流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法课件.ppt

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1、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制张张子宁子宁子宁子宁卫卫生部艾滋病免疫学重点生部艾滋病免疫学重点生部艾滋病免疫学重点生部艾滋病免疫学重点实验实验室室室室HIV感染中CD4+、CD8+T细胞测定的临床意义淋巴淋巴细胞胞B B淋巴淋巴淋巴淋巴细细胞胞胞胞CD19+CD19+NKNK细细胞胞胞胞CD3-CD16+56+CD3-CD16+56+T T淋巴淋巴淋巴淋巴细细胞胞胞胞CD3+CD3+T T辅辅助助助助/诱导细诱导细胞胞胞胞CD3+CD4+CD3+CD4+T T抑制抑制抑制抑制/细细胞毒性胞毒性胞毒性胞毒性细细胞胞胞胞CD3+CD8+CD3+CD8+v淋巴淋巴细胞在免疫胞在免疫应答中起核心

2、作用。答中起核心作用。vCD4+T淋巴淋巴细胞胞对细胞免疫和体液免疫平衡的胞免疫和体液免疫平衡的维持具有枢持具有枢纽的的功能。功能。vCD4+T淋巴淋巴细胞是胞是HIV感染最主要的靶感染最主要的靶细胞。胞。SHIV及其包膜蛋白的直接及其包膜蛋白的直接细胞致病作用胞致病作用 S感染感染细胞胞-未感染未感染细胞形成合胞体胞形成合胞体 S程序性程序性细胞死亡胞死亡 S自身免疫机制自身免疫机制S特异性特异性细胞毒胞毒T细胞胞对HIV感染感染细胞的破坏作用胞的破坏作用vvHIVHIV通通通通过过多种直接和多种直接和多种直接和多种直接和间间接的病理机制接的病理机制接的病理机制接的病理机制导导致致致致CD4

3、+TCD4+T细细胞数量的缺失,最胞数量的缺失,最胞数量的缺失,最胞数量的缺失,最终终引起感染者免疫功能缺陷。引起感染者免疫功能缺陷。引起感染者免疫功能缺陷。引起感染者免疫功能缺陷。HIV感染后CD4+、CD8+T细胞变化vCD4+T细胞(胞(Th细胞)胞)绝对计数持数持续减少减少vCD8+T细胞(胞(Ts细胞)增高,到疾病晚期胞)增高,到疾病晚期时下降下降vT细胞胞亚群比例倒置,群比例倒置,CD4/CD8 500/ul(29%)A1B1C1200-499/ul(14-28%)A2B2C2200/ul(14%)A3B3C3 成人及青少年艾滋病分期成人及青少年艾滋病分期标准(准(CDC,美国,美

4、国,1993年)年)CD4200/ul和和/或或出出现艾艾滋滋病病指指针性性症症状状(如如卡卡氏氏肺肺囊囊虫虫肺肺炎炎等等)时,就就可可定定义为进入艾滋病期。如表中入艾滋病期。如表中A3,B3,C1-3期。期。判断判断HIV感染者感染者发生生临床合并症的可能性并床合并症的可能性并进行行预防防艾滋病艾滋病艾滋病艾滋病诊诊断与治断与治断与治断与治疗疗指指指指导导方案方案方案方案(试试行,行,行,行,20022002年)年)年)年)CD4CD4计计数(数(/ul/ul)主要机会性感染的主要机会性感染的预预防防任意任意值值结结核(皮核(皮试试阳性)阳性)200200PCPPCP100100弓形体病(抗

5、体阳性)弓形体病(抗体阳性)7575MACMAC5050CMVCMV(抗体阳性或血培养)(抗体阳性或血培养)隐隐球菌病球菌病组织组织胞胞浆浆菌菌病球病球孢孢子菌病子菌病确定抗确定抗HIV药物治物治疗开展的开展的时机及机及进行行疗效效评价价艾滋病艾滋病艾滋病艾滋病诊诊断与治断与治断与治断与治疗疗指指指指导导方案方案方案方案(试试行,行,行,行,20022002年)年)年)年)病程CD4+T淋巴细胞病毒载量建议症状期任何值任何值治疗无症状期CD4+T细胞200/mm3,但30000(bDNA)或55000(RT-PCR)建议治疗。另外还要根据CD4+T细胞下降率和患者的愿望无症状期CD4+T细胞3

6、50/mm330000(bDNA)或55000(RT-PCR)建议延迟治疗观察。未经治疗者3年发展至AIDS15%.虽然CD4+T细胞计数是监测HIV病程的评价工具,但是单独的CD4+T细胞数减少不是HIV感染的诊断检验。其它的免疫缺陷状况也可以有辅助性T-淋巴细胞数量减少的结果:-丙球蛋白缺乏症-胸腺发育不全(DiGeorge氏综合症)-严重的联合免疫缺陷提提 示示CD4+T细细胞胞计计数的方法数的方法非非FCM 技技术术FCM 技技术术-自自动动化方法化方法-可靠性高可靠性高(变变异系数低异系数低)-精密度、准确度和可重复性高精密度、准确度和可重复性高-高通量高通量-金金标标准技准技术术优

7、优点点-设备设备昂昂贵贵-试剂试剂昂昂贵贵-需要熟需要熟练练技技术术人人员员操作操作缺点缺点-简单简单-低廉低廉优优点点-低通量低通量-难难于于质质控控缺点缺点仪器的选择1、中央级、省级、研究所、高校、医院:流式细胞仪(FACSCalibur、Coulter)2、地区级及示范区:专门的流式细胞计数仪(FACSCount、Guava)3、现场及乡镇卫生院:(手工方法:如Dynabeads)4、除此之外,在不具备CD4检测的实验室,WHO建议用总淋巴细胞来代替。(当总淋巴细胞小于1000/ul时,强烈预示CD4细胞小于200/ul。非流式细胞技术免疫聚合磁珠 Dynabeads(利用光镜和免疫荧光

8、染色)细胞球 Cytosphere(利用计数板和光镜)Dynabeads技术计数CD4细胞原理用抗CD4单克隆抗体(mAbs)包被的磁化粒子捕获与分离全血中CD4T淋巴细胞方法将125l新鲜血液,放入EDTA管,加350lPBS,再加入25l mAbs磁化悬浮粒子,在摇床(Dynal Mechnical Rotator)上置室温10分钟混和,以便去掉血液中的单核细胞。磁化粒子用专门的磁性浓度计分离,并用PBS洗涤2次,加入50l Lysing溶液,着色,用epifluorescent显微镜计数。价格:3美元/人份流式细胞术(flow cytometry,FCM)流式细胞仪流式细胞仪BD FAC

9、SVantageBD-Calibur 对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选FCM的特点 保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏从分子水平获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选功能特点 (1)多参数定量分析每一个细胞;(2)细胞分选;高纯度:99%以上;可分析小于1/10000比例的稀有细胞群;单细胞克隆等。(3)高通量(分析分选)分析150,000个/秒 分选100,000个/秒 流式细胞仪内部结构光学系统光学系统激光光源激光光源激光光源激光光源光收集系统光收集系统光收集系统光收集系统液流系统液流系统流动室流动室流动室流动室液流驱动系统液流驱动系统液流驱动系统液流驱动系统电子系统电

10、子系统光电转换光电转换光电转换光电转换数据处理系统数据处理系统数据处理系统数据处理系统细胞分选系统细胞分选系统流体动力学聚焦流动室激光聚焦1、液流系统包裹样本流使之位于喷嘴中心二色镜 1 2 3带通滤波片光电倍增管激光束细胞收集透镜前向散射光侧向散射光,荧光 光信号分离,导向,各探测通道PMT接收并转化为电信号。2、光学系统:激光光源、分色反光镜、光束成形器、透镜组、滤片、光电倍增管数据处理系统FSC SSC FL1 FL2 FL3对数对数 线性线性 线性线性 线性线性 对数对数脉冲处理,模数转换光信号电信号记录数据,显示结果(面积,峰高,宽度)基本工作原理非荧光信号颗粒度细胞大小散射光的测定

11、散射光信号区分裂解后的外周血细胞群荧光测量荧光测量荧光染料被激发而发射的光信号 多荧光标记胞内多种组分,实现多参数测量线性放大:信号强度变化范围较少、生物学线性过程对数放大:信号强度变化范围较大、光谱信号复杂自发荧光特异荧光特异荧光数据的显示与分析参数FSSSFL单参数直方图一维参数(荧光或散射光)与颗粒技术(Count)构成,反映同样荧光强度的颗粒数量的多少横坐标:光信号波长相对值(信道)纵坐标:被测细胞的相对数量数据显示方式数据显示方式双参数直方图点图二维等高图:等高线连接相同细胞数的点密度图假三维等高图三参数直方图流式细胞仪的多参数分析Region设置指在同一张单参数或双参数直方图上根据

12、信号的强弱划定分析区域,从而计算分析区域内的细胞数量。CD45 FITC(log)CD14 PE(log)G2Gate设置是指在某一张选定参数的直方图上根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群,并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。双平台法:双平台法:单单平台法:平台法:流式细胞技术检测CD4+T细胞流式流式流式流式细细细细胞技胞技胞技胞技术术术术传统传统传统传统的的的的FCM:FCM:双平台法双平台法双平台法双平台法-需要两台需要两台仪仪器器-需要几个制需要几个制备备和分析步和分析步骤骤-分析能力低分析能力低-结结果受多个因素影响果受多个因素影响-昂昂贵贵传统

13、传统的的FCM:单单平台法平台法-只需一台只需一台仪仪器器-较较少的制少的制备备和分析步和分析步骤骤-非常昂非常昂贵贵美国美国美国美国CDC CDC 推荐推荐推荐推荐(2003)(2003)单平台测定CD4+T 细胞绝对数指南-FDA 批准的商批准的商业荧业荧光微球光微球计计数数试剂试剂-以以 CD45 设门设门-三或四色流式三或四色流式细细胞胞仪仪三色三色组组合合 1)CD3/CD4/CD452)CD3/CD8/CD453)CD3/CD19/CD45四色四色组组合合 1)CD45/CD3/CD4/CD82)CD45/CD3/CD19/CD16 和和/或或 CD56FACSCaliburTM

14、系系统统选选配配BDB Tritest/TruCOUNTTM 试试管管WWW.BDBIOSCIENCES.COM样本制备(Lyse/No-wash 技术)50 L 抗凝全血抗凝全血涡旋室温避光孵育15分钟获获取和分析取和分析20 L TriTEST 试剂试剂450 L FACS溶血液溶血液(1x)TruCOUNT TM 试试管管TriTEST 试剂试剂:a)CD3/CD4/CD45,b)CD3/CD8/CD45室温避光孵育15分钟 细胞亚群的细胞获取数 Beads 总量 细胞亚群的 X =Beads获取数 样本量(l)绝对数(细胞数/l)CD45 PerCPSSCBDB MultiSETTM

15、软软件件MMWR,2003:52(RR02);1-13CD4绝对计数数结果果内置微处理器实现数据自动分析自动打印质控与病人的检测结果简单易用的系统控制面板配套的样本制备工作台简捷的样本制备方法,避免细胞损失BDB FACSCountTM 系系统统仪器性能样本稳定性制备后室温(2025 0C)储存48小时全血稳定性采集后室温(2025 0C)储存48小时仪器性能范围CD4+:50-2000个细胞/uLCD8+:100-2000个细胞/uL CD3+:100-3500个细胞/uL检测试剂盒组成(50人份/盒)荧光试剂2个组合/人份CD4PE/CD3PE-CY5CD8PE/CD3PE-CY5固定液效

16、期 28 0C储存6个月质控试剂盒(50人份/盒)零,低,中,高 4种靶值微球效期 28 0C储存1个月使用简单方便安装简便,一体式设计,无需外源计算机即开即用,无需调试校准全自动软件自动识别分析淋巴细胞群体自动错误报警实验报告CD3CD4CD8CD4/CD8CD4/CD3CD8/CD3报告项目自动设定分析区域自动设定分析区域CD3 SizeCD3 CD4内参微球内参微球设定分析群体设定分析群体CD3 CD4CD3 CD8CD8 管分析管分析绝对计数公式绝对计数公式CD4 细胞数细胞数内参微球数内参微球数X#获取微球数获取微球数 m mL 全血体积全血体积=CD4 细胞细胞m mL 全血全血举

17、例举例#2#1X#获取微球数获取微球数 m mL 全血全血=CD4 细胞细胞m mL 全血全血CD3 CD4绝对计数计算绝对计数计算CD4质控微球质控微球绝对计数计算CD4+T细胞检测的质量控制质量控制质量控制是指在每一次实验过程中为确保实验工作正常进行而必须采取是指在每一次实验过程中为确保实验工作正常进行而必须采取的各种措施。的各种措施。实验前质量控制采集标本前病人的准备;正确的标本采集方法;准确及时的运送标本;实验前正确地处理和保存标本。实验中质量控制质控品的准备;试剂的评价选择 仪器的校准 开展Levey-Jennings 质控图质控(或“即刻法”质控)。实验后质量控制实验后准确填写检验

18、结果;及时发出报告;正确地解释检验结果的临床意义 文件管理 实验前质量控制特别注意运输温度:室温运输时间:双平台6小时,单平台24小时样品处理:专人,及时,规范。实验中质量控制质控品:质量和价格,长期使用试剂选择:不推荐混用不同厂家的试剂仪器校准:厂家定期,实验室质控图:每天要做淋巴淋巴细细胞免疫分型的胞免疫分型的质质控品控品室间质评室内质控International Program for Quality Assessment ProgramType of sampleNumber of participationsSendouts per yearSpecimens per sendout

19、CostStandardization for Lymphocyte ImmunophenotypingandWhole blood HIV-Whole blood HIV-(some CD4 depleted)Whole blood HIV-(some CD4 depleted)Whole blood HIV-,HIV+UKNEQASQASICAPNIAID DAIDS1630064223515070080$820No cost$650No cost我 国全国CD4+T淋巴细胞检测实验室能力验证使用使用稳稳定的人血定的人血对对照作照作为为淋巴淋巴细细胞免疫分型的内部胞免疫分型的内部质质量量监

20、监控控产品名类型已知检测范围制造商Multi-Check全血YesBDBCD-Chex Plus全血YesStreck LaboratoriesCD-Chex全血YesStreck Laboratories(BDB)(BDB)FluoroTrol全血YesBioErgonomicStatusFlow全血YesR&DCyto-Trol单核细胞(冻干)YesCoulterTruCOUNT controls对整个绝对计数过程的质控,结果超出标准值的时候,提示吸样过对整个绝对计数过程的质控,结果超出标准值的时候,提示吸样过程、绝对计数珠、仪器等出现问题。程、绝对计数珠、仪器等出现问题。流式细胞术检测的

21、质控图试剂选择不同厂家的试剂在抗原决定族的特异性(F/P和蛋白纯度)是不同的,不建议使用组合不同厂家的试剂.仪器校准校准移液器校准:流式细胞仪校准:移液器校准 时间:一年至少应该标定或校准二次 方法:吸取有色溶液进行光谱分析、*吸取蒸馏水称量校准、吸取放射性同位素计数校准 使用配套校准盒等等。设备维修与校准移液器规格移液器规格标定使用蒸馏水量标定使用蒸馏水量要求重量范围要求重量范围 0.5-10 0.5-10 l l 2 2 l l 1.75-2.25 mg1.75-2.25 mg 5-40 5-40 l l 10 10 l l 9.8-10.2 mg9.8-10.2 mg 40-200 40

22、-200 l l 70 70 l l 69.4-70.6 mg 69.4-70.6 mg 200-1000 200-1000 l l 300 300 l l 298.0-302.0 mg298.0-302.0 mg 1-5 ml1-5 ml 2000 2000 l l 1990.0-2010.0 mg1990.0-2010.0 mg 2-10 ml2-10 ml 3500 3500 l l 3485.0-3515.0 mg3485.0-3515.0 mg*吸取蒸馏水称量v 仪仪器参数可以由器参数可以由FACSComp 和和CaliBRITE TM 微球微球,仪仪器器调调控控软软件自件自动设动设

23、置置.FACSCalibur校准校准 流式细胞术检测的质控图流式细胞术检测的质控图实验后质量控制实验者填写报告负责人审阅报告结果报告备案正确解释结果操作者的技术实验后质量控制保留所有原始、最终、和修正后报告定期做计算机备份定期抽检检验申请和结果报告定期考核检测人员能力实验后质量控制培训提高人员能力实验人员实验人员应该具有HIV以及AIDS的相关知识。要定期培训提高专业能力。实验室管理人员实验室管理人员 对实验室检验人员定期作出评价,包括工作的准确性、工作效率、操作的安全性和职业道德不建议经常更换操作人员。实验后质量控制实验记录和文件管理 记录详细如:记录实验室温度、试剂厂名称和批号。详细的记录

24、是分析、统计、总结的基础。文件和试验记录存档时间:一般35年保存:按一定方式编号,建立借阅制度,专人保管 完整资料将为科研和法律诉讼提供可靠的证据。CD4T细胞检测文件和文件管理(1)标准操作程序文件(SOP)(2)实验原始记录表(3)CD4 T 细胞检测程序(4)填写检测结果表(5)标本的登记记录 除按照HIV检测规范要求外,CD4T淋巴细胞检测要记录采血时间和使用抗凝剂的名称,运输温度等。CD4T细胞检测文件和文件管理(6 6)建立实验室安全措施)建立实验室安全措施 参见规范(7 7)文件存档)文件存档 原始记录,热敏打印结果不易保留,可复印一份保留。计算机保留 仪器设备维修和校准记录 重

25、要记录都应该妥善存档保存15年以上。CD4绝对数产生误差的可能性13%(CD4200/ul血球记数仪WBC变异系数(CV)9.3%-17.6).自动记数淋巴细胞CV 1.9%-5.3%正常样品 CD4+T细胞百分比率和绝对值5.1%7.0%流式细胞术检测CD4和CD8T细胞的经验流式细胞仪维护日常维护、月维护异常细胞群体分析染料量CD4+T细胞实验室检测技术培训目的掌握应用流式细胞仪进行CD4+T细胞检测的原理、操作及结果分析。掌握应用流式细胞仪进行CD4+T细胞检测的生物安全保障措施。掌握应用流式细胞仪进行CD4+T细胞检测的质量保障措施。熟悉流式细胞仪的仪器校准。培训应用仪器培训应用仪器FACSCountFACSCalibur谢 谢!

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