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1、第第7章章 发酵工艺控制发酵工艺控制方海红 微生物学教研室发酵工艺控制最优化发酵工艺控制最优化 在特定的发酵生产过程中，生产效率的高低取决于工艺和工艺控制的最优化，即能否实现生产过程内的最优化控制。生产过程最优化控制的实现，包含了从明确目标到目标值实施等全部内容。如何实施最佳工艺？实施最佳工艺就是通过优化管理，严格执行发酵工艺，将发酵控制在最佳状态，从而最终实现目标值，达到最大的比产物生成速率。要实现最佳工艺必须对诸如温度、pH、溶解氧浓度、泡沫等进行控制。明确控制目标 明确影响因素 确定实现目标值的方法 确定最佳工艺 实施最佳工艺 发酵工艺控制最优化发酵工艺控制最优化问题问题第一节第一节 温
2、度变化及其控制温度变化及其控制 一、温度对生长的影响一、温度对生长的影响不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于026oC生生长，嗜温菌适应于长，嗜温菌适应于1543oC生长，嗜热菌适应于生长，嗜热菌适应于3765oC生长，嗜高温菌适应于生长，嗜高温菌适应于65oC以上生长以上生长 每种微生物对温度的要求可用最适温度、最高温每种微生物对温度的要求可用最适温度、最高温度、最低温度来表征。在最适温度下，微生物生度、最低温度来表征。在最适温度下，微生物生长迅速；超过最高温度微生
3、物即受到抑制或死亡；长迅速；超过最高温度微生物即受到抑制或死亡；在最低温度范围内微生物尚能生长，但生长速度在最低温度范围内微生物尚能生长，但生长速度非常缓慢，世代时间无限延长。在最低和最高温非常缓慢，世代时间无限延长。在最低和最高温度之间，微生物的生长速率随温度升高而增加，度之间，微生物的生长速率随温度升高而增加，超过最适温度后，随温度升高，生长速率下降，超过最适温度后，随温度升高，生长速率下降，最后停止生长，引起死亡。最后停止生长，引起死亡。微生物受高温的伤害比低温的伤害大，即超微生物受高温的伤害比低温的伤害大，即超过最高温度，微生物很快死亡；低于最低温过最高温度，微生物很快死亡；低于最低温
4、度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死度，微生物代谢受到很大抑制，并不马上死亡。这就是菌种保藏的原理。亡。这就是菌种保藏的原理。1 1、微生物对温度的要求不同与它们的膜结构物、微生物对温度的要求不同与它们的膜结构物理化学性质有密切关系理化学性质有密切关系根据细胞膜的液体镶嵌模型，细胞在正常生理条根据细胞膜的液体镶嵌模型，细胞在正常生理条件下，膜中的脂质成分应保持件下，膜中的脂质成分应保持液晶状态液晶状态，只有当只有当细胞膜处于液晶状态，才能维持细胞的正常生理细胞膜处于液晶状态，才能维持细胞的正常生理功能，使细胞处于最佳生长状态功能，使细胞处于最佳生长状态微生物的生长温度与细胞膜的液晶温度范围相
5、一微生物的生长温度与细胞膜的液晶温度范围相一致。致。二、微生物与温度相关性的原理二、微生物与温度相关性的原理什么是液晶状态？什么是液晶状态？液晶状态是指某些有机物在发生固相到液相转变时的液晶状态是指某些有机物在发生固相到液相转变时的过渡状态称为液晶态。过渡状态称为液晶态。由固态转变为液晶态的温度称为熔点，以由固态转变为液晶态的温度称为熔点，以T1表示；表示；由液晶态转变为液态的温度称为清亮点，以由液晶态转变为液态的温度称为清亮点，以T2表示。表示。T1与与T2之间的温度称为液晶温度范围。之间的温度称为液晶温度范围。那么为什么不同微生物对温度的要求不同呢？根据细那么为什么不同微生物对温度的要求不
6、同呢？根据细胞膜脂质成分分析表明，不同最适温度生长的微生物，胞膜脂质成分分析表明，不同最适温度生长的微生物，其膜内磷脂组成有很大区别。嗜热菌只含饱和脂肪酸，其膜内磷脂组成有很大区别。嗜热菌只含饱和脂肪酸，而嗜冷菌含有较高的不饱和脂肪酸。而嗜冷菌含有较高的不饱和脂肪酸。2 2、蛋白质结构、蛋白质结构人们采用二种方案来研究酶在低温条件下的结人们采用二种方案来研究酶在低温条件下的结构完整性和催化功能：构完整性和催化功能：(1)(1)通过自然或诱导突变，通过自然或诱导突变，将特定残基发生改变的蛋白与其天然结构进行将特定残基发生改变的蛋白与其天然结构进行对比；对比；(2)(2)对比同属嗜热、嗜温及嗜冷菌
7、的蛋白对比同属嗜热、嗜温及嗜冷菌的蛋白结构结构通过对嗜冷酶的蛋白质模型和通过对嗜冷酶的蛋白质模型和X X一射线衍射分析表一射线衍射分析表明，嗜冷酶分子间的作用力减弱，与溶剂的作用加明，嗜冷酶分子间的作用力减弱，与溶剂的作用加强，酶结构的柔韧性增加，使酶在低温下容易被底强，酶结构的柔韧性增加，使酶在低温下容易被底物诱导产生催化作用物诱导产生催化作用 嗜冷菌具有在嗜冷菌具有在0 0o oC C合成蛋白质的能力。这是由于合成蛋白质的能力。这是由于其核糖体、酶类以及细胞中的可溶性因子等对其核糖体、酶类以及细胞中的可溶性因子等对低温的适应，蛋白质翻译的错误率最低。许多低温的适应，蛋白质翻译的错误率最低。
8、许多中温菌不能在中温菌不能在O Oo oC C合成蛋白质，一方面是由于其合成蛋白质，一方面是由于其核糖体对低温的不适应，翻译过程中不能形成核糖体对低温的不适应，翻译过程中不能形成有效的起始复合物，另一方面是由于低温下细有效的起始复合物，另一方面是由于低温下细胞膜的破坏导致氨基酸等内容物的泄露。胞膜的破坏导致氨基酸等内容物的泄露。3 3、蛋白质合成、蛋白质合成4 4、合成冷休克蛋白、合成冷休克蛋白 低温微生物适应低温的另一机制是合成冷休克低温微生物适应低温的另一机制是合成冷休克蛋白。将大肠杆菌从蛋白。将大肠杆菌从3737o oC C突然转移到突然转移到1010o oC C条件时细条件时细胞中会诱
9、导合成一组冷休克蛋白，它们对低温的生胞中会诱导合成一组冷休克蛋白，它们对低温的生理适应过程中发挥着重要作用，检测嗜冷酵母的冷理适应过程中发挥着重要作用，检测嗜冷酵母的冷休克反应，发现冷刺激后冷休克蛋白在很短时间内休克反应，发现冷刺激后冷休克蛋白在很短时间内大量产生。大量产生。耐冷菌由于生活在温度波动的环境中，它们必耐冷菌由于生活在温度波动的环境中，它们必须忍受温度的快速降低，这与它们产生的冷休克蛋须忍受温度的快速降低，这与它们产生的冷休克蛋白是密切相关的。白是密切相关的。二、温度的影响与控制二、温度的影响与控制（一）温度对发酵的影响（一）温度对发酵的影响1 1、温度对微生物细胞生长的影响、温度
10、对微生物细胞生长的影响发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。一个最适温度。从阿累尼乌斯方程式可以看到从阿累尼乌斯方程式可以看到 dlnKr/dt=E/RT2 积分得积分得 E=E活化能活化能Kr速率常数速率常数K与温度有关与温度有关E越大温度变化对越大温度变化对K的影响越大的影响越大温度对细菌的生长、产物合成的影响可能是不同的温度对细菌的生长、产物合成的影响可能是不同的青青 霉霉 素素12oC30oC2.2.温度对产物形成的影响温度对产物形成的影响3.3.温度影响发酵液的物理性质温度影响发酵液的物理性质 温度还可以通过改变发酵液的
11、物理性质,间接影响微生物的生物合成。如:温度对氧在发酵液中的溶解度就有很大的影响。4 4、温度影响生物合成的方向、温度影响生物合成的方向 四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，四环素产生菌金色链霉菌同时产生金霉素和四环素，当温度低于当温度低于30oC时，这种菌合成金霉素能力较强；温度时，这种菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到提高，合成四环素的比例也提高，温度达到35oC时，金时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。霉素的合成几乎停止，只产生四环素。温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解
12、吸收。因此对发酵过程中的温影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制。度要严格控制。三、发酵过程引起温度变化的因素三、发酵过程引起温度变化的因素（一）发酵热（一）发酵热Q Q发酵发酵发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。所谓发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量所谓发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。什。什么叫净热量呢？在发酵过程中产生菌分解基质产生么叫净热量呢？在发酵过程中产生菌分解基质产生热量，机械搅拌产生热量，而罐壁散热、水分蒸发、热量，机械搅拌产生热量，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失空气排气带走热量
13、。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。发酵热引起发酵液的热量的代数和就叫做净热量。发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热大，温度上升快，发酵热小，的温度上升。发酵热大，温度上升快，发酵热小，温度上升慢。温度上升慢。现在来分析发酵热产生和散失的各因素。现在来分析发酵热产生和散失的各因素。1 1、生物热、生物热Q Q生物生物 在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如成高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合）提供细胞合成和代谢产
14、物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫散发出来的热就叫生物热生物热。l生物热与发酵类型有关生物热与发酵类型有关微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多一摩尔葡萄糖彻底氧化成一摩尔葡萄糖彻底氧化成CO2和水和水好氧：产生好氧：产生287.2千焦耳热量，千焦耳热量，183千焦耳转变为高能化合物千焦耳转变为高能化合物 104.2千焦以热的形式释放千焦以热的形式释放厌氧：产生厌氧：产生22.6千焦耳热量，千焦耳热量，9.6千焦耳转变为高能化合物千焦耳转变为高能化合物 13千焦以
15、热的形式释放千焦以热的形式释放二个例子中转化为高能化合物分别为二个例子中转化为高能化合物分别为63.7和和42.6l 培养过程中生物热的产生具有培养过程中生物热的产生具有强烈的时间性。强烈的时间性。生物热的大小与呼吸作用强弱有关生物热的大小与呼吸作用强弱有关 在培养初期，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，在培养初期，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，产生热量较少。产生热量较少。菌体在对数生长期时，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体在对数生长期时，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体也较多，所以产生的热量多，温度上升快，必须注意控菌体也较多，所以产生的热量多，温度上升快，必须注意控制温度。制温
16、度。培养后期，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内的酶培养后期，菌体已基本上停止繁殖，主要靠菌体内的酶系进行代谢作用，产生热量不多，温度变化不大，且逐渐减系进行代谢作用，产生热量不多，温度变化不大，且逐渐减弱。弱。如果培养前期温度上升缓慢，说明菌体代谢缓慢，发酵如果培养前期温度上升缓慢，说明菌体代谢缓慢，发酵不正常。如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，此外培不正常。如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，此外培养基营养越丰富，生物热也越大。养基营养越丰富，生物热也越大。2 2、搅拌热、搅拌热Q Q搅拌搅拌 在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机
17、械运动，造成液体之间，液体与搅拌器发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观的热量。搅拌热与搅等设备之间的摩擦，产生可观的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关，可用下式计算：拌轴功率有关，可用下式计算：Q搅拌搅拌P8604186.8（焦耳（焦耳/小时）小时）P搅拌轴功率搅拌轴功率 4186.8机械能转变为热能的热功当量机械能转变为热能的热功当量电机功率电机功率P=E额定电压额定电压I额定电流额定电流cos功率因素，功率因素，1千瓦时千瓦时8604186.8焦耳焦耳3 3、蒸发热、蒸发热Q Q蒸发蒸发 通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸
18、发所需的热量叫所需的热量叫蒸发热蒸发热。此外，排气也会带走部分。此外，排气也会带走部分热量叫显热热量叫显热Q显热显热，显热很小，一般可以忽略不计。，显热很小，一般可以忽略不计。4 4、辐射热、辐射热Q Q辐射辐射 发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。辐射热的大小取决于罐温分热通过罐体向外辐射。辐射热的大小取决于罐温与环境的温差。冬天大一些，夏天小一些，一般不与环境的温差。冬天大一些，夏天小一些，一般不超过发酵热的超过发酵热的5。Q发酵发酵Q生物生物Q搅拌搅拌Q蒸发蒸发Q辐射辐射（二）发酵热的测定（二）发酵热的测定 有二种发酵热测
19、定的方法。一种是用冷却水有二种发酵热测定的方法。一种是用冷却水进出口温度差计算发酵热。在工厂里，可以通进出口温度差计算发酵热。在工厂里，可以通过测量冷却水进出口的水温，再从水表上得知过测量冷却水进出口的水温，再从水表上得知每小时冷却水流量来计算发酵热。每小时冷却水流量来计算发酵热。Q发酵发酵GCm(T出出T进进)Cm水的比热水的比热G冷却水流量冷却水流量 另一种是根据罐温上升速率来计算。先自控，另一种是根据罐温上升速率来计算。先自控，让发酵液达到某一温度，然后停止加热或冷却，使让发酵液达到某一温度，然后停止加热或冷却，使罐温自然上升或下降，根据罐温变化的速率计算出罐温自然上升或下降，根据罐温变
20、化的速率计算出发酵热。发酵热。根据化合物的燃烧值估算发酵过程生物热的近似值。根据化合物的燃烧值估算发酵过程生物热的近似值。因为热效应决定于系统的初态和终态，而与变化途径因为热效应决定于系统的初态和终态，而与变化途径无关，反应的热效应可以用燃烧值来计算，特别是有无关，反应的热效应可以用燃烧值来计算，特别是有机化合物，燃烧热可以直接测定。反应热效应等于反机化合物，燃烧热可以直接测定。反应热效应等于反应物的燃烧热总和减去生成物的燃烧热的总和。应物的燃烧热总和减去生成物的燃烧热的总和。H（H）反应物反应物（H）产物产物如谷氨酸发酵中主要物质的燃烧热为：如谷氨酸发酵中主要物质的燃烧热为：葡萄糖葡萄糖 1
21、59555.9KJ/Kg谷氨酸谷氨酸 15449.3KJ/Kg玉米浆玉米浆 12309.2KJ/Kg菌体菌体 20934KJ/Kg尿素尿素 10634.5KJ/Kg可根据实测发酵过程中物质平衡计算可根据实测发酵过程中物质平衡计算生物热生物热。例。例如某味精厂如某味精厂50M3发酵罐发酵过程测定结果的主要发酵罐发酵过程测定结果的主要物质变化如表：物质变化如表：发发酵酵时间时间（h）0661212181831糖糖3730.324.041.7谷氨酸谷氨酸 5.9 15.4 23.9尿素尿素2.96.0菌体菌体 4.8 6.0 1.2玉米玉米浆浆2.43.00.6发酵发酵1218小时的生物热为：小时的
22、生物热为：Q生物生物24159555.90.612309.2610634.51.22093415.415449.3191098.1KJ/M3191098.1631849.7每小时的生物热为每小时的生物热为31849.7KJ/M3四、最适温度的选择四、最适温度的选择1 1、根据菌种及生长阶段选择、根据菌种及生长阶段选择微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。求的温度范围也不同。如黑曲霉生长温度为如黑曲霉生长温度为37oC，谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为3032oC，青霉菌生长温度为青霉菌生长
23、温度为30oC。在发酵在发酵前期前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；在在中期中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以延緩衰老因此中期温度要稍低一些，可以延緩衰老。因。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。较严密有利于产物合成。发酵发酵后期后期
24、，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又又提高温度，刺激产物合成到放罐提高温度，刺激产物合成到放罐。如四环素生长阶段。如四环素生长阶段28oC，合成期合成期26oC后期再升温；黑曲霉生长后期再升温；黑曲霉生长37oC，产糖化酶，产糖化酶3234oC。但也有的菌种产物形成比生长温度高但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌。如谷氨酸产生菌生长生长3032oC，产酸，产酸3437oC。最适温度选择要根据菌种与。最适温度选择要根据菌种与发酵阶段做试验。发酵阶段做试验。l根据生长阶段选择根据生长阶段选择例：例：林可霉素发酵的变温培养林可霉素发酵
25、的变温培养问题的提出问题的提出 接种后接种后10h10h左右已进入对数生长期，随后是左右已进入对数生长期，随后是10h10h左右的加速生长期，在左右的加速生长期，在40h40h左右对数生长期基左右对数生长期基本完成，在本完成，在50h50h左右转入生产期左右转入生产期主要问题：主要问题：如何维持适度的菌体浓度和延长分泌期？如何维持适度的菌体浓度和延长分泌期？适当降低培养温度可以延缓菌体的衰老和维持相适当降低培养温度可以延缓菌体的衰老和维持相当数量的有强生产能力的菌丝体存在当数量的有强生产能力的菌丝体存在l根据生长阶段选择温度根据生长阶段选择温度变温培养的正交设计变温培养的正交设计结论：结论：前
26、前60h60h按按3131控制，缩短了适应期使发酵控制，缩短了适应期使发酵提前转入生产阶段，同时菌丝体已有相当量的积提前转入生产阶段，同时菌丝体已有相当量的积累，为大量分泌抗生素提供了物质基础累，为大量分泌抗生素提供了物质基础6060小时后将罐温降至小时后将罐温降至3O3O使与抗生素合成有关的使与抗生素合成有关的酶的活性增强，抗生素分泌量有所增加，同时因酶的活性增强，抗生素分泌量有所增加，同时因分泌期的延长有利于进一步积累抗生素分泌期的延长有利于进一步积累抗生素发酵进入后期罐温再回升至发酵进入后期罐温再回升至31 31 使生产菌在生命使生产菌在生命的最后阶段最大限度的合成和排出次级代谢产物。的
27、最后阶段最大限度的合成和排出次级代谢产物。2 2、根据培养条件选择、根据培养条件选择温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。用快，会使菌过早自溶。3 3、根据菌生长情况、根据菌生长情况菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，
28、慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。五、利用温度控制提高产量五、利用温度控制提高产量例例1 利用热冲击处理技术提高发酵甘油的产量利用热冲击处理技术提高发酵甘油的产量背景：背景：（1）酵母在比常规发酵温度髙）酵母在比常规发酵温度髙10200C的温度下的温度下经受一段时间刺激后，胞内海藻糖的含量显著增加。
29、经受一段时间刺激后，胞内海藻糖的含量显著增加。（2）Lewis发现热冲击能提高细胞对盐渗透压的耐发现热冲击能提高细胞对盐渗透压的耐受力受力（3）Toshiro发现热冲击可使胞内发现热冲击可使胞内3磷酸甘油脱磷酸甘油脱氢酶的活力提高氢酶的活力提高1525，并导致甘油产量提高，并导致甘油产量提高实验：实验：甘油发酵是在髙渗透压环境中进行的，因此甘油发酵是在髙渗透压环境中进行的，因此可望通过热冲击来提高发酵甘油的产量可望通过热冲击来提高发酵甘油的产量正交条件正交条件A 冲击温度（冲击温度（0C）40，45，50 B 开始时机（开始时机（h）8，16，30 C 冲击时间（分）冲击时间（分）15，30，
30、60结果发酵结果发酵16小时，小时，450C冲击冲击60分钟最佳，发酵分钟最佳，发酵96小时后甘油浓度提高小时后甘油浓度提高32.6，发酵罐实验见图，发酵罐实验见图（A）16h,450C,30min（B）12h,450C,30minA 温度；温度；B 开始时机；开始时机；C 冲击时间冲击时间A比比B好好例例2 重组大肠杆菌人重组大肠杆菌人Cu/Zn-SOD的高表达的高表达Lac启动子，用乳糖作诱导剂启动子，用乳糖作诱导剂 270C 300C 340C 370CSOD 4966 14270 6590 4638比活比活 810 1471 679 526蛋白蛋白 6.129 9.70 9.79 11
31、.88OD600 7.41 10.72 11.78 24.77原因：原因：1、乳糖被用于合成菌体和其它蛋白，减少了合、乳糖被用于合成菌体和其它蛋白，减少了合成成SOD的原料，随着温度升高，蛋白和菌浓都的原料，随着温度升高，蛋白和菌浓都增加。增加。2、高温下可能、高温下可能SOD降解速率增加，杂蛋白增降解速率增加，杂蛋白增加加3、低温下由于比生长速率低，质粒脱落减少、低温下由于比生长速率低，质粒脱落减少4、低温下菌的衰老减缓，死亡率低、低温下菌的衰老减缓，死亡率低小小 结结微生物最适生长温度微生物最适生长温度微生物对温度的要求不同与它们的膜结构有关微生物对温度的要求不同与它们的膜结构有关微生物的
32、生长温度与细胞膜的微生物的生长温度与细胞膜的液晶温度液晶温度范围相范围相一致一致微生物对温度的要求与微生物对温度的要求与酶分子结构的区别有关，酶分子结构的区别有关，如蛋白构象稳定性因素改变，活性位点关键区如蛋白构象稳定性因素改变，活性位点关键区域氨基酸的取代，离子束缚作用域氨基酸的取代，离子束缚作用(ion binding)减弱，蛋白核心区域疏水作用下降等减弱，蛋白核心区域疏水作用下降等温度对发酵的影响：温度对发酵的影响：温度影响反应速率温度影响反应速率温度影响发酵方向温度影响发酵方向最最适适温温度度的的选选择择根据菌种根据菌种生长阶段选择生长阶段选择根据培养条件选择根据培养条件选择菌种的生长
33、情况菌种的生长情况发酵过程引起温度变化的因素发酵过程引起温度变化的因素发酵热是引起发酵过程温度变化的原因发酵热是引起发酵过程温度变化的原因Q发酵发酵Q生物生物Q搅拌搅拌Q蒸发蒸发Q辐射辐射生物热的定义，产生的原因：基质代谢。它生物热的定义，产生的原因：基质代谢。它与菌种、发酵类型、生长阶段、营养条件有与菌种、发酵类型、生长阶段、营养条件有关关搅拌热与搅拌功率有关搅拌热与搅拌功率有关发酵热测定发酵热测定:冷却容量冷却容量 燃烧热燃烧热思考题思考题1。发酵热的定义发酵热的定义2。生物热的大小与哪些因素有关？生物热的大小与哪些因素有关？3。温度对发酵有哪些影响？温度对发酵有哪些影响？4。发酵过程温度
34、的选择有什么依据？发酵过程温度的选择有什么依据？第二节第二节 pHpH对发酵的影响及控制对发酵的影响及控制 pH是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。行，所以是十分重要的参数。发酵过程中发酵过程中pH是不断变化的，通过观察是不断变化的，通过观察pH变变化规律可以了解发酵的正常与否化规律可以了解发酵的正常与否大多数微生物生长都有最适大多数微生物生长都有最适pHpH范围范围 细菌：细菌：6.36.37.57.5 霉菌和酵母：霉菌和酵母：3 36 6 放线菌：放线菌：7 78 8 微生物生长最适微生物生长最适pHpH与产物积累最适与产物
35、积累最适pHpH不一定一不一定一致致 例如例如：链霉素生长最适：链霉素生长最适pH:6.3pH:6.36.96.9 形成产物最适形成产物最适pH:6.7pH:6.77.37.3n例如：生产利福霉素的地中海诺卡菌进行发酵研究，pH为6.0,6.8,7.5三个出发值，结果发现pH为6.8,7.5时，最终发酵液的pH都达到7.5左右，菌丝生长和发酵单位都达到正常水平；pH为6.0时，发酵中期的pH只有4.5，菌浓仅为20%，发酵单位为零。这说明菌体仅有一定的自调能力。发酵过程pH值变化的规律性生长阶段生长阶段生长阶段生长阶段pHpHpHpH有上升或下有上升或下有上升或下有上升或下降的趋势降的趋势降的
36、趋势降的趋势生产阶段生产阶段生产阶段生产阶段pHpHpHpH趋于稳趋于稳趋于稳趋于稳定，维持在最适合定，维持在最适合定，维持在最适合定，维持在最适合产物合成的范围产物合成的范围产物合成的范围产物合成的范围菌体自溶阶菌体自溶阶菌体自溶阶菌体自溶阶段段段段pHpHpHpH上升，上升，上升，上升，代谢终止代谢终止代谢终止代谢终止一、发酵过程一、发酵过程pHpH变化的原因变化的原因 1 1、基质代谢、基质代谢（1）糖代谢）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，下降。糖缺乏，pH上升，是补料上升，是补料的标志之一的标志之一（2）氮代
37、谢）氮代谢 当氨基酸中的当氨基酸中的-NH2被利用后被利用后pH会下会下降；尿素被分解成降；尿素被分解成NH3，pH上升，上升，NH3利用后利用后pH下下降，当碳源不足时氮源当碳源利用降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。上升。（3）生理酸碱性物质利用后）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降会上升或下降n生理碱性物质 有机氮源和某些无机氮源的代谢、玉米浆中的乳酸被氧化后可使pH上升，这些物质被称为生理碱性物质。n生理酸性物质 碳源的代谢，如糖类不完全氧化时产生的有机酸，脂肪不完全氧化产生的脂肪酸，或者某些铵盐氧化后产生的硫酸等，可使pH下降，这些物质被称为生理酸性物质。2 2、产物形成产物形
38、成 某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变变化。如有机酸类产生使化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。上升。3 3、菌体自溶菌体自溶，pH上升，发酵后期，上升，发酵后期，pH上升。上升。二、二、pHpH对发酵的影响对发酵的影响 例例 pH对林可霉素发酵的影响对林可霉素发酵的影响 林林可可霉霉素素发发酵酵开开始始，葡葡萄萄糖糖转转化化为为有有机机酸酸类类中中间间产产物物，发发酵酵液液pH下下降降，待待有有机机酸酸被被生生产产菌菌利利用用，pH上上升升。若若不不及及时时补
39、补糖糖、(NH4)2SO4或或酸酸，发发酵酵液液pH可可迅迅速速升升到到8.0以以上上，阻阻碍碍或或抑抑制制某某些些酶酶系系，使使林林可可霉霉素素增增长长缓缓慢慢，甚甚至至停停止止。对对照照罐罐发发酵酵66小小时时pH达达7.93，以以后后维维持持在在8.0以以上上至至115小小时，菌丝浓度降低，时，菌丝浓度降低，NH2-N升高，发酵不再继续。升高，发酵不再继续。发发酵酵15小小时时左左右右，pH值值可可以以从从消消后后的的6.5左左右右下下降降到到5.3，调调节节这这一一段段的的pH值值至至7.0左左右右，以以后后自自控控pH，可可提提高高发发酵酵单位。单位。1、实例、实例pH7.0t不调不
40、调pH调调pH效价效价pH例：例：培养基初始培养基初始pHpH值对漆酶分泌的影响值对漆酶分泌的影响pH在在47范围内产酶最高范围内产酶最高2 2、pHpH对发酵的影响对发酵的影响（1）pH影影响响酶酶的的活活性性。当当pH值值抑抑制制菌菌体体某某些些酶酶的活性时使菌的新陈代谢受阻的活性时使菌的新陈代谢受阻（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的
41、解离值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用从而影响微生物对这些物质的利用（4）pH影响代谢方向影响代谢方向 pH不不同同，往往往往引引起起菌菌体体代代谢谢过过程程不不同同，使使代代谢谢产产物物的的质质量量和和比比例例发发生生改改变变。例例如如黑黑曲曲霉霉在在pH23时时发发酵酵产产生生柠柠檬檬酸酸，在在pH近近中中性性时时，则产生草酸。则产生草酸。谷谷氨氨酸酸发发酵酵，在在中中性性和和微微碱碱性性条条件件下下积积累累谷谷氨氨酸酸，在在酸酸性性条条件件下下则则容容易易形形成成谷谷氨氨酰酰胺胺和和N-乙乙酰谷氨酰胺酰谷氨酰胺(5)pH影响菌体的形态影响菌体的形态如：
42、产黄青霉细胞壁的厚度和菌丝的长度均随如：产黄青霉细胞壁的厚度和菌丝的长度均随pH的的变化而变化。变化而变化。（6）pH影响产物的稳定性影响产物的稳定性如：塞纳霉素的发酵中，如：塞纳霉素的发酵中，pH6.77.5之间抗生素产之间抗生素产量、稳定性、半衰期均稳定，但超出这个范围则反之。量、稳定性、半衰期均稳定，但超出这个范围则反之。不同不同pHpH值对菌体的形态影响很大，当值对菌体的形态影响很大，当pHpH值高于值高于7.57.5时，菌时，菌体易于老化，呈现球状；当体易于老化，呈现球状；当pHpH值低于值低于6.56.5时菌体同样受抑时菌体同样受抑制，易于老化。而在制，易于老化。而在7.27.2左
43、右时，菌体是处于产酸期，呈左右时，菌体是处于产酸期，呈现长的椭圆形；在现长的椭圆形；在6.96.9左右时，菌体处于生长期，呈左右时，菌体处于生长期，呈“八八”字形状并占有绝对的优势。字形状并占有绝对的优势。pH对L-异亮氨酸发酵菌的影响3 3、pHpH在微生物培养的不同阶段有不同的影响在微生物培养的不同阶段有不同的影响 生长合成pH对菌体生长影响比产物合成影响小对菌体生长影响比产物合成影响小例例 青青霉霉素素：菌菌体体生生长长最最适适pH3.56.0,产产物物合合成成最最适适pH7.27.4 四四环环素素：菌菌体体生生长长最最适适pH6.06.8，产产物物合合成成最最适适pH5.86.0XpH
44、四四环环素素4 4、最佳最佳pHpH的确定的确定配制不同初始配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况的培养基，摇瓶考察发酵情况pH对产海藻酸裂解酶的影响对产海藻酸裂解酶的影响pH对海藻糖水解酶产生的影响对海藻糖水解酶产生的影响pH菌浓菌浓 pH酶活酶活n发酵过程的pH控制pH对谷氨酰胺转氨酶活力的影响对谷氨酰胺转氨酶活力的影响 pH对热凝胶生产的影响对热凝胶生产的影响 热凝胶发酵菌体生长和热凝胶合成是非偶联的，热凝胶发酵菌体生长和热凝胶合成是非偶联的，整个发酵过程可以分成两个阶段：前整个发酵过程可以分成两个阶段：前10 h是菌体生是菌体生长期，之后热凝胶开始合成，至发酵结束是热凝胶长期，之后
45、热凝胶开始合成，至发酵结束是热凝胶合成期。合成期。在菌体生长期，在菌体生长期，DO 直线下降，培养液中的直线下降，培养液中的pH也迅也迅速下降。速下降。10 h左右，菌体质量浓度达到最大值，左右，菌体质量浓度达到最大值，DO 和和pH降至最低点（降至最低点（5.45.6），菌体生长结束。此），菌体生长结束。此后进入热凝胶合成期。后进入热凝胶合成期。试验两阶段的最适试验两阶段的最适pH，见表，见表稳定期随着稳定期随着pH降低，糖耗速率增加，生物量增加，降低，糖耗速率增加，生物量增加，但产物合成速率在但产物合成速率在pH5.6时达到最高。说明当时达到最高。说明当pH小于小于5.6以后微生物消耗的糖
46、并非用于合成热凝胶，而是以后微生物消耗的糖并非用于合成热凝胶，而是合成菌体。合成菌体。微生物生长最适微生物生长最适微生物生长最适微生物生长最适pHpHpHpH和产物最适和产物最适和产物最适和产物最适pHpHpHpH相互关系存在四种情况：相互关系存在四种情况：相互关系存在四种情况：相互关系存在四种情况：菌体的比生长速率Qp：产物的比生产速率三、三、pHpH的控制的控制 1 1、调调节节好好基基础础料料的的pHpH。关关键键是是生生理理酸酸性性物物质质与与生生理理碱碱性性物物质质的的配配比比，基基础础料料中中若若含含有有玉玉米米浆浆，pH呈呈酸酸性性，必必须须调调节节pH。若若要要控控制制消消后后
47、pH在在6.0，消前消前pH往往要调到往往要调到6.56.82 2、在基础料中加入维持、在基础料中加入维持pHpH的物质的物质，如如CaCO3，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等等在在发发酵酵过过程程中中根根据据糖糖氮氮消消耗耗需需要要进进行行补补料料。在补料与调在补料与调pH没有矛盾时采用补料调没有矛盾时采用补料调pH如如（1）调调节节补补糖糖速速率率，调调节节空空气气流流量量来来调调节节pH(2)当当NH2-N低，低，pH低时补氨水；低时补氨水；当当NH2-N低，低，pH高时补高时补(NH4)2SO44 4、当补料与调、当补料与调pHpH发生矛盾时，加酸碱
48、调发生矛盾时，加酸碱调pHpH 3 3、通过补料调节、通过补料调节pHpH 分别在分别在4 4种缓冲介质中，种缓冲介质中，于于pH 6.50pH 6.50一一9.509.50测定天冬测定天冬酰胺酶酶活力酰胺酶酶活力1 1 甘氨酸介质甘氨酸介质pH 8.00pH 8.00时酶时酶活力最高；活力最高；2 2 硼酸在硼酸在pH 8pH 85050，酶反，酶反应最快应最快3 3 磷酸磷酸在在pH 850，酶反，酶反应最快应最快4 Tris4 Tris在在pH 850，酶反应，酶反应最快最快酶活酶活1 12 24 43 35 5、不同调、不同调pHpH方法的影响方法的影响天冬酰胺酶天冬酰胺酶不同不同pH
49、pH控制方式对目的突变株控制方式对目的突变株ISw330ISw330异亮氨酸摇异亮氨酸摇瓶发酵的影响，结果如图所示。瓶发酵的影响，结果如图所示。“1 1”表示只加表示只加CaC0CaC03 3控制控制pHpH值，值，“2 2”表示只加尿素控制，表示只加尿素控制，“3 3”表示表示CaC0CaC03 3和尿素联合控制和尿素联合控制pHpH值值。异亮氨酸发酵异亮氨酸发酵例例：pH对对L-异亮氨酸发酵的影响异亮氨酸发酵的影响（天津科技大学）（天津科技大学）菌株最适生长菌株最适生长pHpH控制在控制在6.86.87.07.06 6、发酵的不同阶段采取不同的、发酵的不同阶段采取不同的pHpH值值pH6.
50、9pH6.9时，菌体生长旺盛，时，菌体生长旺盛，pH7.15pH7.15时，对菌体的产酸有时，对菌体的产酸有利。因此，在发酵的产酸期产酸较高。采用阶段利。因此，在发酵的产酸期产酸较高。采用阶段pHpH控制控制模式进行发酵，在发酵中前期控制模式进行发酵，在发酵中前期控制pH6.9pH6.9，到，到48h48h后后pHpH值值为为7.157.15，到，到80h80h后后pHpH值为值为7.257.25。产率。产率22.27g/L22.27g/L，产酸率，产酸率提高提高12.2312.23。例：例：克拉维酸发酵中克拉维酸发酵中pH变换控制变换控制问题的提出：问题的提出：在在pH低时菌体生长受抑制，低