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1、65.020.20B 05DB1308承德市地方标准DB1308/T 314 2022羊肚菌液体菌种生产技术规程2022-10-31 发布2022-11-01 实施承德市市场监督管理局发 布DB1308/T 3142022I前言本文件按照 GB/T 1.1-2020 标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由承德市农业农村局归口。本文件起草单位：平泉市希才应用菌科技发展有限公司。本文件主要起草人：梁晓生、刘海军、柳凤玉、李大港、张晨光、梁希才、梁宏丽、孙彦平、孟凡飞、刘绍苍、王彦玲、王帅。DB1308/T 3142022羊肚菌液体菌种生产技术规程1范围本文件规定了
2、羊肚菌液体菌种生产的生产环境、前期准备、操作流程以及各步骤的操作方法指示。本文件适用于羊肚菌液体菌种生产的过程管理。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。本文件没有规范性引用文件。3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4生产环境生产车间环境整洁，通风良好，温度2023，符合安全生产需求。5前期准备5.1制种设备由无菌空气过滤系统、温度控制系统、冷却系统、停电保护装置、耐高压罐体等组成。5.2其他设备工具发酵罐、高压灭菌锅磁力搅拌
3、机、电磁炉显微镜、摇床、电子秤、玻璃杯、500 ml三角瓶1 000ml烧杯玻璃棒、磁力搅拌子、棉塞、小勺刀、菜板、牛皮纸、绳、pH试纸等。5.3原料新鲜土豆葡萄糖粉化学纯磷酸二氢钾化学纯硫酸镁化学纯蛋白胨琼脂粉、100目豆粕粉、食品级消泡剂等。6操作流程母种扩繁培养液制作发酵罐准备原种制作检验备用。7操作方法DB1308/T 31420227.1母种扩繁培养液制作用烧杯量取1 000 ml水，放电炉上烧开，依次将豆粕5 g、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5 g倒入烧杯中，用玻璃棒不断搅拌均匀，使其完全溶解。培养液配制好后，装入500 ml三角瓶中，每瓶装150 ml，加入1颗磁
4、力搅拌子，加棉塞后再包扎牛皮纸封口。在1.5 kg/cm2压力（121）下灭菌30 min，取出冷却到30以下时，接入一块约2 cm2的斜面母种或610块2 mm2的斜面母种。于2325下静置培养48 h，再置放到复式摇床上振荡培养，振荡频率为80100次/min，振幅6 cm10 cm。如果用旋转式摇床，振荡频率为200220转/min。摇床室温控制在2425，一般7 d左右，达到培养液清澈透明，液中悬浮着大量小菌丝球，并伴有相关菇类特有的香味为宜。7.2发酵罐准备7.2.1清理发酵罐在使用之前和使用之后都要进行彻底的清洗，洗罐水由罐底排污管道排出。清洁的标准为罐内壁无悬挂物，无残留菌球，排
5、放的水清澈无污物。清洗完毕后，检查发酵罐的各个部件和控制系统，合格后方能开始工作。7.2.2灭菌和使用对于新的发酵罐、染菌的发酵罐、长时间不用的发酵罐要进行空消。首先关闭所有阀门，打开电源开关，将灭菌开关旋至开，打开蒸汽至罐内部线路所有开关，打开过滤器灭菌线路所有开关，空消压力0.1Mpa，温度119，时间30 min。空消结束后，将灭菌开关关闭，逆行关闭过滤器灭菌线路开关和蒸汽线路开关，打开排气线路开关，降压后开罐使用。7.3原种制作7.3.1预热加水至视镜下方第一颗螺钉平齐处，打开灭菌开关和夹层进出蒸汽线路开关，进行预热，每隔10 min打开进气开关搅拌1 min，预热至80时开始配料。7
6、.3.2配料称取葡萄糖7.5 kg豆粕粉1.5kg酵母膏1.5kg磷酸二氢钾500g、硫酸镁250g消泡剂600 ml800ml。将除消泡剂外的原料用罐内热水溶解后加入加料罐，吹入高温气体搅拌均匀。等罐内水温达到90后便可加料。用压力将混合均匀的营养料加入罐内，最后加入消泡剂。7.3.3灭菌将夹层蒸汽开关关闭，打开罐内蒸汽开关。将过滤器灭菌线路开关打开，开始升温灭菌。灭菌温度为119，压力0.1Mpa，时间60 min。灭菌结束后将蒸汽开关和过滤器灭菌线路开关关闭。7.3.4冷却打开排气线路开关自动降压至罐内压力为0.03 Mpa左右时，打开进气阀门，并打开自来水和冷却进排管路的开关，开始降温
7、，直至降温到培养温度24。7.3.5接种DB1308/T 3142022将摇瓶种于接种前放置磁力搅拌器上搅拌12 h，待发酵罐温度降到培养温度时开始接种。关闭进气阀门将罐内压力降至排气管微有气体排出，关闭排气阀。将火焰圈套至接种口点燃，打开接种口后，将进气开关微开，使接种口微有气体排出。将摇瓶在火焰圈的保护下打开瓶口，倒入罐内。拧紧接种口盖后用湿毛巾熄灭火焰圈。打开进出气阀门，调节罐内压力至0.03 Mpa进入培养阶段。7.3.6培养培养温度为24，压力为0.03 Mpa，培养5 h。培养过程中每天观察发酵罐压力温度气味气流量等相关数据并填写培养记录表。7.4检验7.4.1取样发酵液培养满3
8、h和5 h时各取样检验一次。取样时在火焰的保护下用无菌瓶接取少量发酵液，然后用75酒精冲洗出料口消毒。所取样液在超净工作台内接种平板和栽培包后涂片镜检。7.4.2感官检查7.4.2.1看将样品静置桌上观察。一看菌液颜色和透明度；二看菌丝形态和大小；三看上清液与沉淀的比例中菌丝体占比，第一次检验菌丝占比65%、第二次检验菌丝占比80%为合格。7.4.2.2旋手提样品瓶轻轻旋转一下，观其菌丝体的特点。醪液的粘稠度高，说明菌种性能好；稀薄表明菌球少，不宜使用。菌丝的悬浮力好，放置5 min不沉淀，表明菌种生长力强；反之，如果菌丝极易沉淀，说明菌丝已老化或死亡。7.4.2.3嗅在旋转样品后，打开瓶盖嗅
9、气味。培养好的优质液体菌种，均具有芳香气味；染杂菌的培养液则散发出酸、甜、霉、臭等各种异味。7.4.3理化试验7.4.3.1菌丝干重量取液体菌种10 ml，用水分测试仪烘干至含水量18%，然后称量菌丝干重。菌丝干重第一次检验1.5 g、第二次检验2 g为合格。7.4.3.2液体粘稠度将液体菌种置于量筒中，使用比重计进行粘稠度测量。第一次检验比重1.0、二次检验比重1.2为合格。7.4.3.3pH 值测定将液体菌种取出后，使用pH值酸度计进行测量。第一次检验pH值4.54.8、第二次检验pH值44.2为合格。DB1308/T 31420227.4.3.4菌丝活力将液体菌种菌丝球转接与平板PDA培养基上，28恒温培养24 h，菌丝球正常萌发菌丝为合格。7.5备用当平板和栽培包所接样品正常萌发，镜检无杂菌感染后，液体菌种方可投入使用。使用时在火焰的保护下连接接种管道，接种过程中罐内压力维持在0.1 Mpa。接种结束后放掉多于菌液，及时清洗发酵罐和接种管道。_