，请选用质量较好的接线板，防止虚接造成瞬间电流过大，损坏仪器。操作注意事项-色谱柱1、色谱柱的保存 （1）反相色谱柱每天实验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用5%的甲醇/水冲洗60分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入5%的甲醇。
7、（2）长期保存色谱柱：如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温。操作注意事项-色谱柱2.更换色谱柱时，需将管子完全插入开口端，直至其与开口端的末端相碰为止。否则将产生死体积，引起峰展宽，或是肩峰。操作注意事项-自清洗液在线自清洗。在线自清洗是SSI的专利设计，其的作用的是为了自动清洁泵头柱塞，延长其使用寿命，自清洗液为20%的甲醇溶液，在用含盐流动相时，建议每三天更换一次，不含盐时每周换一次，达到最好的清洗效
8、果。小结：必须严格按照上述操作规程进行操作，才能避免损坏仪器。LabAlliance 液相色谱仪组成与使用方法液相色谱仪原理示意图 高效液相色谱系统 泵泵 进样器 色谱柱（柱温箱）检测器 工作站 柱后衍生装置液相色谱泵外观图高压自清洗泵调节流速开泵/关泵模式切换出口单向阀入口单向阀泵头旁通阀出口过滤器泵面板上的操作按键泵的开启和关闭增加流量减小流量最大流速冲洗泵，禁用。流速，压力，高压，低压限制的设定切换泵头演示图泵头剖面图 泵 进样器进样器 色谱柱（柱温箱）检测器 工作站 柱后衍生装置手动进样器 泵 进样器 色谱柱色谱柱 检测器 工作站 柱后衍生装置色谱柱固定相分子结构色谱柱类型 泵 进样器
9、 色谱柱（柱温箱）检测器检测器 工作站 柱后衍生装置201+检测器操作界面201+检测器的菜单SIGNAL 菜单 signal:0.0000:254 t:0.2 ON 信号菜单或主菜单包涵信号强度signal:,波长:,时间常数t:和灯的状态。实际测量的信号值显示为一个带四位小数的数字。测量波长:可以在 190 至 740 纳米区间，变动精度为一个纳米。使用时间常数t:您可以使信号更平滑。它的值可以被设置为0.1,0.2,0.5,1,2,5,或10 秒.这个值设置得越大，信号就越平滑。时间常数为1秒时一般是作分析时的最佳值。最后您可以在这个菜单开关灯，分别用ON和 OFF 按钮。201+检测器
10、的菜单UNITS菜单 UNITS signal:au :nm t:s 这个菜单仅作信息显示用，不能改变。显示的是信号菜单中各个值的单位。201+检测器的菜单SCAN 菜单 SCAN:620-740 -Fgo AZ speed:0Hz 您可以在停止流通模式作扫描。有四种扫描速率供选择。扫描范围可以设置，此前可以先自动归零。截止滤波器可以启用(+F)或无效(-F).201+检测器的菜单PROG 菜单 PROG 000.00-254 go 000.00-PROG菜单可以输入一个可以改变波长的时序程序。如何输入和执行一个程序的方法将在“输入一个程序”部分详述。程序包括起始和结束行最多可以包括11行。2
11、01+检测器的菜单INT菜单 这个菜单仅作信息显示用，不能改变。INT sig:0.6543 1/8 ref:0.3848 sig 和 ref的值分别记录信号的强度和参比信道。sig 和 ref值的范围在0和1之间。它们依赖于所选的波长，使用的溶剂、流通池和灯的使用年限。两者值的比率应该在1:1.5和1:1.8之间。如出入较大则说明有可能流通池脏了或者是溶剂在所选波长处吸收过强。201+检测器的菜单EXT.CONTROL菜单 EXT.CONTROL:keyboard 此菜单可选择控制模式，外部仪器(external control=analog)或单机模式（选择键盘）。201+检测器的菜单AN
12、ALOG OUT 菜单 ANALOG OUT:aufull scale:1e-0 ANALOG OUT菜单是用来标定模拟输出信号的。一般说来最大输出信号是1 V.根据实际情况您可以决定对于这个信号的最大值用多大的单位和相应的满量程偏差。可以选择1e-4,2e-4,5e-4,1e-3,2e-3,5e-3,1e-,2e-2,5e-2,1e-1,2e-1,5e-1,1e-0,2e-0,5e-0 或 1e+1 单位(分别对应于 0.0001,0.0002,0.0005,0.001,0,002 0.005,0.01,0.02,0.05,0.1,0.2,0.5,1,2,5,和 10)。201+检测器的菜单
13、LAMP 菜单 LAMP:Deuterium这个菜单用于输入适用于软件的灯的类型。选项有氘灯（Deuterium）和卤（Halogen）灯。如果确实更换了灯的类型，设置才可以改变。如果设置和实际装备不符，仪器将无法正确地工作。201+检测器的菜单-RANGE/FILTER菜单 -RANGE:190-740?FILTER:380 波长范围可以被限制为标准设置。然后在此范围内的选值。大于380纳米时可用一边缘滤波器来增大选择性。在这种情况下要注意灵敏度的降低问题。201+检测器的菜单A-IN 菜单 A-IN Set-Zero actual 000nm A-IN-(Analog-IN)菜单是用来调整
14、模拟输入的。使Set-Zero 有效意味着输入端的电压信号为000纳米。例如当在输入施以一5V电压时，actual栏将显示500nm作为波长值。假设1V=100 nm,500 nm.生成另一个校准点，可用波长 或 键改变波长值。201+检测器的菜单GLP菜单 GLP S/N:00047755 01 00962.Oh 101 GLP菜单包涵了下列信息：序列号，所用灯的总数，当前灯的总工作时间和启动灯的数量。泵 进样器 色谱柱（柱温箱）检测器 工作站工作站 柱后衍生装置工作站界面图采集步骤设定方法打开工作站在主界面中设置“谱图采集参数”-“采集时间选项此选项设置要与自动自样器保持一致。开启自动进样
15、程序数据处理-打开谱图1.打开标样谱图点击文件-打开命令在弹出的对话框中选择标样的谱图文件数据处理-设定积分参数1.在打开的谱图最前端点击右键。在弹出的对话框中选”自动生成谱图处理表项”-“开始禁止判峰（删除起点）“数据处理-设定积分参数1.在我们需要的峰的前面点击自动生成谱图处理表项-开始”峰分离处理（谷点改终点）“自动判峰积分数据处理-设定积分参数。完成时，我们所需要的峰已积分。谱图处理表项中已自动填入参数。数据处理-设定组分表1.在峰的内部点面击右键选择“自动填写定量组份表中时间-套峰时间2.此时套峰时间中会自动填入峰的保留时间3.填入组分名称，浓度值数据处理-定量计算1.点击”定量方法
16、“表项，选择”计算校正因子“2.点击定量计算按钮数据处理-查看计算结果计算结果将显示在上图中。点击”当前表存档。即保存了当前的数据。数据处理-制作工作曲线不断重复上述过程，将不同浓度的标样全部处理过后，进入存档。点击“定量方法”表项,选择“工作曲线”-计算按钮点击显示,即可显示出工作曲线。数据处理-基于工作曲线的样品含量计算打开样品谱图，积分，设定组分（按前述方法）选择多点柆正乘数1：定容体积乘数2：稀释倍数除数：称样量输入完毕后，点击定量计算数据处理-结果显示最终含量在此显示报告打印点击打印机图标，打印报告报告打印-通过word 或是写字板 泵 进样器 色谱柱（柱温箱）检测器 工作站 柱后衍
17、生装置柱后衍生装置柱后衍生系统PCR 主要应用领域主要应用领域氨基甲酸酯草甘膦黄曲霉毒素氨基酸（OPA）氨基酸（Ninhydrin）小结：常用的液相色谱由以上几部分组成。熟悉每个组件的功能与作用，能够帮助我们对使用中出现的问题进行正确的判断与排查。常见使用故障及维护检查指标每日检查，记录：1.泵压力，保留时间是否稳定2.峰面积与浓度的比值每周检查：1.线性2.重复性3.标准品有效性压力过大1.是否是刚刚换上流动相，未平衡，多等10分钟看压力是不是已经下降。同时检查流动相配比是否正确，是否已过滤，混匀。2.若压力一直很稳定，停泵，待压力降下来后，拆下色谱柱与检测器联接，开泵，看是否有压力下降，若降到正常范围之内，则可以判断检测池堵塞（给厂家致电）；若没有下降，此时要完全拆下柱子，开泵，此时若没有压力，则柱子堵塞，需更换，或此时仍有200以上的压力，说明泵出口过滤器堵塞，可以将出口过滤器拆下超声清洗即可。压力低，波动大压力比正常值低，且不稳定时1.仔细检查是否有漏液的现象。2.检查进液管中是否进气泡。2.单向阀被污染。超声清洗处理3.柱塞密封漏液，更换密封面积/浓度比异常检查1.流动相的配比，PH值是否有变化。2.平衡时间是否足够。3.氘灯能量，所用的时间，Thank you!