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1、ICS 07.080 B 41 备案号44781-2015DB44 广东省由巳ET目，方析、准D844/T 1411-2014 J亚群禽白血病病毒LAMP检测规程The LAMP detection of subgroup J avian leukosis virus 2014-08-18发布2014-11-18实施广东省质量技术监督局发布1 刚言牛;标准按GB/T1.1-2009的规则ill行编写。本标准的附对A为资料性附录.本标(fl:iJl广东省农业厅提出并归u。本;标准起珩单位:华南农业大学毡医学院。本标准上起草人:巴l伟j凡、罗开创、樊忠县、徐J晶刚、廖明。本标准凶-次次有J.D84
2、4/T 1411-2014 J 2 DB44/T 1411-2014 J亚群禽白血病病毒LAMP检测规程1范围本标准规定了J亚群禽臼血病病毒(ALV-)的环介导等温扩增试验(LAMP)检测规程，远用于J亚群禽臼血病病毒的快速检测。2规范性引用文件3术语和定义3.1 环介导等i.ffitt培1(loop-m甜atedisothermal ampl ification,L州的是指一种亲聚合酶(BstD N 倍的阳核酸扩3.2 4.1仪器、材料及试剂4.1.1仪器设备PCIl仪、制度电泳仪、7.K，-，.市1&11到1系统、高:i!台A离心，fJt(离心法度12000r/min以上)、台式离心机或手
3、掌式离心机(离心i草皮30 00r/min)、移液器(0守lL2此，iLlOL.10LlOO此，100L1000L)、水浴箱、旋涡振荡器。4.1.2材料O.5mL和1.5mL离心管。4.1.3口H7.4 O.OlmoJ/L磷酸盐缓冲部液(PBS)，称取磷E主主乱二纳1.096g、磷酸二氢纳0.31饱和l氧化钊8.5g，浴解于950mL?l在倒水中，完全溶解后用氮氧化制或盐酸调pH至7.4，定容至1000mL.灭菌后使用。4.1.4组织裂f眼前在10mmol/L:经甲基氨基甲惋(Tris)Immol/L EDTA;0.5%S悦。4.1.5蛋白酶K(j Omg/mLl将蛋白酶K19溶解于灭菌7J(
4、50mL中，轻轻摇动，直至完全溶解，加灭菌3 4 D844/T 1411-2014 水定容至100rnL4.1.6 RNase A(iOrng/rnl)取RNaseA O.5g且于50ml坝料离心管中。)JD入;k.菌水40mL，浴解之后注:容至50rnL.100C煮沸15m;n.级但冷1;1至在世乱，分装j币:ti子20C保存。4.1.7 75唱乙醉浴液.取无水乙醉750mL.)J日入灭茵;j(定容至1000mL.-20C且在。4.1.8 1只化乙旋(IOmg/mLl，取泯化乙绽1.Og.加入水90mL.完全溶解后定容至100mL.用侣m包装容器或移至棕色瓶中，室副呆ff.4.1.9 50X
5、Tris冰乙般也泳缓冲液(TAE)，在500mL水依次加入Tris242g、冰乙般(无水乙股)57.1 rnL、pH8.0的0.5mollL乙二Jt在Dz:.简直(EDTA)100mL.)JU水定将全1000rnL.4.1.10 lXTAE缓冲浪川非;在50XTAE缓冲液20，此.1Jn水定容至JOOOmL。4.1.11 1%琼脂糖版胶将沽净的制l夜板水平1i立何在E作台仁Ii史上合适的非t-.ili fil(j称量琼斯租111.Og.三ffJ瓶i.)JII入100mL1 X丁AE11.泳缓冲液.1J11!辩解J)j、JJ糖，和f琼月旨在lt济液冷却歪约50C1Pj,)JIl入10mg/mL淡
6、化乙)挥手液5L.充分泌合。将丑i、HR椭j妓l院溶液沿!皮板边沿级1坠1H止it.入，革举胶l早I主f;市I)I:1 1 Ilun-511l1ll左右，j:，剧院完伞凝固后，将1挝胶板放血入L主)JII入IX TAEI1.泳缓冲液的也泳槽中.士液面设过在kl眩，拔1-1-1梳子，以备)Jn伴咆泳。4.1.12电泳凝!jQ)JIl样缓冲浓:f.tE椭40.Og、pH8.o(.JO.5mol/L EDTA 20mL、10%1一炕基磺酸制(SDS)5mL、决自由监50.Omg、水75mL先将庶糖完全浴血if-，j(.然后旅顺序)JO入只余1l-1&分，完今溶解后泪匀，!IJO.22m(J微孔Jl!
7、tt泌除菌4C保行各JIJ。4.2样品的采集制备及DNA的提取4.2.1样品的采集i菌操作采集疑似州鸡的肘简样品或脚l脏、肝脏、肾脏样品1-2 g。4.2.2样品的和l备I二4.2.1中取在(.J样品巾!JIIPS 2倍ll:liJfl窍气乍h且匀浆.1识50L匀浆ff1.5mL鸟心竹。4.2.3 DNA的提取在4.2.21的1.5101.).勾心11)JII入500L组织裂fli液，加IOrng/mL的蛋白酶K5L.i昆匀，1 J 60C水浴过夜:力n入tT体积的饱和苯阶级仿异J且nlJ.(1卓有!比25:24:1).充分振荡，11i匀.12000 r/m;n 尚心10min:吸取上肖波青新
8、的1.5mL离心竹，力11入匀体积的氛仿，充分振荡，混匀.12000 r/min r心10min:吸取u市浓宜于新的1.5mL离心它，川入10mg/mL(j(J RNase A 3L.37C孵育30m;n.川入非休:f异丙醉，泌匀.12000,./mi n/f!;心5m;n.#J;U市浓:加入70%乙醉ImL.混匀，以12000r/m;n 肉心5mln.至去Jillil，风f15min,jm入50L火IJ.浴解，置于20C备用。4.3 LAMP中生测E.个O.5mL的火菌离心怡，1依次加入以F成分灭凶水2L.IOX8sl缓J中泌2.5L.二瞬般脱吁在核背股(d1TPs)混介液(手中2.5mrn
9、ol/Ll 8L.内引物rIP启1日IP(1mol/L)各1.0L.外1;I 物F3￥I B3(1mol/Ll得0.251.Sl D:lA聚合酶(8U/uLl1.0L.甜来碱(claine)(5mol/LJ 2川.MgSO.(25mrnol/LJ 4L.SYBR green(100pmo!/L)2L.4.2.3巾制备的校根DNA1.0 1.up ALV-j LAMP(.J反应体系25L.轻绥混匀后.:p.j.该离心ff笠60C水浴孵.反应时间为Ih.同H、l设IT.斗、)JIl模板的WJ性对照，设立U虫11ALV-J作为榄板DNArt-J阳性对照。反应结束盯，nJ以商接观然反!但勾心ti中颜色
10、的改变-*户I)Jt绊，果。内才|物FlP和lP rr-列、外引物F3手1183!于31)参.l!.附求A1.1.或者再经85C灭沼2min，取5LLAMP扩销产物在1%JXOJ旨糖i疑l捡(含O.5g/ml澳化乙位:JIl!.2 DB44/T 1411-2014 泳判定结果。废弃的涣化乙饭或含有澳化乙旋的电泳缓冲液、候!佼等茧，集中回收处理。4.4结果要11定4.4.1基于ALV-JLAMP反应溶液颜色变化的结果判定当阴性对H扩增产物反应溶液呈桶红色，且ALY-1IWI:对nnLAMP 扩增产物反应浴液呈黄绿色时，若被检样品的LAMP扩增产物反应浴液呈ik绿色，则判定被检样品为ALY-阳性，
11、若被检样品的LAMP扩增产物反应溶液仍呈桶红色，则判定被检样品为ALV-阴性。该LAMP检测的肉眼观察结果参见附法A l.2.1.4.4.2基于ALV-JLAMP反应溶液;疑胶电泳的结果判定当阴性对!(扩硝产物的电泳结果:tDNA梯皮带，且ALV-J 日格，对照LAMP扩增产物的电泳结果呈现DNA梯度带时，若被检样品的LAMP扩增产物反应溶液呈现DNA梯皮带，则判定被检样tiI，:J.JALV-阳性:若被检样品的LAMP扩增产物反应无DNA梯皮带，则判定被检样品为ALV-19i性。i在LMU枪测的电泳观察结果参见附录Al.2.2。3、56 0844/T 1411-2014 附录A(资料性附录)
12、1 ALY-J LAMP号|物序列及检测结果判定图1.1 ALY-J LAMP检i911J引物1.1.1 ALV-J LAMI检测引物序列r-3 5 GGRAAGGTGAGCAAGAAGG 3 113 5 YGTCTTATTTGCCCAGGTGA 3 r-IP 5 GTAACCTCTCGAYGGCtGCACTCTAAGAAGiAGCCGCCA 3 BTP 5 ATTTCYGTTGTCCCAGGGGTGCCCACACGTTTCCrGGTTG 3 iL R代友G/A碱蓓，Y f巳农C/T碱J在1.1.2 ALY I.AP枪测JI物针对的靶J，!;I生|似1J I物FIP和l引物r-3f亿于J亚1佯
13、禽(I Jfu.M Jj rtJ J.反咆株IIPRS-103株的poJJ，I对片段:1物日11和才|物113仪FJ El悻禽II血病病得原地株HPRS103株rJgp85 J，W;I片段(ALY-J IIPHS-I 03林Genllank注册口Z16390)。1.2 LAMP检测结果判定图1.2.1丛rALY-J LAMP反应溶液颜色变化的纣贝判应图IALV-J LAMP扩增的可视化颜色变化判定SYR Grccn r荧光也色观察Posi liv8:阳性反问:Ncga l i vc:IIJ i!:Ji.州714 1.2.2基于ALY-LAMP反两溶液剧佼也泳的纺织判定产物。)泪。样/;111c 8.ALY bp 0844/T 1411-2014 5 l 叶FON-FF寸F咕寸。r fJ;地方标准J亚群禽白血病病毒LAMP检测规程D11/T l4l l-20l4*广斗、l标准化研究院组织印刷1、州市内J3Ii区付ml目563.J川01.但邮政编ll:510220 闷址www.bz360.orgII!舌。20-84250337南J市民科人学广州广P.印刷厂8