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1、在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略赵军 侯云云德（病毒基因因工程国家家重点实验验室 10000522 北京） 本世纪660至700年代对大大肠杆菌的的研究使之之成为自然然界中最普普遍为人们们所认识的的生物体。大大肠杆菌具具有两个显显著特征：操作简单单和能在廉廉价的培养养基中高密密度培养，它它的这些特特征加上十十多年外源源基因表达达的经验使使其在大多多数科研应应用中成为为高效表达达异源蛋白白最常用的的原核表达达系统。尽尽管大肠杆杆菌有众多多的优点，但但并非每一一种基因都都能在其中中有效表达达。这归因因于每种基基因都有其其独特的结结构、mRRNA的稳稳定性和翻翻译效率、蛋蛋白质折叠叠的难易程程度、
2、宿主主细胞蛋白白酶对蛋白白质的降解解、外源基基因和E.colii在密码子子利用上的的主要差别别以及蛋白白质对宿主主的潜在毒毒性等等。但但知识的大大量积累还还是有助于于为表达方方面某些特特定的困难难提供一般般的解决方方法。大肠肠杆菌作为为表达系统统的主要障障碍包括：不能象真真核蛋白那那样进行翻翻译后修饰饰、缺乏将将蛋白质有有效释放到到培养基中中的分泌机机制和充分分形成二硫硫键的能力力。另一方方面，许多多真核蛋白白在非糖基基化的形式式下能保留留其生物学学活性，因因而也就可可以用大肠肠杆菌来表表达。如何何实现外源源基因在原原核细胞中中的有效表表达，自660年代以以来，对影影响外源基基因在其表表达体系
3、中中表达效率率的各个因因素作了大大量实验研研究，并有有多篇归纳纳性综述发发表1，22，3。国国内针对外外源基因在在原核细胞胞中高效表表达的关键键因素，构构建了高效效表达载体体4，并在此此基础上成成功表达了了一系列细细胞因子的的基因55，6，77。我们们在分析了了国内外有有关在原核核系统中表表达蛋白的的实验资料料的基础上上，对在大大肠杆菌中中高效表达达外源蛋白白的策略所所涉及的内内容进行全全面的总结结，以期有有助于我国国在这方面面的研究。l 有效表达载载体的构型型 构建表达达质粒需要要多种元件件，需要仔仔细考虑它它们的组合合，以保证证最高水平平的蛋白质质合成。EE.colli表达载载体的基本本结
4、构如图图1所示8。 RBS P RR -35 -100 SD coodingg seqquencce TT TTet Ori -335 -10 Sttop ccodonn TTGAACA(NN)17TATTAAT UAAAU UGAA UAGG SStartt coddon mmRNA 5 UAAGGGAGGG(N)88 AUUG(911%) 16S rRNAA 3HHOAUUUCCUCCC GGUG(88%) UUG(1%) 启动子(以杂和的的tac启动动子为例)位于核糖糖体结合位位点（RBBS）上游游10-1100bpp处，由调调节基因（R）控制，调节基因可以是载体自身携带，也可以整合到宿
5、主染色体上。E.coli的启动子由位于转录起始位点上游约35bp的六核苷酸序列（-35区）和一短序列隔开的另一六核苷酸序列（-10区）组成9,10,11。有许多启动子可用于在E.coli中的基因表达，包括来源于革兰氏阳性菌和噬菌体的启动子。理想的启动子具有以下特性：作用强;可以严格调控;容易转导入其他E.coli以便筛选大量的用于生产蛋白的菌株，而且对其诱导是简便和廉价的12。在启动子下游是RBS，其跨度约为54个核苷酸，两端限定在 -35（2）和mRNA编码序列的+19到+22之间13。Shine-Dalgarno(SD)位点14,15在翻译起始阶段与16S rRNA的3端相互作用16。SD
6、与起始密码子间的距离约为5-13bp17，而且此区的序列在mRNA转录物中应避免出现二级结构，否则将会降低翻译起始的效率18。在RBS的5和3端均为A丰富区19。转录终止子位于编码序列的下游，作为转录终止的信号20和组成发卡结构的保护性元件，阻止核酸外切酶对mRNA的降解，从而延长mRNA的半衰期21。除了上述对对基因表达达的效率有有直接影响响的元件以以外，载体体还含有抗抗生素抗性性基因，以以方便质粒粒的筛选和和传代。氨氨苄青霉素素是最常用用的抗性标标记。但在在生产人用用治疗性蛋蛋白时，最最好选择其其他抗性标标记(如Tet)以避免可可能发生的的过敏反应应22。质粒的的拷贝数由由复制起点点决定。
7、在在特殊情况况下，选用用失控复制制子能够获获得大量的的质粒拷贝贝数和较高高产量的质质粒编码蛋蛋白233，24。但在另另外一些情情况下，选选用超过ppBR3222的高拷拷贝质粒似似乎并没有有好处。而而且已有资资料表明，增增加质粒的的拷贝数降降低E.ccoli中中胰酶的产产量，在高高拷贝质粒粒中，强启启动子的存存在严重影影响了细胞胞的活性25，226。l 转录水平调调控1. 启动子能在E.ccoli中中发挥作用用的启动子子很多。这这些启动子子必须具有有适合高水水平蛋白质质合成的某某些特性。首首先启动子子的作用要要强，待表表达基因的的产物要占占或超过菌菌体总蛋白白的的100-30%；第二，它它必须表
8、现现最低水平平的基础转转录活性。若若要求大量量的基因表表达，最好好选用高密密度培养细细胞和表现现最低活性性的可诱导导和非抑制制启动子。如如果所表达达的蛋白具具有毒性或或限制宿主主细胞的生生长，选用用可抑制的的启动子则则至关重要要27，228。例例如，轮状状病毒的VVP7蛋白白能有效地地杀死细胞胞，因此必必须在严格格控制的条条件下表达达29。但在某某些情况下下，启动子子的严格性性并不合理理，因为即即使最小量量的基因产产物也能由由于其毒性性而杀死细细胞。如能能灭活核糖糖体或破坏坏膜渗透压压的分子对对细胞来说说是致死性性的300。对宿宿主的毒性性并不仅限限于外源基基因，某种种自身蛋白白的过量表表达也
9、能造造成同样的的结果。如如编码外膜膜磷脂蛋白白的traaT基因311。另外外，不完全全抑制的表表达系统会会造成质粒粒的不稳定定，细胞生生长速度的的下降和重重组蛋白产产量的降低低32，333。Lanzzer和Bujaard曾对对常用的llac启动动子-操纵纵子系统进进行了广泛泛的研究，证证明操纵子子放在启动动子序列的的不同位置置会造成770倍差异异的抑制。将将17bpp的操纵子子置于-110和-335六聚体体区之间所所形成的抑抑制比将其其放在-335区的上上游或-110区的下下游要高550-700倍344。启动动子的第三三个特性是是其简便和和廉价的可可诱导性。大大量生产蛋蛋白质最常常用的启动动子
10、是热诱诱导（PL）和化学学诱导(trp)启动子。异异丙基硫代代-D-半半乳糖苷（IIPTG）诱诱导的杂交交启动子ttac335或trc336都是是强启动子子，在基础础研究中应应用很广。但但在大量生生产人用治治疗性蛋白白时用IPPTG做诱诱导剂是不不可取的，因因为IPTTG具有毒毒性而且价价格昂贵37。IIPTG的的这些不足足至今仍限限制tacc或trc强启启动子在大大量生产人人用治疗性性蛋白中的的应用。编编码热敏llac阻遏遏蛋白338的突突变laccI（Ts）基因因的出现使使得目前能能够对这些些启动子进进行热诱导导39，440。另另外，还出出现了一些些新型载体体，它们允允许在300对trc启
11、动动子进行严严紧调节。最最近还报道道了两种不不同的laac阻遏蛋蛋白突变体体，能够同同时允许热热诱导和IIPTG诱诱导411，42。尽管野野生型laacI基因因也能热诱诱导，但不不能对其进进行严紧型型调节，且且不能用于于lacIIq 菌株，因因为温度的的变化不能能遏制由llac阻遏遏蛋白的过过量表达所所造成的严严紧性抑制制43。因此，该该系统只能能用用于生生产对宿主主菌无害的的一些蛋白白。冷反应启动动子尽管不不象其他启启动子那样样得到广泛泛的研究，但但已经被证证明能在低低温条件下下进行有效效的基因表表达。噬菌菌体PL启动子的的活性在220时最高，随随着温度的的升高，其其活性逐渐渐降低444。P
12、L启动子的的冷反应由由E.cooli整合合宿主因子子，一种与与DNA结结合的序列列特异性多多功能蛋白白来正调控控45，446。主主要冷应激激基因csspA启动动子同样也也被证明在在低温具有有活性447。对对cspAA和PL启动子进进行分子剖剖析，鉴定定了在较低低温度下参参与增强转转录的特异异性DNAA区域。从从而开发了了一系列在在20低温具有有高活性的的PL衍生启动动子488。选用用冷反应启启动子的基基本原理是是在15-20的条件下下，蛋白质质的折叠速速度只受到到轻微的影影响，而作作为生物化化学反应，转转录和翻译译的速度将将被充分降降低。这就就为蛋白质质折叠、产产生有活性性的蛋白和和避免非活活
13、性蛋白聚聚合体即包包涵体的形形成提供了了充足的时时间，而目目的蛋白的的最终产量量并未减少少。最近新新报道的一一些启动子子具有诸多多诱人之处处,为选择择新的高效效表达系统统提供了方方便。如非非常强的ppH启动子子49，550,重重组蛋白的的产量可达达总蛋白的的40-550%551。但但表达的水水平会因不不同的基因因而有差异异。因为蛋蛋白质的合合成不仅依依赖于启动动子的强弱弱，而且有有赖于转录录的效率。人们通常只只考虑E.colii启动子的的核心区域域，即-110和-335六核苷苷酸区和一一15-119bp的间隔隔序列。但但有人提出出核心序列列以外的元元件也能刺刺激启动子子的活性52。许许多研究也
14、也已证明，核核心启动子子上游的序序列能够在在体内提高高转录起始始的效率53，554，555。Gourrse等证证明，位于于E.cooli rrRNA启启动子rrrnB PP1 -335区上游游的DNAA序列即UUP元件，能能够在体内内和体外提提高转录效效率30倍倍56。UP元元件是作为为一个独立立的启动子子组件发挥挥作用的，因因为将其融融合到其他他启动子如如lacUUV5中也也能刺激转转录577,58。UP元元件与其他他启动子融融合所表现现的这种转转录增强子子效应，使使其有望通通用于高效效表达系统统。尽管已已经证明rrRNA启启动子P11、P2的的超强能力力59，但它们们仍未被用用于E.cco
15、li进进行高水平平表达，其其主要原因因是难以对对其进行调调控。rRRNA的体体内合成从从属于细胞胞增殖速度度的控制。在在细胞快速速增殖期，PP1和P22是活化的的，当细胞胞处于生长长的静息期期，则P11、P2被被负调节。因因此，rRRNA启动动子在前诱诱导期将持持续活化。在在体内快速速增殖的细细胞中，PP2的活性性很弱，而而且可诱导导性差，但但若与P11分开，PP2启动子子的活性明明显升高（达达到P1的的70%），且且对应激反反应敏感。这这表明在天天然的串联联体中，PP2是部分分关闭的60。Brossius和和Holyy61将lac操纵纵子序列插插入到rrrnB rrRNA P2启动动子的下游
16、游，在带有有lacIqq基因的菌菌株中成功功地抑制了了P2的活活性。转录录活性是以以氯霉素乙乙酰转移酶酶的产生和和4.5ss RNAA的表达为为标准的。然然而，P22构建体的的活性只相相当于taac启动子子活性的11/2，而而且当rrrnB PP1启动子子被置于PP2启动子子下游时，不不能完全抑抑制转录。有有人试图利利用反转启启动子的方方向来严格格调控rRRNA启动动子。将rrRNA启启动子克隆隆于目的基基因的上游游，但转录录方向相反反。利用整合位点点和可调控控的整合酶来来实现启动动子的反转转，从而达达到进行诱诱导的目的的，而且，在在高度活化化的启动子子上游有一一强转录终终止子将避避免在前诱诱
17、导期可能能出现的载载体的不稳稳定性。2. 转录终止子子在原核生生物中，转转录终止有有两种不同同的机制。一一种是依赖赖六聚体蛋蛋白rhoo的rho依赖赖性转录终终止，rhho蛋白能能使新生RRNA转录录本从模板板解离。另另一种是rrho非依依赖性转录录终止，它它特异性依依赖于模板板上编码的的信号，即即在新生RRNA中形形成发卡结结构的一回回文序列区区，和位于于该回文序序列下游44-9bpp处的dA、dT富含区区62,63。虽虽然转录终终止子在表表达质粒的的构建过程程中常被忽忽略，但有有效的转录录终止子是是表达载体体必不可少少的元件，因因为它们具具有极其重重要的作用用。贯穿启启动子的转转录将抑制制
18、启动子的的功能，造造成所谓的的启动子封封堵644。这种种效应可以以通过在编编码序列下下游的适当当位置放置置一转录终终止子，阻阻止转录贯贯穿别的启启动子来避避免。同样样地，在启启动目的基基因的启动动子上游放放置一转录录终止子，将将最大限度度地减小背背景转录65。另另有资料证证明，由强强启动子启启动的转录录会使转录录通读到复复制区，造造成控制质质粒拷贝数数的ROPP蛋白的过过量表达，从从而导致质质粒的不稳稳定666。另外外，转录终终止增强mmRNA的的稳定性67，从从而提高蛋蛋白质的表表达水平。如如果来源于于E.cooli rrrB rrRNA操操纵子的两两个转录终终止子T11和T2串联，则则效果
19、更好好68。但其他他的许多转转录终止子子通常情况况下都是十十分有效的的。 33转录抗抗终止子细菌中许多多参与氨基基酸生物合合成的操纵纵子在其第第一个结构构基因的55端含有转转录衰减子子。衰减子子由特定操操纵子的氨氨基酸产物物调节。这这样关联的的带电荷ttRNA的的存在就会会在核糖体体剪切之后后引导初始始转录本中中二级结构构的形成。如如果没有关关联的带电电荷tRNNA，则会会形成抗终终止子结构构，从而抑抑制终止子子中发卡结结构的形成成和转录的的终止669。抗抗终止元件件能使RNNA 多聚聚酶越过核核糖体RNNA操纵子子中的rho依赖性性终止子即即boxAA70,71。转转录抗终止止是有一个个极其
20、复杂杂的过程，其其中包含许许多已知和和未知因子子。有关这这方面的知知识已有详详尽的综述述。在此我我们主要讨讨论抗终止止元件在EE.colli中表达达外源基因因的应用。在E.cooli表达达系统中作作用比较强强、应用较较广的一个个启动子是是噬菌体TT7晚期启启动子772,733。该系系统的活性性依赖于提提供T7 RNA多多聚酶的转转录单元。RRNA多聚聚酶的严格格阻遏对防防止T7启启动子的渗渗漏是必需需的。有许许多用于调调节T7多多聚酶表达达的途径，但但每一种方方法都有其其各自的缺缺陷。Meertenn等通过构构建一基于于PL调节的反反转衰减TT7 RNNA多聚酶酶表达盒阐阐明了这一一问题。可可
21、以通过在在启动子和和编码T77多聚酶的的基因之间间插入三个个串联排列列的转录终终止子来削削弱T7多多聚酶的基基础表达水水平。在诱诱导的情况况下，噬菌菌体来源的nuutL依赖的抗抗终止功能能也可以协协同来阻止止转录终止止74。来源于于E.coolirrrnB rrRNA操操纵子的转转录抗终止止区已被用用于某些表表达载体如如pSE4220。该载载体应用ttrc启动动子755。其基基本原理是是使得转录录通过重度度二级结构构区，从而而减少宿主主RNA 多聚酶引引起的转录录提前终止止的可能性性。但是rrrnB抗抗终止子在在这种情况况下似乎并并不十分有有效。4严紧型型调节表达达系统可严紧调节节的启动子子的
22、优点使使得我们能能够设计许许多巧妙、可可高度抑制制的表达系系统。这在在表达那些些产物对宿宿主的生长长不利的基基因时尤其其有用。所所用的策略略包括“铺平板”法76；提高抑抑制基因和和操纵基因因的比例77；用突变的的噬菌体感感染诱导28 ；致弱高高拷贝数载载体上的启启动子活性性78；利用转转录终止子子和抗终止止子799；在拷拷贝数可控控的质粒中中使用可诱诱导的启动动子800；使用用“交叉调节节”系统811；共转转导使用SSP6 RRNA多聚聚酶的质粒粒82；利用与与克隆基因因mRNAA互补的反反义RNAA31。最后一一个巧妙的的方法是反反转启动子子：在启动动子两侧为为两个整合位点点，启动子子的方向
23、与与基因的表表达方向相相反，而且且只通过由由整合酶介介导的诱导导位点特意意性遗传重重组来完成成反转883,844。上述这些系系统也各有有其优缺点点。即依赖赖固体培养养基的方法法不适用于于大批量表表达，高水水平抑制系系统常造成成蛋白质产产量的下降降85，这就有有必要优化化抑制基因因和操纵基基因的比例例86。由噬菌体介介导的诱导导更增加了了系统的复复杂性，利利用反转启启动子迂回回方法又引引入了复杂杂的载体结结构。尽管管这些表达达系统大多多数尚未用用于蛋白质质的大规模模、高产量量生产，但但是它们为为基因表达达提供了重重要的工具具。l 翻译水平的的调控1 mRNA翻翻译起始有关转录过过程的大量量知识使
24、得得能够在不不被附近核核苷酸序列列影响的情情况下，在在表达盒中中使用原核核启动子87。对对于决定蛋蛋白质合成成的起始因因素，虽然然尚不能完完全弄清楚楚，但目前前已经明白白，mRNNA转录本本5末端的独独特结构是是mRNAA翻译起始始效率的最最主要决定定因素。至至今还没有有发现通用用的有效起起始翻译的的共同序列列。已知序序列的绝大大部分（991%）EE.colli基因的的翻译起始始区均含有有起始密码码子AUGG，GUGG的利用率率为8%，而而UUG的的利用率则则为1%88,889。Shinne-Daalgarrno(SSD)位点点在翻译起起始阶段与与16S rRNAA的3端相互作作用。SDD与起
25、始密密码子间的的距离约为为5-133bp，这一一距离影响响翻译起始始的效率90。人人们对此进进行了深入入的研究，以以确定最佳佳的SD区区序列和SSD与起始始密码子之之间的最有有效间隔91,992。Ringgquisst等93研究了RRBS的翻翻译功能，得得出了以下下结论：（11）在间隔隔相同的情情况下，UUAAGGGAGG的的SD序列列比AAGGGA的SSD序列能能使蛋白质质的产量提提高3-6倍；（22）对于同同一SD序序列，存在在一最佳的的间隔。AAAGGAA的间隔为为5-7个个核苷酸，而而UAAGGGAGGG的间隔为为4-8个个核苷酸；（3）对对于同一SSD序列，有有一翻译所所必需的最最小
26、间隔。AAAGGAA的最小间间隔为5个个核苷酸，而而UAAGGGAGGG的最小间间隔为3-4个核苷苷酸。这些些间隔提示示，在166S rRRNA的33末端和结结合于核糖糖体P位点点的fMeet-tRRNAf的反义密密码子之间间存在精确确的物理关关系。在mRNAA的翻译起起始区的二二级结构在在决定基因因表达效率率方面具有有重要作用用94,95,996。如如用一发卡卡结构封闭闭SD区和和/或AUUG密码子子就会阻止止其与300S核糖体体亚单位的的结合，从从而抑制翻翻译977。已经经设计了几几种不同的的策略以使使mRNAA形成二级级结构的可可能性最小小。提高RRBS中AA、T残基基的丰度能能增强某些
27、些基因的表表达988。同样样地，突变变SD区上上游或下游游的某些特特定核苷酸酸就会抑制制mRNAA二级结构构的形成和和提高翻译译效率999。另另一途径得得益于在EE.colli中自然然发生的一一种翻译偶偶联现象100。翻译偶偶联的机制制已被用来来解释来自自多顺反子子mRNAA的不同基基因的并列列表达。已已经证明，当当galKK与上游基基因偶联翻翻译时，经经修饰的ggal强启启动子能够够指导半乳乳糖激酶的的高水平合合成。这提提示即使很很弱的RBBS，如果果与核糖体体结合也能能非常有效效。这种调调节机制有有可能在蛋蛋白质超量量生产生物物技术中发发挥重要作作用。事实实上，翻译译偶联已经经被广泛用用于
28、不同基基因的高效效表达。除了SD区区与16SS rRNA结结合之外，mRNA和核糖体的其他相互作用也参与翻译的起始。如核糖体S1蛋白直接参与30S亚基对mRNA的识别和结合101。2 翻译增强子子 已经在细细菌和噬菌菌体中鉴定定了一些在在E.cooli中显显著增强异异源基因表表达的序列列。Oliins等从从T7噬菌菌体基因110前导序序列（ gg10-LL）中鉴定定了一9bbp的序列列，该序列列似乎能替替代有效的的RBS。同同SD共有有序列相比比，g100-L能使使多种基因因的表达水水平提高440-3440倍1102。若若将其置于于合成SDD序列的上上游，按照照-半乳糖糖苷酶的活活性与Laac
29、Z mmRNA的的水平来估估计，g110-L序序列能使 LacZZ的翻译水水平提高1110倍103。另外的的研究小组组在mRNNA的5非翻译区区（UTRR）鉴定了了一U富含含序列，该该序列同样样具有翻译译增强子活活性。MccCartthy等1044在 E.ccoli atpEE基因中紧紧接于SDD位点下游游鉴定一类类似区域。有有文献用一一30bpp的序列超超量产生IIL-2和和IFN-1055。另有有人证明在在编码RNNase D的rnd mRNA SSD位点的的上游，有有一U8序列对该该mRNAA的有效翻翻译是必需需的。缺失失这一区域域会显著降降低翻译，但但不影响rrnd mmRNA的的水平
30、和转转录起始位位点1006。研研究证明这这些类似序序列的靶位位是30SS核糖体亚亚单位的SS1蛋白107。在另一一项有趣的的研究中，研研究者证明明在紧接起起始密码子子下游的序序列在翻译译起始过程程中发挥重重要作用。位位于T7基基因0.33编码区+15至+26之间间或位于TT7基因110编码区区+9至+21之间间被称做下下游框（DDB）的特特定区域具具有翻译增增强子的功功能。DBB区与166S rRRNA的11469-14833核苷酸互互补，这一一区域称做做反下游框框（ADBB）。缺失失DB将废废除翻译活活性。相反反，如果优优化DB和和ADB之之间的互补补则会以最最高水平表表达dhffr融合基基
31、因。有趣趣的是，如如果将DBB从起始密密码子的上上游移到SSD序列的的位置，DDB则失去去功能。DDB序列存存在于一些些E.cooli和噬噬菌体基因因中1008,1009。上述这些发发现充分证证明，除了了SD位点点和起始密密码子以外外，mRNNA中的其其他序列对对于有效的的翻译也是是重要的。尽尽管其精确确的机制还还不太清楚楚，但有可可能利用翻翻译增强子子来达到超超量表达蛋蛋白质的目目的。3 mRNA的的稳定性 mRNAA的快速降降解势必影影响蛋白质质的产生。因因此在这一一部分重点点阐述决定定mRNAA稳定性的的因素，这这将在E.colii高效表达达外源基因因中有实际际应用。在在E.cooli中
32、有有多种不同同的RNaase参与mRNNA的降解解，其中包包括内切核核酸酶（RRNasee E, RNasse K和和RNasse III）和和3外切核酸酸酶（RNNase II和多聚聚核苷酸磷磷酸化酶PNPaase），目目前尚未在在原核细胞胞中发现55外切核酸酸酶1110。mRNAA的降解并并非由非特特异性的外外切核酸酶酶随机剪切切而引起，因因为在mRRNA的长长度和半衰衰期之间并并没有反向向相关性111。已经证证明，在EE.colli中有两两类保护性性元件能够够稳定mRRNA。一一类由mRRNA的55UTRs中的序列列组成1112；另一类类由3UTRs和多顺反反子间区的的发卡结构构组成11
33、13。其其中一些元元件与异源源mRNAA融合后起起稳定剂作作用，但只只在严格的的条件下如如此。例如如，噬菌体体T4基因因32的55UTR在在T4噬菌菌体感染的的细胞中延延长非稳定定mRNAA在E.cooli中的的半衰期114。革兰氏氏阳性菌如如金黄色葡葡萄球菌和和枯草杆菌菌的红霉素素抗性基因因（ermm）编码的的mRNAA 5UTR含含有稳定元元件。但eermC和和ermAA 5UUTRs的的稳定作用用需要由抑抑制翻译和和引起核糖糖体失控的的抗生素来来诱导1115。同同样，噬菌菌体PL对于PL-trp转录录本的稳定定作用需要要噬菌体的的感染1116。与与此相反，E.coli ompA转录本能够
34、在细胞快速增殖的正常情况下延长一系列异源mRNA在E.coli中的稳定性117。Emory等证明，在接近或紧接ompA 5UTR的5末端存在发卡结构对于其稳定效果是必需的。而且可以通过在5末端添加发卡结构来延长在正常情况下不稳定的mRNA的半衰期118。这样看来，对异源基因添加ompA 5稳定元有可能提高E.coli中的基因表达。另一类由3UTR组成的mRNA保护性元件能够形成发卡结构，因而能够阻断外切核酸酶从3末端对转录本的降解113。Wong和Chang119在苏云金杆菌的晶体蛋白基因的转录终止子中鉴定了一个这样的元件。将该“阳性反调节子”与地衣杆菌的青霉素酶基因(penP)的3末端和人I
35、L-2 cDNA融合，能够延长mRNA的半衰期，且提高了相应多肽在枯草杆菌和E.coli中的产量。然而，同某些5稳定元一样，这类3反向调节子不可能作为一个通用的mRNA稳定元。而且有证据表明，可以通过选用缺乏某些特定RNase如RNaseII或PNPase的宿主菌来提高基因的表达。这同样并非一有效途径。因为缺乏RNaseII或PNPase与RNase过量表达一样，对于E.coli整体mRNA的平均半衰期并无多大影响。而且缺乏RNaseII或PNPase的菌株常常是不稳定的120,121。 44翻译终终止 在mRNNA中存在在终止信号号是翻译终终止过程必必不可少的的。除了三三个终止密密码子UAA
36、A、UGGA、和UAG外外，翻译终终止这一复复杂事件还还包括核糖糖体、mRRNA和终终止位点的的几种释放放因子的特特异相互作作用1222。在在E.cooli中，RRF-1在在终止密码码子UGAA处终止翻翻译；RFF-2在UUAA密码码子处终止止翻译1123。最最近还克隆隆了另外一一个因子RRF-3124。在设计表达达载体时，通通常插入三三个终止密密码子以防防止核糖体体的跳跃。在在E.cooli中偏偏向于使用用UAA密密码子1125。一一项对于22000多多个E.ccoli基基因的统计计分析表明明，在终止止密码子和和紧接三联联体的核苷苷酸序列中中存在局部部非随机性性1266。同时时他们还利利用体
37、内终终止试验测测定12个个可能的四四核苷酸“终止信号号”（UAAAN、UGGAN、UUAGN）的的终止力量量。在体内内终止试验验中，通过过其与框架架移位的竞竞争测定其其终止效率率。转录效效率依据终终止密码子子和第四个个核苷酸而而有显著的的差异，这这种差异从从80%（UUAAU）到到7%（UUGAC）不不等。这些些研究表明明，紧接终终止密码子子后的核苷苷酸特性强强烈地影响响E.cooli中的的翻译终止止效率1127。UUAAU是是E.cooli中最最有效的转转录终止序序列。此外外，终止密密码子5末端的邻邻近序列也也影响终止止的效率。因因此，新生生肽中倒数数第二位（-2位）CC-末端氨氨基酸残基基
38、的电荷和和疏水性能能引起多达达30倍不不同的UGGA终止效效率，而在在UAG位位的终止对对于-2位位氨基酸残残基的特性性不敏感128。对于-1位，-螺旋、-链和回回转倾向是是UGA终止止中的决定定因素1129。l 蛋白质靶向向确定将目目的蛋白表表达在特定定的细胞室室，即细胞胞质、细胞胞间质或是是培养基中中，需要权权衡各自的的利弊。1细胞质质表达包涵体的形形成仍然是是在细胞质质中进行基基因表达的的一个主要要障碍。包包涵体虽然然具有多方方面的好处处，但这些些优越之处处与后期繁繁琐的蛋白白重新折叠叠工作、重重叠蛋白的的生物活性性的未知性性以及重叠叠和纯化后后蛋白的总总产量降低低相比，则则显得微不不足
39、道。至至今尚不明明了包涵体体形成的精精确机制。对对于形成和和不形成包包涵体的881种蛋白白质的统计计学分析表表明，有66个主要的的理化指标标与此有关关。这6个个指标是电电荷平均数数、转变形形成的残基基组分、半半胱氨酸组组分、脯氨氨酸组分、亲亲水性和残残基总数。其其中前两个个指标与包包涵体形成成密切相关关。一种基基于这些指指标的模型型可以根据据某种蛋白白质的氨基基酸组成来来预测包涵涵体形成的的可能性。该该模型曾成成功地预测测人T细胞胞受体V5.3在E.cooli中的的可溶性130 。已经建立了了多种策略略以帮助蛋蛋白质天然然空间结构构的形成131。这些策策略包括在在较低温度度下培养细细菌1332
40、，选选择不同的的E.cooli菌株株1333，替换换某些氨基基酸残基134，与分子子伴侣共表表达1335,1336,1337，利利用高溶解解性的多肽肽作为共表表达分子138，在山梨梨糖醇和甘甘氨酸三甲甲内盐存在在时，以低低渗透压培培养和诱导导细胞1139，改改变培养基基的pH值1400。与分分子伴侣共共表达或许许是一种有有望提高蛋蛋白质可溶溶性和折叠叠效率的途途径1441。但但这种策略略似乎具有有蛋白质特特异性1142。即即便在分子子伴侣存在在的条件下下，仍有多多种因素使使得过量表表达的蛋白白不能折叠叠成其天然然构象。这这些因素包包括缺乏二二硫键和/或翻译后后修饰；细细胞质的氧氧化还原状状态妨
41、碍了了二硫键的的形成。在在E.cooli中，有有两条途径径参与二硫硫键的还原原。即硫氧氧还蛋白系系统，该系系统由硫氧氧还蛋白还还原酶和硫硫氧还蛋白白组成；谷谷氧还蛋白白系统，该该系统由谷谷胱甘肽还还原酶、谷谷胱甘肽和和三种谷氧氧还蛋白组组成1443。制制造次还原原细胞质环环境，以利利于二硫键键形成的策策略包括选选用硫氧还还蛋白还原原酶（trrxB）缺缺陷的E.colii菌株,这有助于于巯基还原原势能。蛋白质在细细胞质中被被降解的可可能性比其其他细胞室室要大得多多。因为在在细胞质中中含有大量量的蛋白酶酶。另外，从从细胞质蛋蛋白混合物物中纯化目目的蛋白相相对比较困困难，因为为在此细胞胞室包含总总细
42、胞蛋白白的绝大部部分蛋白144。2细胞外外周质表达达在细胞外周周质进行蛋蛋白质表达达有许多优优越之处。在在外周质只只有4%的的总细胞蛋蛋白，这显显然有利于于目的蛋白白的纯化，外外周质的氧氧化环境有有利于蛋白白质的正确确折叠，在在转移到外外周质的过过程中，信信号肽在细细胞内剪切切更有可能能产生目的的蛋白的天天然N-末末端。此外外，外周质质中的蛋白白质降解也也少得多145。蛋白质质通过内膜膜转运到外外周质需要要信号肽146，1147，1148。许许多原核和和真核细胞胞来源的信信号肽已成成功地用于于Ecolli中蛋白白质从内膜膜到外周质质的转运。如如E.cooli的PhoAA信号1449、OmpAA
43、1500、OmpTT1511、LamBB和OmpFF1522以及金金黄色葡萄萄球菌的AA蛋白1153，鼠鼠RNasse1554和人人生长激素素信号肽155等。但是是，蛋白质质转运到细细菌外周质质是一个特特别复杂和和尚未完全全明了的过过程，信号号肽的存在在并不总能能保证有效效的蛋白质质通过内膜膜转运1156。改改善蛋白质质转运到外外周质的策策略包括提提供蛋白质质转运和加加工所需的的成分：过过量表达信信号肽酶II1577，利用用prlFF突变株1158，共共表达参与与膜转运的的几种蛋白白质，降低低蛋白质的的表达水平平以防止转转运工具的的过载1159。3 细胞外分泌泌（外泌） 将蛋白质质分泌到细细胞
44、外是人人们最期望望的一种策策略。因为为这样容易易纯化目的的蛋白质，减减少细菌的的蛋白酶对对目的蛋白白质的裂解解。但是，E.coli在正常情况下只有很少量的蛋白质分泌到细胞外。要解决蛋白质外泌方面的难题，必须弄清E.coli的分泌途径。Pugsley160对革兰氏阴性菌的分泌途径进行了详细的研究。在E.coli中将蛋白质分泌到培养基中的方法大致分为两类：（1）利用已有的“真正”的分泌蛋白所采用的途径161；（2）利用信号肽序列、融合伴侣和具有穿透能力的因子。第一种方法具有将目的蛋白质特异性分泌的优点，并最小限度地减少了非目的蛋白的污染。最突出的例子是溶血素基因，该基因曾被用于构建分泌的杂交蛋白1
45、62，163；第二种方法依赖于有限渗透的诱导而导致蛋白质的分泌。例如应用pelB164、ompA165和A蛋白引导序列153，166；与细菌素释放蛋白的共表达167；丝裂霉素诱导的细菌素释放蛋白和在培养基中添加甘氨酸168以及与kil基因共表达而进行膜穿透169。但通常情况下，外泌蛋白质的产量是中等的。有文献报道170，在大肠杆菌表达系统中，金黄色葡萄球菌A蛋白的信号肽能引导带有E结构域的A蛋白片段或融合产物从细胞质外泌到培养基中，蛋白的外泌表达发生于细胞生长后期。但所用的启动子为A蛋白自身的启动子，该启动子在大肠杆菌中为非可控性的组成性表达，且强度较弱。如果能利用可控的强启动子进行A蛋白信号肽引导的基因表达，则有望在蛋白质外泌方面有所突破。目前我们正在进行这方面的尝试，且已经取得初步成效。l 密码子的使使用原核和真真核生物的的基因对同同义密码子子的使用均均表现非随随机性1171，1172。对对E.cooli中密密码子的使使用频率进进行系统分分析得到以以下结论173：（1）对对于绝大多多数的简并并密码子中中的一个或或两个具有有偏好；（22）某些密密码子对所所有不同的的基因都是是最常用的的，无论蛋蛋白质的含含量多少，例例如CCGG是脯