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1、 ICS 11.020 C 04 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 30492019 血液、尿液中 6 种蘑菇毒素的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of six mushroom toxins in human urine and blood by LC-MS/MS 2019-05-27 发布 2019-06-17 实施吉林省市场监督管理厅 发 布 DB22/T 30492019 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标
2、准由吉林省卫生和计划生育委员会提出并归口。本标准起草单位：吉林省疾病预防控制中心。本标准主要起草人：刘思洁、崔勇、马杰、姚来顺、张博、石矛、张弘。DB22/T 30492019 1 血液、尿液中 6 种蘑菇毒素的测定 液相色谱-串联质谱法 警示使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问题，使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围 本标准规定了血液和尿液中-鹅膏毒肽、-鹅膏毒肽、-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽等6种蘑菇毒素的测定。本标准适用于血液和尿液中-鹅膏毒肽、-鹅膏毒肽、-鹅膏毒肽、
3、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽6种蘑菇毒素的测定。本标准的最低检测浓度为：在血液样品中，-鹅膏毒肽0.2 g/L、-鹅膏毒肽0.2 g/L、-鹅膏毒肽0.2 g/L、二羟鬼笔毒肽0.1 g/L、羧基二羟基鬼笔毒肽0.2 g/L、羧基三羟基鬼笔毒肽0.2 g/L；在尿液样品中，-鹅膏毒肽0.5 g/L、-鹅膏毒肽0.5 g/L、-鹅膏毒肽0.5 g/L、二羟鬼笔毒肽0.3 g/L、羧基二羟基鬼笔毒肽0.5 g/L、羧基三羟基鬼笔毒肽0.5 g/L。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用
4、文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 血液样品经离心得血浆，以1%乙酸的乙腈溶液涡旋提取，上清液经氮气吹干后加入初始流动相，经0.22 m滤膜过滤;尿液样品直接经0.22 m滤膜过滤后用液相-串联质谱法，电喷雾离子化（ESI）和多离子反应监测（MRM）方式进行定量测定。4 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验室用水符合GB/T 6682中一级水的要求。4.1 乙腈：色谱纯。4.2 甲醇：色谱纯。4.3 乙酸：色谱纯。4.4 乙酸铵：色谱纯。4.5 1%（V/V）乙酸的乙腈溶液。4.6 标准品 4.6.1-鹅膏
5、毒肽标准品，CAS：23109-05-9,纯度90%。DB22/T 30492019 2 4.6.2-鹅膏毒肽标准品，CAS：21150-22-1,纯度90%。4.6.3-鹅膏毒肽标准品，CAS：21150-23-2,纯度90%。4.6.4 二羟鬼笔毒肽标准品，CAS：17466-45-4,纯度90%。4.6.5 羧基二羟基鬼笔毒肽标准品，CAS：26645-35-2,纯度90%。4.6.6 羧基三羟基鬼笔毒肽标准品，CAS：58286-46-7,纯度均99%。4.7 标准溶液配制 4.7.1 标准储备液：分别精确称取经折算相当于 5.0 mg 的 6 种蘑菇毒素标准品4.6.1-4.6.6，
6、分别用甲醇4.2溶解定容至 50.0 mL,混匀。此标准储备液浓度均为 0.100 mg/mL，-20下避光保存。4.7.2 混合标准中间液：分别准确吸取上述 6 种标准储备液4.7.1各1.0 mL，用甲醇4.2定容至10.0 mL，制备成每毫升含 6 种蘑菇毒素各 10.0 g 的标准中间液，4 冰箱中保存。4.7.3 混合标准使用液：准确吸取混合标准中间液4.7.21.0 mL，用水定容至 10.0 mL，制备成每毫升含 6 种蘑菇毒素各 1.0 g 的混合标准使用液，4 冰箱中保存。4.8 材料 4.8.1 有机滤膜，0.22 m。4.8.2 水系滤膜，0.22 m。5 仪器和设备 5
7、.1 液相色谱-串联质谱仪：ESI 源。5.2 电子分析天平：感量 0.1 mg。5.3 离心机：最低转速不低于 4000 r/min。5.4 氮吹仪。5.5 涡旋混合器。6 样品 6.1 样品的采集和保存 采集人体血液（加入抗凝剂）和尿液，24 小时之内送到实验室进行测定，样品应保存在4 低温容器中。6.2 样品前处理 6.2.1 血液样品：取 5.00 mL 血液，以 1500 r/min 离心（5.3）5 min，吸取上层血浆 1.00 mL 于 10 mL离心管中，加入 3 mL 1%（V/V）乙酸的乙腈溶液(4.5)，涡旋提取（5.5）2 min 后，以 4000 r/min 离心（
8、5.3）5 min，取 2.0 mL 上清液于 10 mL 试管中，55 水浴氮气（5.4）吹干，加入 250 L 初始流动相定容，涡混震荡（5.5）1 min，经 0.22 m 滤膜（4.8.1）过滤后，待测定。6.2.2 尿液样品：取适量尿液经 0.22 m 滤膜（4.8.2）过滤后，待测定。7 试验步骤 7.1 仪器参考操作条件 7.1.1 色谱条件 DB22/T 30492019 3 7.1.1.1 色谱柱：C18 色谱柱(100 mm2.1 mm,1.8 m)或相当色谱柱。7.1.1.2 柱温：40。7.1.1.3 流动相：A 相：2 mmol/L 乙酸铵水溶液；B 相：2 mmol
9、/L 乙酸铵甲醇液。梯度洗脱条件见表1。表1 梯度洗脱条件 时间 min 流速 mL/min 流动相 A%流动相 B%0 0.3 70 30 3.5 0.3 70 30 5.0 0.3 30 70 7.0 0.3 10 90 9.0 0.3 70 30 7.1.1.4 进样体积：10 L。7.1.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子源，正电离模式，多离子反应监测MRM，毛细管电压：2.9 kV；离子源温度：150；脱溶剂气温度：500；脱溶剂气流量：800 L/h。-鹅膏毒肽、-鹅膏毒肽、-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟基鬼笔毒肽和羧基三羟基鬼笔毒肽的定性、定量离子及碰撞能量、锥孔电压见附录A。
10、7.2 标准曲线的绘制 7.2.1 血液样品标准工作曲线：在试管中分别按标准曲线的浓度加入 10.0 L、40.0 L、60.0 L、80.0 L 和 100.0L 混合标准使用液（4.7.3），加入空白血浆至 1.0 mL，混匀后放置 30 min，加入 3 mL 1%（V/V）乙酸的乙腈溶液(4.5)，与血样一起处理，混匀后过 0.22 m 滤膜（4.8.1），制作成标准工作曲线系列。7.2.2 尿液样品标准工作曲线：在试管中分别按标准曲线的浓度加入 10.0 L、40.0 L、60.0 L、80.0 L 和 100.0 L 混合标准使用液（4.7.3），加入空白尿液至 1.0 mL，混匀
11、后过 0.22 m 滤膜（4.8.2），制作成标准工作曲线系列。7.3 样品测定 将处理后的样品（6.2.1和6.2.2）直接进样，经液相色谱-质谱联用仪（5.1）分析。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。6种蘑菇毒素的标准溶液色谱图见附录B。8 试验数据处理 8.1 定性判定 在上述仪器条件下测定基质加标标准溶液及样品溶液。各检测目标化合物以保留时间和特征离子与定量离子所对应的LC-MS/MS 色谱峰面积相对丰度进行定性。要求被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物保留时间的相对偏差小于2.5%；样品特征离子的相对丰度与浓度相当混合标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不
12、超过表2的规定，即可判断样品中存在相应的被测物。DB22/T 30492019 4 表2 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度(%)50 2050 1020 10 允许的相对偏差(%)20 25 30 50 8.2 结果表示 样品中待测组分的含量以浓度单位表示，单位为微克每升（g/L），按照公式（1）计算。iVVA1（1）式中：i试样中每种蘑菇毒素的含量，单位为微克每升（g/L）；A从标准工作曲线上分别查得的试样中各蘑菇毒素的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V 所取血液、尿液的体积，单位为毫升（mL)；V1待测溶液的定容体积，单位为毫升（mL）。计算结果表示到三位有效数字。
13、9 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的20%。10 质量保证 10.1 空白分析 每次分析至少做一个实验室空白，实验室空白中每个目标化合物不得检出。10.2 校准 10.2.1 每批样品应绘制标准曲线，相关系数应0.995，否则重新绘制标准曲线。10.2.2 每 20 个样品或每批次样品（少于 20 个样品）应测定一个标准曲线中间浓度点，其测定结果与该点浓度的相对偏差应20%，否则，应重新绘制标准曲线。10.3 平行样测定 每批样品应做平行双样，平行双样测定结果的相对偏差应20%。10.4 样品加标回收率测定 每批样品应做样品加标，加标样与原样品在完全相同
14、的测试条件下进行分析。加标回收率应在60%120%之间。11 废弃物处理 实验过程中产生的废液和废物应分类收集和保管，委托有资质的单位进行处理。DB22/T 30492019 5 12 试验报告 试验报告至少应给出以下几个方面内容：试验对象；所使用的标准（包括发布或出版年号）；所使用的方法（如果标准中包括几个方法）；结果；观察到的异常现象；试验日期。DB22/T 30492019 6 A A 附 录 A（资料性附录）6 种蘑菇毒素定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量 6种蘑菇毒素定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量见表A.1。表A.1 6 种蘑菇毒素定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量 蘑菇毒素 母
15、离子（m/z）定量离子（m/z）碰撞能量（eV）定性离子（m/z）碰撞能量（eV）锥孔电压（V）-鹅膏毒肽 919.3 86.1 70 259.2 45 50-鹅膏毒肽 920.3 86.1 70 259.2 45 55-鹅膏毒肽 903.3 242.8 50 323.2 45 45 二羟鬼笔毒肽 789.6 86.1 75 157.0 65 30 羧基二羟基鬼笔毒肽 847.7 157.0 65 330.3 75 35 羧基三羟基鬼笔毒肽 863.3 156.8 65 85.8 70 35 DB22/T 30492019 7 B B 附 录 B（资料性附录）6 种蘑菇毒素的标准溶液色谱图 6种蘑菇毒素的标准溶液色谱图见图B.1。注：1.-鹅膏毒肽（-AMA）；2.-鹅膏毒肽（-AMA）；3.-鹅膏毒肽（-AMA）；4.羧基三羟基鬼笔毒肽（PSC）；5.羧基二羟基鬼笔毒肽（PCD）；6.二羟基鬼笔毒肽（POD）。图B.1 6 种蘑菇毒素的标准溶液色谱图 _ 1 23 4 5 6