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1、1 生化分离方法生化分离方法生生物物化化学学实实验验中中常常常常涉涉及及细细胞胞成成分分的的生生化化分分析析或或某某种种物物质质的的制制备备，因因此此，必必需需利利用用有有效效的的生生物物化化学学分分离离方方法法，常常用用的的方方法法有有：离离心心技技术、层析技术、电泳技术和膜分离技术。术、层析技术、电泳技术和膜分离技术。1.1 离心技术离心技术1.1.1 基本原理基本原理离心技术离心技术（centrifugal technique）是根据颗是根据颗粒在作匀速圆周运动粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离时受到一个外向的离心力的行为而发展起心力的行为而发展起来的一种分离技术。来的一种分离技术。？
2、影响颗粒在离心场中的沉降速度的因素有：影响颗粒在离心场中的沉降速度的因素有：颗粒半径颗粒半径rp、颗粒形状（影响摩擦力颗粒形状（影响摩擦力f）、）、颗粒与介质颗粒与介质的密度差（的密度差（p-m）、）、一定温度条件下悬浮介质一定温度条件下悬浮介质的粘度系数（的粘度系数（）、离心加速度）、离心加速度 2r。在确定的离心操作中，沉降速率则主要取决于悬浮颗在确定的离心操作中，沉降速率则主要取决于悬浮颗粒受到离心力的大小。粒受到离心力的大小。离离心心力力（centrifugal force，Fc）离离心心作作用用是是根根据据在在一一定定角角度度速速度度下下作作圆圆周周运运动动的的任任何何物物体体都都受
3、受到到一一个个向向外外的的离离心心力力进进行行的的。离离心心力力（Fc）的的大大小小等等于于离离心心加加速速度度2r与与颗颗粒粒质质量量m的乘积，即：的乘积，即：是旋转角速度是旋转角速度(弧度弧度/秒秒)；r：颗粒离开旋转中心的距离颗粒离开旋转中心的距离(cm)；m：质量质量(克克)。相对离心力（相对离心力（relative centrifugal force，RCF）离离心心力力因因离离心心管管至至旋旋转转轴轴的的距距离离不不同同而而不不同同，因因此此用用“相相对对离离心心力力”表表示示离离心心力力，若若RCF值值不不变变，一个样品可在不同的离心机上获得相同的结果。一个样品可在不同的离心机上
4、获得相同的结果。RCF是离心场转化为重力加速度的倍数。是离心场转化为重力加速度的倍数。r：离心转子的半径距离（离心转子的半径距离（cm）；）；g：重力加速度（重力加速度（980cm/sec2）；）；rpm：转子每分钟的转数转子每分钟的转数。Dole和和Cotzias制制作作了了与与转转子子速速度度和和半半径径相相对对应应的离心力的转换列线图。的离心力的转换列线图。在在用用图图将将离离心心机机转转数数换换成成相相对对离离心心力力时时，先先在在离离心心机机半半径径标标尺尺上上取取已已知知的的离离心心机机半半径径和和在在转转数数标标尺尺上上取取已已知知的的离离心心机机转转数数，然然后后将将这这两两点
5、点间间划划一一条条直直线线，在在图图中中间间RCF标标尺尺上上的的交叉点，即为相应的离心力数值。交叉点，即为相应的离心力数值。例例已已知知离离心心机机转转数数为为2500rpm，离离心心机机的的半半径径为为7.7cm，将将两两点点连连接接起起来来交交于于RCF标标尺尺，此此交交点点500g即是即是RCF值。值。相相对对离离心心力力(g)RCF=1.11910-5rrpm2。1.1.2 离心分离方法离心分离方法1.1.2.1 差速离心法差速离心法 利利用用不不同同的的粒粒子子在在离离心心力力场场中中沉沉降降的的差差别别，在在同同一一离离心心条条件件下下，沉沉降降速速度度不不同同，通通过过不不断断
6、增增加加相相对对离离心心力力，使使一一个个非非均均匀匀混混合合液液内内的的大小、形状不同的粒子分部沉淀。大小、形状不同的粒子分部沉淀。操操作作过过程程中中一一般般是是在在离离心心后后用用倾倾倒倒的的办办法法把把上上清清液液与与沉沉淀淀分分开开，然然后后将将上上清清液液加加高高转转速速离离心心，分分离离出出第第二二部部分分沉沉淀淀，如如此此往往复复加加高高转转速，逐级分离出所需要的物质。速，逐级分离出所需要的物质。差差速速离离心心的的分分辨辨率率不不高高，沉沉淀淀系系数数在在同同一一个个数数量量级级内内的的各各种种粒粒子子不不容容易易分分开开，常常用用于于其其他他分离手段之前的粗制品提取。分离手
7、段之前的粗制品提取。关键是选择适合于各分离物的离心力。关键是选择适合于各分离物的离心力。例如用差速离心法分离已破碎的细胞各组份。例如用差速离心法分离已破碎的细胞各组份。1.1.2.2 速率区带离心法速率区带离心法速速率率区区带带离离心心法法是是在在离离心心前前于于离离心心管管内内先先装装入入密密度度梯梯度度介介质质（如如蔗蔗糖糖、甘甘油油、KBr、CsCl2等等），待待分分离离的的样样品品铺铺在在梯梯度度液液的的顶顶部部、离离心心管管底底部部或或梯梯度度层层中中间间，同梯度液一起离心。同梯度液一起离心。离离心心后后在在近近旋旋转转轴轴处处（r1）的的介介质质密密度度最最小小，离旋转轴最远处（离
8、旋转轴最远处（r2）介质的密度最大；介质的密度最大；但但介介质质最最大大密密度度必必须须小小于于样样品品中中粒粒子子的的最最小小密密度，即度，即Pm。这这种种方方法法是是根根据据分分离离的的粒粒子子在在梯梯度度液液中中沉沉降降速速度度的的不不同同，使使具具有有不不同同沉沉降降速速度度的的粒粒子子处处于于不不同同的的密密度度梯梯度度层层内内分分成成一一系系列列区区带带，达达到到彼此分离的目的。彼此分离的目的。1.1.2.3 等密度离心法等密度离心法 等等密密度度离离心心法法是是在在离离心心前前预预先先配配制制介介质质的的密密度度梯梯度度，此此种种密密度度梯梯度度液液包包含含了了被被分分离离样样品
9、品中中所所有有粒粒子子的的密密度度，待待分分离离的的样样品品铺铺在在梯梯度度液液顶顶上上或或和和梯梯度度液液先先混混合合，离离心心开开始始后后，当当梯梯度度液液由由于于离离心心力力的的作作用用逐逐渐渐形形成成底底浓浓而而管管顶顶稀稀的的密密度度梯梯度度，与与此此同同时时原原来来分分布布均均匀匀的粒子也发生重新分布。的粒子也发生重新分布。当当管管底底介介质质的的密密度度大大于于粒粒子子的的密密度度，即即mP时时粒粒子子上上浮浮；在在管管顶顶处处Pm时时，则则粒粒子子沉沉降降，最最后后粒粒子子进进入入到到一一个个它它本本身身的的密密度度位位置置即即Pm，此此时时dx/dt为为零零，粒粒子子不不再再
10、移移动动，粒子形成纯组份的区带。粒子形成纯组份的区带。与与样样品品粒粒子子的的密密度度有有关关，而而与与粒粒子子的的大大小小和和其其他参数无关。他参数无关。体体系系到到达达平平衡衡状状态态后后，延延长长离离心心时时间间和和提提高高转转速也不能改变粒子的成带位置。速也不能改变粒子的成带位置。但但提提高高转转速速可可缩缩短短达达到到平平衡衡的的时时间间，离离心心所所需需时时间间以以最最小小颗颗粒粒到到达达等等密密度度点点（即即平平衡衡点点）的时间为基准，有时长达数日。的时间为基准，有时长达数日。此此法法一一般般应应用用于于物物质质的的大大小小相相近近，而而密密度度差差异异较大时。常用的梯度液是较大
11、时。常用的梯度液是CsCl2。1.1.3 离心设备离心设备离心机可为工业用和实验用离离心机可为工业用和实验用离心机。实验用离心机又分为心机。实验用离心机又分为制备性和分析性离心机。制备性和分析性离心机。制备性离心机主要用于分制备性离心机主要用于分离各种生物材料和分子，分离各种生物材料和分子，分离的样品容量比较大。离的样品容量比较大。分析性离心机一般都带有光分析性离心机一般都带有光学系统，用于研究生物大分学系统，用于研究生物大分子和颗粒的理化性质。分析子和颗粒的理化性质。分析性离心机都是超速离心机。性离心机都是超速离心机。1.1.3.1 离心机的种类离心机的种类普普通通离离心心机机：转转速速20
12、006000rpm，RCF可可达达6000g；容容量量为为几几十十毫毫升升至至几几升升，分分离离形形式式是是固固液液沉沉降降分分离离，转转子子有有角角式式和和外外摆摆式式，转转速速控控制制不不严严格格，一一般般无无制制冷冷系系统统，用用于于收收集集易易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。普普通通离离心心机机以以交交流流电电动动机机驱驱动动，电电机机碳碳刷刷易易磨磨损损，利利用用电电压压调调压压器器调调节节转转速速，起起动动电电流流大大，速速度度升升降降不不均均匀匀，一一般般转转头头是是置置于于一一个个硬硬质质钢钢轴轴上上，因因此此必必需需进进行行精精
13、确确平平衡衡，以以免免损损坏坏离心机。离心机。高高速速离离心心机机：转转速速2000025000rpm，RCF可可达达89000g，最最大大容容量量可可达达3升升，分分离离形形式式是是固固液液沉降分离。沉降分离。超超速速离离心心机机：转转速速5000080000rpm，RCF可可达达600000g；离离心心容容量量由由几几十十ml至至2L，分分离离的的形形式式是是差差速速沉沉降降分分离离和和密密度度梯梯度度区区带带分分离离，可可进进行行亚亚细细胞胞器器分分级级分分离离，病病毒毒、核核酸酸、蛋蛋白质和多糖等生物大分子的分离。白质和多糖等生物大分子的分离。按按性性能能可可分分为为分分析析型型、制制
14、备备型型和和分分析析制制备备型型三三种。种。1.1.3.2 离心机的组成及使用离心机的组成及使用离心机一般由：主机、转头、离心管组成。离心机一般由：主机、转头、离心管组成。角角式式转转头头：离离心心管管腔腔与与转转轴轴成成一定倾角的转头。一定倾角的转头。缺缺点点：由由于于颗颗粒粒在在沉沉降降时时先先沿沿离离心心力力方方向向撞撞向向离离心心管管，然然后后沿沿管管壁壁滑滑向向管管底底，因因此此管管的的一一侧侧会会出出现现颗颗粒粒沉沉积积而而产产生生“壁壁效效应应”，壁壁效效应应易易使使沉沉降降颗颗粒粒受受突突然然变变速速所所产产生生的的对对流流扰扰乱而影响分离效果。乱而影响分离效果。水平式转头水平
15、式转头：转头是：转头是由吊着的由吊着的4或或6个自个自由活动的离心套管由活动的离心套管构成。当转头转速构成。当转头转速达到达到200800rpm时，时，吊桶荡至水平位置，吊桶荡至水平位置，适用于密度梯度区适用于密度梯度区带离心。带离心。优点：梯度物质可放在保持优点：梯度物质可放在保持垂直的离心管中，离心时垂直的离心管中，离心时被分离的样品带垂直于离被分离的样品带垂直于离心管纵轴，有利于离心结心管纵轴，有利于离心结束后由管内分层取出已分束后由管内分层取出已分离的各样品带。离的各样品带。缺点：颗粒沉降距离长，离缺点：颗粒沉降距离长，离心所需时间也长。心所需时间也长。垂直转头垂直转头：其离心管是垂直
16、放置，样品颗粒的：其离心管是垂直放置，样品颗粒的沉降距离最短，离心所需时间也短，适合用沉降距离最短，离心所需时间也短，适合用于密度梯度区带离心。于密度梯度区带离心。连续流动转头连续流动转头：可用于大量培养液或提取液的：可用于大量培养液或提取液的浓缩与分离，转头与区带转头类似，由转子桶浓缩与分离，转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成，离和有入口和出口的转头盖及附属装置组成，离心时样品液由入口连续流入转头，在离心力作心时样品液由入口连续流入转头，在离心力作用下，悬浮颗粒沉降于转子桶壁，上清液由出用下，悬浮颗粒沉降于转子桶壁，上清液由出口流出。口流出。离心管主要以塑料、玻
17、璃或不锈钢制成，塑料离心管主要以塑料、玻璃或不锈钢制成，塑料离心管常用材料有聚乙烯（离心管常用材料有聚乙烯（PE），），聚碳酸酯聚碳酸酯（PC），），聚丙烯（聚丙烯（PP）等，等，PP管性能较好。管性能较好。1.1.4 使用离心机的注意事项使用离心机的注意事项离心时要保证离心管的对称平衡。离心时要保证离心管的对称平衡。例例如如，当当离离心心转转速速达达1000050000rpm时时，如如果果对对称称管管相相差差1g，转转头头半半径径5cm，根根据据离离心心力公式：力公式：F=mRCF，查表，查表 10000rpm时的时的RCF=6000，代入公式代入公式 F=16000=6kg 50000rp
18、m时时RCF=150000，F=150kg此此时时引引起起两两边边不不平平衡衡可可达达6150kg，对对离离心心机机将造成很大的损伤，缩短离心机的使用寿命。将造成很大的损伤，缩短离心机的使用寿命。1.1.5.1 普通离心机注意事项普通离心机注意事项离心前必须仔细检查转头各孔内有无异物。离心前必须仔细检查转头各孔内有无异物。离心管必须仔细，对称平衡。离心管必须仔细，对称平衡。机内若不清洁，离心管要用塑料薄膜封口。机内若不清洁，离心管要用塑料薄膜封口。必须慢起动，然后逐渐加速。必须慢起动，然后逐渐加速。离心时不准打开离心机盖。离心时不准打开离心机盖。停止离心时不许用手刹车。停止离心时不许用手刹车。
19、1.1.5.2 高速冷冻离心机注意事项高速冷冻离心机注意事项未经过培训和考核者不能使用。未经过培训和考核者不能使用。选择合适的转头和转速，绝不可超速使用。选择合适的转头和转速，绝不可超速使用。选择合适的温度，通常选择合适的温度，通常4，除有机溶剂外，除有机溶剂外不要低于零下，以免冰冻，损坏离心管和转不要低于零下，以免冰冻，损坏离心管和转头。头。离心管内装载的溶液量必须合适，不锈钢管离心管内装载的溶液量必须合适，不锈钢管无盖，只能装无盖，只能装2/3，塑料管可装至，塑料管可装至“肩肩”部。部。管盖需盖严不能漏液。若离心管盖密封性差，管盖需盖严不能漏液。若离心管盖密封性差，液体不能加满（高速离心且
20、使用角度头），液体不能加满（高速离心且使用角度头），防止外溢失去平衡和污染转头及离心腔。防止外溢失去平衡和污染转头及离心腔。空管离心会变形。塑料管使用有机溶剂必须空管离心会变形。塑料管使用有机溶剂必须符合规定。符合规定。由由于于超超离离时时需需抽抽真真空空，因因此此液液体体一一定定要要加加满满离离心管，以避免离心管变形。心管，以避免离心管变形。使使用用角角度度头头时时要要加加转转头头盖盖，否否则则离离心心腔腔内内会会产产生生涡涡流流阻阻力力并并引引起起摩摩擦擦升升温温，影影响响离离心心机机的的使用寿命。使用寿命。离心管必须对称放置，称重平衡偏差离心管必须对称放置，称重平衡偏差0.1g。不能无转头空转不能无转头空转.离心时不能打开机盖，不能扒扶在离心机上，离心时不能打开机盖，不能扒扶在离心机上，如有异常声音和振动时立即停机。如有异常声音和振动时立即停机。转头使用后必须及时由转头室中取出、擦干，转头使用后必须及时由转头室中取出、擦干，用擦孔棒将管孔仔细擦净。如有溶液溢出必用擦孔棒将管孔仔细擦净。如有溶液溢出必须清洗干净，擦净转头室内凝水，开盖凉干须清洗干净，擦净转头室内凝水，开盖凉干转头室。转头室。离心机使用后登记。离心机使用后登记。