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1、生物工程专业毕业设计+文献综述+开题报告（耐高温全日制及非全日制专业学位研究生学位论文开题报告 论 文 题 目 ：耐高温 α-淀粉酶高产菌的发酵工艺研究 研 究 生 姓 名：培 养 方 式：全日制（双证） 学 位 类 别：工程硕士 所 在 学 院 ：生命科学学院 年 级/学 号：20_ 级 学 科 专 业 ：生物工程 研 究 方 向 ：微生物学 指 导 教 师 ：_ 报 告 时 间：20_ 年 _ 月 _ 大学学位评定委员会办公室 制表 20_ 年 7 月 _ 日填 注：1.“学位类别”指教育硕士、体育硕士、艺术硕士、公共管理硕士、翻译硕士、工商管理硕士、社会工作硕士、汉语国际教育
2、硕士、工程硕士、应用统计硕士、农业推广硕士、旅游管理硕士等 12种；“培养方式”指全日制(双证)、非全日制(单证)。2.本表应在导师指导下完成，并于规定时间内递交校学位办，未提交本表者，不得参加学位论文答辩。3.本表应用黑色或碳素钢笔填写(一式 2 份)，字迹要清楚。如用计算机打印，除封面外，请用A4 纸张 双面 填写并打印。一、本选题的国内外研究现状与趋势（文献综述，含前人的研究成果，当前的研究动态、存在的问题和自己的见解，不少于 20_ 字） 1 、耐高温 α- 淀粉酶概述 α-淀粉酶（α-amylase，EC.3.2.1.1）能以随机的方式切开直链淀粉
3、或支链淀粉分子内的α-1,4糖苷键，使淀粉水解生成糊精、低聚糖、麦芽糖以及葡萄糖，因其产物的末端葡萄糖残基上的碳原子为α-构型，而称为α-淀粉酶 1 。自1811年Kirchhoff发现α-淀粉酶后，随着生物技术的蓬勃发展，α-淀粉酶已成为用途最广、产量最大的酶制剂，大量应用于粮食加工、食品、酿造、造纸、饲料、制药等工业中，近年来占酶制剂总产量的50以上 2 。与普通α-淀粉酶相比，耐高温α-淀粉酶的热稳定性更高，一般在90以上，最适作用温度为9095，喷射液化工艺中，作用的瞬间温度可高达105110。此外，耐
4、高温α-淀粉酶在生产中还有以下优点：（1）可在90以上的温度下快速而彻底的液化淀粉，避免淀粉分子胶束重排形成难溶的团粒，利于过滤处理。（2）酶作用时对Ca 2+ 依赖性小，液化时不需另添加Ca 2+ ，降低了对糖化液精制的成本。（3）酶的稳定性好，利于运输与贮藏等 3 。由于许多古细菌能在高温、高渗、强酸碱等极端条件下生存，古细菌是耐高温α-淀粉酶的重要来，所产耐高温α-淀粉酶最适温度多为100。但古细菌的最适生长温度较高，培养温度大多在80以上，不适合应用于大规模工业化生产。丝状真菌如黑曲霉、米曲霉等所产的α-淀粉酶在工业上有一定应用，一般采用
5、固体发酵，α-淀粉酶的最适pH为5.05.5，最适温度为5055，温度高于60酶开始失活 4 。其中某些耐热性真菌α-淀粉酶最适温度可达70 5 。目前，在工业中广泛使用的耐高温α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，主要生产菌为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。地衣芽孢杆菌（BacillusLicheniformis）是革兰氏阳性菌，菌体呈杆状（0.60.8μm _1.53.0μm），无荚膜。所产芽孢呈柱状或椭圆状，次端生或中生，在土壤中有广泛分布，具有酶系丰富、产酶量大、耐热性好、安全性高等优良特性。20_3年，我国农业部在318号公告中认定地衣芽
6、孢杆菌为 可直接饲喂且安全的微生物菌种，将其列入饲料添加剂目录。与枯草芽孢杆菌相比，地衣芽孢杆菌具有产耐高温α-淀粉酶（BLA）耐热性好、可对刚跨膜的蛋白进行充分折叠、分泌胞外蛋白的能力约是枯草芽孢杆菌的2倍、表达重组蛋白的水平高等优良特性。因此，国内工业生产上广泛使用的是地衣芽孢杆菌及其突变株 6 。2、 、温 耐高温 α- 淀粉酶的生产 目前，工业上生产α淀粉酶主要是通过微生物发酵的方法，其中可以分为固态发酵和深层液体发酵。固体发酵是一种培养基呈固态、利用自然底物作为碳氮的发酵方法，对设备的要求较低。深层液体发酵相比于固体发酵方法有许多优点：先进的生产工
7、艺，大大提高了底物的利用率；生产周期短，质量稳定；机械化生产，提高了劳动生产率 7 。在工业生产中，发酵条件对α淀粉酶产量有重要的影响，生产性能优良的菌株，在合适的环境条件下，才能使其潜力充分表达出来。调控菌种的生长环境一般从生产工艺和培养基的组分着手。（1）碳氮对产酶的影响 α-淀粉酶是一种诱导酶，一般是在淀粉或它的水解产物如麦芽糖存在的情况下诱导其产生 8 。在 α淀粉酶发酵生产中常用的碳为可溶性淀粉或生淀粉，常用的氮有酵母提取物、大豆粉、肉汁提取物、蛋白胨等。但是，从工业能耗和生产成本考虑，越来越多的生产厂家开始用一些低成本又能提供良好碳氮的农业废料如
8、麸皮、油饼来替代成本较高的可溶性淀粉、酵母膏和蛋白胨等精细碳氮。利用低成本的农业原料将是以后大规模发酵生产的趋势。Saban 等 9 研究 Bacillus amyloliquefaciens NRRL645 利用蓖麻油饼发酵生产 α-淀粉酶时，用响应面法对固体发酵过程中蓖麻油饼、蛋白胨、酵母提取物和(NH 4 ) 2 SO 4 进行了优化，当蓖麻油饼、蛋白胨、酵母提取物、(NH 4 ) 2 SO 4 的含量分别为 22.62、5.20、1.62、6.81g/L 时，α淀粉酶产量可达到最高为 4895U；而在实际培养中产量达到了 4827U，与优化前相比提高了 8。（2
9、）金属离子和无机离子对产酶的影响 α淀粉酶是一种金属酶，在发酵过程中适当地加入一些金属离子对于α-淀粉酶的产量有一定的促进作用。Gupta等 10 曾对一些金属离子的影响作过综述，常见的金属离子如K + 、Fe 2+ 、Mo 2+ 、Cl 等对于α淀粉酶的产量基本没有影响；Mg 2+ 则对产量起着关键的作用，在没有添加Mg 2+ 的情况下产酶量会下降50；Mn 2+ 对于产量也会有一定的促进作用；而Co 2+ 可以使菌体量大大增加但是会导致产量有一定的下降。Dhanya 11 等用Bo_-Behnken理论对Bacillus amyloliquefacien
10、s利用麦麸和花生油饼深层液体发酵生产α淀粉酶进行优化时发现，培养时间和CaCl 2 浓度对发酵结果起决定作用。当培养时间和CaCl 2 浓度分别为42h和0.0275mol/L时产酶量达到最高。（3）pH对产酶的影响 pH在生产过程中是十分重要的参数。而且随着发酵的进行，一些代谢物的释放会改变最初的生长pH，这种变化同时也会对产物的稳定性造成一定影响。通常真菌喜欢偏酸性的生产环境，而细菌在中性环境下生长较好。经研究发现一些曲霉属的真菌如Asperjillus oryzae、Asperjillus ficuum和Asperjillusniger在液体深层发酵过程中，当pH在5.06.
11、0时α淀粉酶产量最高 12-13 。而细菌如Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis和Bacillus stearothermophilus需要的起始pH为7.0。（4）溶氧对产酶的影响 在一些耐高温α淀粉酶的生产过程中，生产菌株在对数期时强烈需氧，这一时期的供氧量成为菌体生长的限制性因子，对于后来的产酶量有直接影响。林剑 13 等通过对一株α淀粉酶生产菌株IIY1液体发酵的研究发现，在对数期需要大量的溶氧，过了对数期后对氧气的需求仍较大，保证对数期后的产酶阶段溶氧不低于10对于该菌株的耐高温α淀粉酶发酵顺
12、利进行仍然是很重要的。3 3 、 展望 α淀粉酶在工业生产中应用十分广泛。随着人类对工业能耗的关注和重视，采用低廉的生物加工废料和高效的加工工艺将是今后生产α-淀粉酶的首选方法。对α-淀粉酶发酵生产的影响因素进行研究和优化，有利于进一步降低α-淀粉酶发酵生产成本，提高生产效率，促进α-淀粉酶发酵工业的发展。注：可用 4 A4 纸加附页，页码格式用 1 1- -1 1 、1 1- -2 2 表示。-1- 二、 论文选题的理由或意义：国内耐高温α-淀粉酶研究工作多以优化培养基和工艺的作为研究内容。自从国内引进耐高温&alpha
13、;-淀粉酶菌种以来，有人从事传统菌种诱变的研究工作，但所选育菌株产酶水平较低，和国外差距较大。偶有个别菌株活力较高，但没有进行产、学、研结合，致使研究工作一直停留在实验室阶段。上世纪90 年代中期，国内开始有报道将DNA重组技术试用于耐高温α-淀粉酶的发酵。现阶段利用DNA 重组技术来提高菌种性能在我国仅为探索、起步期，没有实现工业化生产。对菌种性能的提升、发酵工艺的改进，发酵水平的提高，将有效降低工业生产耐高温α-淀粉的成本，提升产品的竞争力。国内在提高耐高温α-淀粉酶发酵水平的研究方面，存在如下不足：一是发酵水平低，和国外差距较大；二是在研究方法单调，没
14、有将传统育种技术、现代育种技术和发酵条件优化进行有机结合；三是很少从菌株特性、摇瓶发酵到发酵罐高密度发酵进行系统化研究，对发酵过程进行全面的优化。本文以在实验室筛选的耐高温 α-淀粉酶高产菌的基础上，研究该菌株的生长及产酶特性，从廉价的工业原料选择最适碳、氮，确定发酵培养基最佳组成和最适培养条件，并在 10L 发酵罐上进行放大实验，研究种子培养工艺、发酵过程中溶氧以及 pH 的控制、补料工艺对发酵产酶的影响，确定最佳发酵工艺，为进一步放大工业试生产奠定基础。注：可用 4 A4 纸加附页，页码格式用 2 2- -1 1 、2 2- -2 2 表示。-2- 三、研究方法（研究对象、研究
15、手段、技术路线、实验方案等的可行性分析p ） 研究对象：1.对筛选出的高产菌株进行生理生化特征的鉴定，绘制摇瓶生长曲线、发酵产酶曲线，测定酶的最适pH、最适温度。2.确定发酵培养基的碳、氮，优化发酵培养基和发酵条件，Plackett-Burman实验设计筛出对产酶影响显著的因素，结合最陡爬坡试验以及响应面优化中的Bo_-Behnken实验设计得到最佳发酵培养基。3.进行10L发酵罐放大实验，对种子瓶工艺、培养温度和溶氧的控制、补加氨水、补料工艺以及还原糖含量的控制的优化，提高耐高温α-淀粉酶的产量。研究手段：菌株特性（生理生化鉴定、生长产酶曲线） 单因素实验（发酵培养基碳、氮及其他
16、组成，培养条件） 响应面优化（PB 实验、最陡爬坡试验，响应面优化） 10L发酵罐发酵工艺（种子培养工艺、发酵过程中溶氧、pH 的控制、补料工艺） 技术路线：菌株生理生化鉴定生长产酶曲线碳氮优化发酵条件单因素实验响应面优化10L发酵罐发酵工艺优化。可行性分析p ：已获得具有产耐高温α-淀粉酶能力的菌株BL-H19，本实验室长期进行发酵工艺研究，具备理论基础和实验条件。酶活检测可依据GB/T24401-2021α-淀粉酶制剂中耐高温α-淀粉酶活力的测定方法，且本实验室具备相应条件。-3- 四、学位论文详细提纲 绪论 第一章 耐高温α-淀粉酶高产菌的
17、生理生化以及生长产酶特性。第二章 耐高温α-淀粉酶高产菌发酵培养条件优化 第三章 10L发酵罐发酵工艺优化 第四章 结论与展望 -4- 五、论文工作进度安排 起止时间 工作内容 20_.02-20_.03 相关文献的检索、收集、整理和阅读，掌握实验理论基础，对耐高温 α-淀粉酶高产菌进行活化培养。20_.05-20_iii.06 查阅整理相关文献并拟定实验方案，耐高温 α-淀粉酶高产菌生理生化鉴定和生长发酵曲线的绘制。20_.07-20_.08 查阅整理相关文献并拟定实验方案，菌株发酵培养基和发酵条件优化。对碳、氮等培养基成分以及发酵条件进行单因素实验，通过
18、响应面优化确定最适培养条件。2021.09-20212.11 查阅整理相关文献并拟定实验方案，10L 发酵罐液体深层发酵工艺研究。研究 pH、溶氧、还原糖浓度等因素对发酵过程的影响，改进发酵工艺。2021.12-2021.01 实验总结，图表处理，撰写论文综述部分。2021.02-202103 撰写论文。-5- 六、本选题的创新点：耐高温α-淀粉酶的研究多为对耐高温α-淀粉酶高产菌株的筛选、诱变育种，近年来也有结合DNA重组技术进行现代育种，部分进行了摇瓶发酵验证和酶学性质研究，但往往存在产酶水平不高，发酵工艺研究不全面，未能进行发酵罐放大实验等不足。本文在对一株耐高温
19、α-淀粉酶高产菌进行生理生化鉴定，生长产酶特性研究的基础上，全面探究碳、氮以及其他培养基成分对发酵产酶的影响，再通过响应面优化确定最适发酵条件。并在10L发酵罐上进行对种子瓶工艺、培养温度和溶氧的控制、补加氨水、补料工艺以及还原糖含量的控制的优化，提高耐高温α-淀粉酶的产量。本文将以摇瓶实验中发酵影响因子分析p 的基础上，对10L发酵罐的发酵工艺对产酶影响探究，确定最佳产酶工艺，为进一步放大工业生产奠定基础。七、已具备的研究条件、可能遇到的困难及拟采取的解 决方法 耐高温α-淀粉酶高产菌HN-H19由_研究院筛选、保藏，具有很强的产耐高温α-淀粉
20、酶的潜力，初步摇瓶验证产酶达2580u/ml。HN-H19为地衣芽孢杆菌，并进行了生理生化鉴定，通过生长产酶曲线表明该菌株产耐高温α-淀粉酶为滞后型。已具备的研究条件：恒温培养振荡器、10L发酵罐系统、光学显微镜、恒温摇床、生化培养箱、洁净工作台。尚缺少的研究条件：分光光度计、高速离心机、pH计。解决途径：与其他实验室共用所需实验设备。-6- 八、主要【参考文献】：p 序号 作者 文章题目或书目 期刊名称（出版单位）、时间 1张树政.酶制剂工业M.北京:科学出版社,1998:21-38.2林必博.耐高温 α-淀粉酶的研究进展J.发酵科技通讯,2021,(4):41-43.3王楠,马荣山.耐高温 α-淀粉酶的研究进展J.中兽医第 8 页 共 8 页