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1、组织培养技术-2012 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life, there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望一、组织培养的定义一、组织培养的定义l组织培养：组织培养： 细胞、组织或器官离体合适的培养液、温度、无菌使之生存和生长 l根据培养物的不同，组织培养又可分： 细胞培养、组织培养细胞培养、组织培养和器官培养器官培养。二、组织培养的应用二、组织培养的应用1. 优点：优点：（1）研究对象是活细胞，可长时间动态观察细胞的形态结构和生命活动。（2）研究对象广泛，包括各种组织细胞。（3）可研究各种理化因素
2、（温度、药物、毒素等）对细胞代谢、增殖、分化的影响。（4）研究方法多样，如倒置、荧光、电子显微镜、组织化学、同位素标记等，研究结果便于观察记录。应用：应用：l病毒学：细胞培养是分离培养病毒的重要手段，用于病毒感染的诊断，生产病毒疫苗。l免疫学：杂交瘤-单克隆抗体技术。l遗传学：从子宫取得胎儿细胞做染色体分析，进行遗传学诊断，试管婴儿等。l肿瘤学：抗肿瘤药物筛选。2. 不足之处：不足之处： 体外与体内培养条件不完全相同，失去神经内分泌系统的调节作用，培养的细胞存在一定的差异差异，故对结果的判断应慎重。 二、组织培养的应用二、组织培养的应用三、培养细胞的特性三、培养细胞的特性1. 培养细胞的分型培
3、养细胞的分型（按生长方式分）（按生长方式分）（1）贴附型：（2）悬浮型： 1. 培养细胞的分型培养细胞的分型（按生长方式分）（按生长方式分）（1）贴附型：大部分细胞附着于支持物表面生长，分化不明显，形态单一，常反映其胚层起源。如上皮细胞型，成纤维细胞型，多形细胞型。上皮细胞型成纤维细胞型（2）悬浮型：不贴附于支持物上，而呈悬浮状态生长，细胞呈圆形，单个或细胞团排列；见于血、脾、骨髓细胞、部分肿瘤细胞。悬浮型细胞三、培养细胞的特性三、培养细胞的特性2. 培养细胞的生长和增殖培养细胞的生长和增殖l原代培养原代培养（Primary Culture）：从体内取出组织开始在体外培养，在其传代之前。 l传
4、代培养传代培养（Subculture）: 将细胞分离成两部分获更多至新的培养器皿中，并补充更新培养液。l细胞系细胞系（Cell line）：原代培养细胞一经传代后便称为细胞系。 细胞系的生长过程细胞系的生长过程有限细胞系有限细胞系无限细胞系无限细胞系二倍体细胞大多可传30-50代，相当于150-300个细胞周期，维待一年左右的生存时间。 细胞系的生长过程细胞系的生长过程l原代培养期原代培养期：1-4周，与体内细胞相似，但分裂不旺盛，含细胞类型较多。l传代期传代期：持续时间最长，细胞分裂增殖旺盛，保留原组织细胞的很多特征，一般传代30-50次后，细胞增殖逐渐缓慢。l衰退期衰退期：细胞增殖缓慢，并
5、逐渐停止，细胞形态轮廓增强，最后衰退、死亡。 实验研究的最佳时期： 传代期（10代以内）三、培养细胞的特性三、培养细胞的特性1. 营养需要： 碳水化合物、氨基酸、维生素、无机离子、促生长因子和激素2. 生存环境：l 温度：l PH值：l 气相：l 渗透压：3. 无污染无污染及无毒：35-37 耐低温不耐高温7.2-7.4 宁酸勿碱O2、CO2（5% ）NaHCO3-CO2 260-320 mmol/L3. 培养细胞的生长条件培养细胞的生长条件防止污染防止污染l要注意防止微生物（细菌、病毒、真菌、支原体等）的污染、不同细胞类型的交叉污染。l出现以下情况时培养细胞可能有污染：1) 培养液的酸碱度异
6、常改变，如短期内颜色变黄 ；2) 培养液出现混浊；3) 光镜观察到大量颗粒或菌丝；4) 细胞生长停止或出现死亡。四、组织培养的常用设备四、组织培养的常用设备 1. 仪器仪器 包括各种无菌操作、消毒灭菌、细胞培养和保存的设备，如无菌室、超净工作台、CO2培养箱、高压蒸汽灭菌器、滤器、水纯化装置、倒置显微镜、离心机、液氮容器等。 超净工作台超净工作台CO2培养箱培养箱四、组织培养的常用设备四、组织培养的常用设备2. 器皿器皿 培养瓶培养瓶培养皿培养皿培养板培养板四、组织培养的常用设备四、组织培养的常用设备3. 试剂试剂 （1）天然培养基：天然培养基：动物血清（如胎牛血清、小牛血清）。（2）合成培养
7、基：）合成培养基：如RPMI1640、DMEM、199等。 多采用合成培养基+天然培养基（5-20%）。（3）平衡盐溶液：）平衡盐溶液：由无机盐和葡萄糖组成，用于洗涤、配 液、维持渗透压，调节PH值等，如PBS、Hanks等。（4）消化液：消化液：用于消化解离组织块，使贴壁细胞从附着物 脱离。如胰酶、EDTA、胶原酶等。 五、基本培养技术五、基本培养技术 l1. 无菌操作无菌操作 l2. 取材取材l3. 组织分离组织分离l4. 原代培养原代培养l5. 传代培养传代培养l6. 细胞冻存与复苏细胞冻存与复苏五、基本培养技术五、基本培养技术 1. 无菌操作：无菌操作：防止污染是决定组织培养成败的关键
8、，必须无菌操作无菌操作！（1）培养前的消毒灭菌）培养前的消毒灭菌 待用物品：洗涤、消毒灭菌。 无菌室：紫外线照射30-50min，新洁尔灭拖地。 超净台：75%酒精擦洗，紫外线灭菌等照射30min。（2）洗手和着装）洗手和着装 彻底洗手，着清洁工作服，酒精消毒手。（3）无菌培养操作）无菌培养操作 超净台内操作，点燃酒精灯，火焰附近操作，在安装吸头、打开或封闭瓶口时均应过火烧灼。 不直接用手触及器皿的无菌部分，如瓶口、瓶塞内侧，必要时借助镊子。 吸取培养液、平衡盐溶液、细胞悬液的吸管不能混用。 转移液体时，吸管口不能触及瓶口，以防交叉污染。 饭盒、瓶子不要过早打开，使用后及时盖好，瓶塞倒置在桌面
9、。 面向操作台时勿大声讲话、咳嗽，以免喷出唾沫，污染工作台面。 操作完毕，整理台面，酒精擦拭。五五 、基本培养技术、基本培养技术 2. 取材：取材： 新鲜、无菌、避免有害因素损伤。五、基本培养技术五、基本培养技术 3. 组织分离组织分离（1）离心分离：）离心分离：用于血液、羊水、胸水、腹水等悬液，500-1000 rpm低速离心5-10 min。（2）机械分离：）机械分离：用剪刀将组织剪切成小块，也可再挤压通过筛网，用于纤维成分少的组织，如脑、胚胎、一些肿瘤组织。（3）消化分离：）消化分离：用消化液使组织松散、细胞分开，获得细胞悬液。常用消化液胰酶、EDTA、胶原酶。六、基本培养技术六、基本培
10、养技术 4. 原代培养：原代培养：（1）组织块法：）组织块法：将组织剪切成小块后，接种于培养瓶底部，培养后细胞从组织块边沿移出生长。简便易行，适用于组织量少培养。（2）消化法：）消化法：将消化分离法获得的细胞悬液，接种培养瓶。在短时间内生长成片，适用于大量组织的培养，但步骤繁琐、易污染、成本高。五、基本培养技术五、基本培养技术 5. 传代培养：传代培养：贴附型细胞：贴附型细胞：加入消化液，镜下观察，见胞质回缩、细胞间隙增大，终止消化，吹打为单细胞悬液，计数后接种新的培养瓶。悬浮型细胞：悬浮型细胞：直接吹打或离心沉淀后再分离传代。注意：注意：1）贴壁细胞覆盖瓶底大部分（80%）方可传代，不要急于
11、传代； 2）传代时不同细胞有不同的消化时间，要根据需要注意观察及时处理。六、基本培养技术六、基本培养技术 6. 细胞冻存和复苏细胞冻存和复苏l目的：保存和利用细胞。l短期保存：-70低温冰箱，长期保存：-196 液氮罐。 l为保证细胞最大存活率，采用慢冻快融慢冻快融的原则 。l冻存：收集对数生长细胞，加入保护剂和培养液，调细胞密度5-10106/ml，分装入冻存管，逐渐降温，-1-2/min，到-25时，下降率增至-5-10/min，到-100迅速浸入液氮罐。（430min-7024h-196 液氮）。 l复苏：取出冻存管，直接投入37水浴中，快速摇动，直至完全融化，吸出细胞，加入10倍以上培
12、养液，离心，调整细胞密度5105/ml，接种培养瓶。l细胞冻存于液氮中（-196）理论上储存时间是无限的。一般冻存一年后，应复苏一次，继续冻存。 低温冰箱液氮罐冻存管冻存管冻存管实验操作：小鼠肝组织培养实验操作：小鼠肝组织培养（一）实验材料（一）实验材料l1.器材： 手术剪、手术镊 （大） 剪鼠开皮肤、肌肉层 眼科镊、眼科剪 （小） 剪碎鼠肝脏 培养皿 盖和底分别用于清洗、剪碎鼠肝脏 培养瓶 培养肝组织l2.试剂：洗液PBS、小牛血清、 培养液1640l3.仪器：超净工作台、CO2培养箱l4.动物：小白鼠 1只 /2人实验操作：小鼠肝组织培养实验操作：小鼠肝组织培养（二）实验方法（二）实验方法
13、1. 处死消毒小鼠：引颈法处死小鼠，在75%酒精缸中浸泡数秒取出，滴去酒精，腹部向上放进白瓷盘，拿入超净台。2. 准备工作：点燃酒精灯，酒精棉球擦手， 取3支滴管分别放入洗液、血清、培养液中。 （第一组放，最后一组收）3. 取肝脏：用手术剪、镊剪开腹部皮肤、肌肉层，暴露腹腔，从腹腔右侧取一小块肝组织，放入培养皿中。4. 洗涤：加入洗液，用眼科镊夹住肝组织清洗，共洗2遍。实验操作：小鼠肝组织培养实验操作：小鼠肝组织培养（二）实验方法（二）实验方法5. 剪碎：在培养皿中加入1滴小牛血清，将肝组织放入其中，用眼科剪剪碎成1mm3左右小块。6. 准备培养瓶：吸1滴血清，滴在培养瓶底面，来回涂抹。7.接
14、种肝组织：用滴管吸取肝组织，贴于培养瓶底面中， 3-4块即可，分开排列。8.加培养液：翻转培养瓶，加入培养液2滴管，轻旋瓶盖。9.培养：将培养瓶放入CO2培养箱，2h后翻转。10.整理台面，清洗器材。实验操作：小鼠肝组织培养实验操作：小鼠肝组织培养注意事项：注意事项： 无菌操作 试剂中的滴管第一组放，最后一组收 加培养液时，要翻转培养瓶 2人一组，相互配合 实验结束后：器材 C409清洗 小鼠 C409垃圾桶实验操作：小鼠肝组织培养实验操作：小鼠肝组织培养（三）实验结果（三）实验结果 培养一周左右，倒置显微镜下，可见肝细胞贴壁，以组织块为中心，向四周放射状分布。肝细胞呈多边形，胞体饱满，折光性强，中央有一圆形细胞核。实验操作：小鼠肝组织培养实验操作：小鼠肝组织培养（四）实验地点和分组（四）实验地点和分组 D306 无菌室实验操作 C409 准备室 清洗实验器材 2人一组，10人一批 （第1批操作，第2批准备，请班长协调安排）实验报告：实验报告：小鼠肝组织培养小鼠肝组织培养一、目的二、材料三、方法四、结果五、讨论：注意事项，分析试验中遇到的问题