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1、在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略赵军 侯云德（病毒基因工程国家重点实验室 100052 北京） 本世纪660至770年代代对大肠肠杆菌的的研究使使之成为为自然界界中最普普遍为人人们所认认识的生生物体。大大肠杆菌菌具有两两个显著著特征：操作简简单和能能在廉价价的培养养基中高高密度培培养，它它的这些些特征加加上十多多年外源源基因表表达的经经验使其其在大多多数科研研应用中中成为高高效表达达异源蛋蛋白最常常用的原原核表达达系统。尽尽管大肠肠杆菌有有众多的的优点，但但并非每每一种基基因都能能在其中中有效表表达。这这归因于于每种基基因都有有其独特特的结构构、mRRNA的的稳定性性和翻译译效率、蛋蛋白质折
2、折叠的难难易程度度、宿主主细胞蛋蛋白酶对对蛋白质质的降解解、外源源基因和和E.ccolii在密码码子利用用上的主主要差别别以及蛋蛋白质对对宿主的的潜在毒毒性等等等。但知知识的大大量积累累还是有有助于为为表达方方面某些些特定的的困难提提供一般般的解决决方法。大大肠杆菌菌作为表表达系统统的主要要障碍包包括：不不能象真真核蛋白白那样进进行翻译译后修饰饰、缺乏乏将蛋白白质有效效释放到到培养基基中的分分泌机制制和充分分形成二二硫键的的能力。另另一方面面，许多多真核蛋蛋白在非非糖基化化的形式式下能保保留其生生物学活活性，因因而也就就可以用用大肠杆杆菌来表表达。如如何实现现外源基基因在原原核细胞胞中的有有效
3、表达达，自660年代代以来，对对影响外外源基因因在其表表达体系系中表达达效率的的各个因因素作了了大量实实验研究究，并有有多篇归归纳性综综述发表表1，22，3。国内内针对外外源基因因在原核核细胞中中高效表表达的关关键因素素，构建建了高效效表达载载体4，并在在此基础础上成功功表达了了一系列列细胞因因子的基基因55，6，77。我我们在分分析了国国内外有有关在原原核系统统中表达达蛋白的的实验资资料的基基础上，对对在大肠肠杆菌中中高效表表达外源源蛋白的的策略所所涉及的的内容进进行全面面的总结结，以期期有助于于我国在在这方面面的研究究。l 有效表达载载体的构构型 构建表达达质粒需需要多种种元件，需需要仔细
4、细考虑它它们的组组合，以以保证最最高水平平的蛋白白质合成成。E.colli表达达载体的的基本结结构如图图1所示示8。 RBBS PP R -335 -100 SSD coodinng ssequuencce TT Tett Orii -335 -10 Sttop coddon TTGGACAA(N)17TAATAAAT UAAAU UUGA UUAG SStarrt ccodoon mRNNA 55 UAAAGGAAGG(N)88 AAUG(91%) 16SS rRRNA 3HHOAUUUCCCUCCC GUGG(8%) UUUG(11%) 启动子(以杂和和的taac启动动子为例例)位于于核糖
5、体体结合位位点（RRBS）上上游100-1000bpp处，由由调节基基因（RR）控制制，调节节基因可可以是载载体自身身携带，也也可以整整合到宿宿主染色色体上。E.coli的启动子由位于转录起始位点上游约35bp的六核苷酸序列（-35区）和一短序列隔开的另一六核苷酸序列（-10区）组成9,10,11。有许多启动子可用于在E.coli中的基因表达，包括来源于革兰氏阳性菌和噬菌体的启动子。理想的启动子具有以下特性：作用强;可以严格调控;容易转导入其他E.coli以便筛选大量的用于生产蛋白的菌株，而且对其诱导是简便和廉价的12。在启动子下游是RBS，其跨度约为54个核苷酸，两端限定在 -35（2）和m
6、RNA编码序列的+19到+22之间13。Shine-Dalgarno(SD)位点14,15在翻译起始阶段与16S rRNA的3端相互作用16。SD与起始密码子间的距离约为5-13bp17，而且此区的序列在mRNA转录物中应避免出现二级结构，否则将会降低翻译起始的效率18。在RBS的5和3端均为A丰富区19。转录终止子位于编码序列的下游，作为转录终止的信号20和组成发卡结构的保护性元件，阻止核酸外切酶对mRNA的降解，从而延长mRNA的半衰期21。除了上述对对基因表表达的效效率有直直接影响响的元件件以外，载载体还含含有抗生生素抗性性基因，以以方便质质粒的筛筛选和传传代。氨氨苄青霉霉素是最最常用的
7、的抗性标标记。但但在生产产人用治治疗性蛋蛋白时，最最好选择择其他抗抗性标记记(如Tett)以避免免可能发发生的过过敏反应应222。质质粒的拷拷贝数由由复制起起点决定定。在特特殊情况况下，选选用失控控复制子子能够获获得大量量的质粒粒拷贝数数和较高高产量的的质粒编编码蛋白白233，244。但但在另外外一些情情况下，选选用超过过pBRR3222的高拷拷贝质粒粒似乎并并没有好好处。而而且已有有资料表表明，增增加质粒粒的拷贝贝数降低低E.ccolii中胰酶酶的产量量，在高高拷贝质质粒中，强强启动子子的存在在严重影影响了细细胞的活活性225，226。l 转录水平调调控1. 启动子能在E.ccolii中发挥
8、挥作用的的启动子子很多。这这些启动动子必须须具有适适合高水水平蛋白白质合成成的某些些特性。首首先启动动子的作作用要强强，待表表达基因因的产物物要占或或超过菌菌体总蛋蛋白的的的10-30%；第二二，它必必须表现现最低水水平的基基础转录录活性。若若要求大大量的基基因表达达，最好好选用高高密度培培养细胞胞和表现现最低活活性的可可诱导和和非抑制制启动子子。如果果所表达达的蛋白白具有毒毒性或限限制宿主主细胞的的生长，选选用可抑抑制的启启动子则则至关重重要227，228。例例如，轮轮状病毒毒的VPP7蛋白白能有效效地杀死死细胞，因因此必须须在严格格控制的的条件下下表达29。但在在某些情情况下，启启动子的的
9、严格性性并不合合理，因因为即使使最小量量的基因因产物也也能由于于其毒性性而杀死死细胞。如如能灭活活核糖体体或破坏坏膜渗透透压的分分子对细细胞来说说是致死死性的30。对宿宿主的毒毒性并不不仅限于于外源基基因，某某种自身身蛋白的的过量表表达也能能造成同同样的结结果。如如编码外外膜磷脂脂蛋白的的traaT基因331。另另外，不不完全抑抑制的表表达系统统会造成成质粒的的不稳定定，细胞胞生长速速度的下下降和重重组蛋白白产量的的降低32，333。Lannzerr和Bujjardd曾对常常用的llac启启动子-操纵子子系统进进行了广广泛的研研究，证证明操纵纵子放在在启动子子序列的的不同位位置会造造成700倍
10、差异异的抑制制。将117bpp的操纵纵子置于于-100和-335六聚聚体区之之间所形形成的抑抑制比将将其放在在-355区的上上游或-10区区的下游游要高550-770倍34。启动动子的第第三个特特性是其其简便和和廉价的的可诱导导性。大大量生产产蛋白质质最常用用的启动动子是热热诱导（PL）和化学诱导(trp)启动子。异丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG）诱导的杂交启动子tac35或trc36都是强启动子，在基础研究中应用很广。但在大量生产人用治疗性蛋白时用IPTG做诱导剂是不可取的，因为IPTG具有毒性而且价格昂贵37。IPTG的这些不足至今仍限制tac或trc强启动子在大量生产人用治疗性蛋白中的
11、应用。编码热敏lac阻遏蛋白38的突变lacI（Ts）基因的出现使得目前能够对这些启动子进行热诱导39，40。另外，还出现了一些新型载体，它们允许在30对trc启动子进行严紧调节。最近还报道了两种不同的lac阻遏蛋白突变体，能够同时允许热诱导和IPTG诱导41，42。尽管野生型lacI基因也能热诱导，但不能对其进行严紧型调节，且不能用于lacIq 菌株，因为温度的变化不能遏制由lac阻遏蛋白的过量表达所造成的严紧性抑制43。因此，该系统只能用用于生产对宿主菌无害的一些蛋白。冷反应启动动子尽管管不象其其他启动动子那样样得到广广泛的研研究，但但已经被被证明能能在低温温条件下下进行有有效的基基因表达
12、达。噬菌菌体PL启动子子的活性性在200时最高高，随着着温度的的升高，其其活性逐逐渐降低低444。PL启动子子的冷反反应由EE.cooli整整合宿主主因子，一一种与DDNA结结合的序序列特异异性多功功能蛋白白来正调调控445，446。主主要冷应应激基因因csppA启动动子同样样也被证证明在低低温具有有活性47。对csspA和和PL启动子子进行分分子剖析析，鉴定定了在较较低温度度下参与与增强转转录的特特异性DDNA区区域。从从而开发发了一系系列在220低温具具有高活活性的PPL衍生启启动子48。选用用冷反应应启动子子的基本本原理是是在155-200的条件件下，蛋蛋白质的的折叠速速度只受受到轻微微
13、的影响响，而作作为生物物化学反反应，转转录和翻翻译的速速度将被被充分降降低。这这就为蛋蛋白质折折叠、产产生有活活性的蛋蛋白和避避免非活活性蛋白白聚合体体即包涵涵体的形形成提供供了充足足的时间间，而目目的蛋白白的最终终产量并并未减少少。最近近新报道道的一些些启动子子具有诸诸多诱人人之处,为选择择新的高高效表达达系统提提供了方方便。如如非常强强的pHH启动子子499，500,重重组蛋白白的产量量可达总总蛋白的的40-50%511。但但表达的的水平会会因不同同的基因因而有差差异。因因为蛋白白质的合合成不仅仅依赖于于启动子子的强弱弱，而且且有赖于于转录的的效率。人们通常只只考虑EE.cooli启启动子
14、的的核心区区域，即即-100和-335六核核苷酸区区和一115-119bpp的间隔隔序列。但但有人提提出核心心序列以以外的元元件也能能刺激启启动子的的活性52。许多多研究也也已证明明，核心心启动子子上游的的序列能能够在体体内提高高转录起起始的效效率553，554，555。Gouursee等证明明，位于于E.ccolii rRRNA启启动子rrrnBB P11 -335区上上游的DDNA序序列即UUP元件件，能够够在体内内和体外外提高转转录效率率30倍倍566。UUP元件件是作为为一个独独立的启启动子组组件发挥挥作用的的，因为为将其融融合到其其他启动动子如llacUUV5中中也能刺刺激转录录57
15、7,588。UUP元件件与其他他启动子子融合所所表现的的这种转转录增强强子效应应，使其其有望通通用于高高效表达达系统。尽尽管已经经证明rrRNAA启动子子P1、PP2的超超强能力力599，但但它们仍仍未被用用于E.colli进行行高水平平表达，其其主要原原因是难难以对其其进行调调控。rrRNAA的体内内合成从从属于细细胞增殖殖速度的的控制。在在细胞快快速增殖殖期，PP1和PP2是活活化的，当当细胞处处于生长长的静息息期，则则P1、PP2被负负调节。因因此，rrRNAA启动子子在前诱诱导期将将持续活活化。在在体内快快速增殖殖的细胞胞中，PP2的活活性很弱弱，而且且可诱导导性差，但但若与PP1分开
16、开，P22启动子子的活性性明显升升高（达达到P11的700%），且且对应激激反应敏敏感。这这表明在在天然的的串联体体中，PP2是部部分关闭闭的660。Broosiuus和Holly661将将lacc操纵子子序列插插入到rrrnBB rRRNA P2启启动子的的下游，在在带有llacIIq基因因的菌株株中成功功地抑制制了P22的活性性。转录录活性是是以氯霉霉素乙酰酰转移酶酶的产生生和4.5s RNAA的表达达为标准准的。然然而，PP2构建建体的活活性只相相当于ttac启启动子活活性的11/2，而而且当rrrnBB P11启动子子被置于于P2启启动子下下游时，不不能完全全抑制转转录。有有人试图图利
17、用反反转启动动子的方方向来严严格调控控rRNNA启动动子。将将rRNNA启动动子克隆隆于目的的基因的的上游，但但转录方方向相反反。利用用整合位位点和可可调控的的整合酶酶来实现现启动子子的反转转，从而而达到进进行诱导导的目的的，而且且，在高高度活化化的启动动子上游游有一强强转录终终止子将将避免在在前诱导导期可能能出现的的载体的的不稳定定性。2. 转录终止子子在原核生生物中，转转录终止止有两种种不同的的机制。一一种是依依赖六聚聚体蛋白白rhoo的rhoo依赖性性转录终终止，rrho蛋蛋白能使使新生RRNA转转录本从从模板解解离。另另一种是是rhoo非依赖赖性转录录终止，它它特异性性依赖于于模板上上
18、编码的的信号，即即在新生生RNAA中形成成发卡结结构的一一回文序序列区，和和位于该该回文序序列下游游4-99bp处的的dA、dT富含含区662,663。虽虽然转录录终止子子在表达达质粒的的构建过过程中常常被忽略略，但有有效的转转录终止止子是表表达载体体必不可可少的元元件，因因为它们们具有极极其重要要的作用用。贯穿穿启动子子的转录录将抑制制启动子子的功能能，造成成所谓的的启动子子封堵64。这种种效应可可以通过过在编码码序列下下游的适适当位置置放置一一转录终终止子，阻阻止转录录贯穿别别的启动动子来避避免。同同样地，在在启动目目的基因因的启动动子上游游放置一一转录终终止子，将将最大限限度地减减小背景
19、景转录65。另有有资料证证明，由由强启动动子启动动的转录录会使转转录通读读到复制制区，造造成控制制质粒拷拷贝数的的ROPP蛋白的的过量表表达，从从而导致致质粒的的不稳定定666。另另外，转转录终止止增强mmRNAA的稳定定性667，从从而提高高蛋白质质的表达达水平。如如果来源源于E.colli rrrB rRNNA操纵纵子的两两个转录录终止子子T1和T2串联联，则效效果更好好688。但但其他的的许多转转录终止止子通常常情况下下都是十十分有效效的。 33转录录抗终止止子细菌中许多多参与氨氨基酸生生物合成成的操纵纵子在其其第一个个结构基基因的55端含有有转录衰衰减子。衰衰减子由由特定操操纵子的的氨
20、基酸酸产物调调节。这这样关联联的带电电荷tRRNA的的存在就就会在核核糖体剪剪切之后后引导初初始转录录本中二二级结构构的形成成。如果果没有关关联的带带电荷ttRNAA，则会会形成抗抗终止子子结构，从从而抑制制终止子子中发卡卡结构的的形成和和转录的的终止69。抗终终止元件件能使RRNA 多聚酶酶越过核核糖体RRNA操操纵子中中的rho依赖赖性终止止子即bboxAA700,711。转转录抗终终止是有有一个极极其复杂杂的过程程，其中中包含许许多已知知和未知知因子。有有关这方方面的知知识已有有详尽的的综述。在在此我们们主要讨讨论抗终终止元件件在E.colli中表表达外源源基因的的应用。在E.cooli
21、表表达系统统中作用用比较强强、应用用较广的的一个启启动子是是噬菌体体T7晚晚期启动动子772,773。该该系统的的活性依依赖于提提供T77 RNNA多聚聚酶的转转录单元元。RNNA多聚聚酶的严严格阻遏遏对防止止T7启启动子的的渗漏是是必需的的。有许许多用于于调节TT7多聚聚酶表达达的途径径，但每每一种方方法都有有其各自自的缺陷陷。Meerteen等通通过构建建一基于于PL调节的的反转衰衰减T77 RNNA多聚聚酶表达达盒阐明明了这一一问题。可可以通过过在启动动子和编编码T77多聚酶酶的基因因之间插插入三个个串联排排列的转转录终止止子来削削弱T77多聚酶酶的基础础表达水水平。在在诱导的的情况下下
22、，噬菌菌体来源的的nuttL依赖的的抗终止止功能也也可以协协同来阻阻止转录录终止74。来源源于E.collirrrnB rRNNA操纵纵子的转转录抗终终止区已已被用于于某些表表达载体体如pSE4420。该该载体应应用trrc启动动子775。其其基本原原理是使使得转录录通过重重度二级级结构区区，从而而减少宿宿主RNNA 多多聚酶引引起的转转录提前前终止的的可能性性。但是是rrnnB抗终终止子在在这种情情况下似似乎并不不十分有有效。4严紧型型调节表表达系统统可严紧调节节的启动动子的优优点使得得我们能能够设计计许多巧巧妙、可可高度抑抑制的表表达系统统。这在在表达那那些产物物对宿主主的生长长不利的的基
23、因时时尤其有有用。所所用的策策略包括括“铺平板板”法766；提提高抑制制基因和和操纵基基因的比比例777；用突变变的噬菌菌体感染染诱导28 ；致致弱高拷拷贝数载载体上的的启动子子活性78；利用用转录终终止子和和抗终止止子779；在拷贝贝数可控控的质粒粒中使用用可诱导导的启动动子880；使用“交叉调调节”系统881；共转导导使用SSP6 RNAA多聚酶酶的质粒粒822；利利用与克克隆基因因mRNNA互补补的反义义RNAA311。最最后一个个巧妙的的方法是是反转启启动子：在启动动子两侧侧为两个个整合位位点，启启动子的的方向与与基因的的表达方方向相反反，而且且只通过过由整合酶酶介导的的诱导位位点特意
24、意性遗传传重组来来完成反反转883,884。上述这些系系统也各各有其优优缺点。即即依赖固固体培养养基的方方法不适适用于大大批量表表达，高高水平抑抑制系统统常造成成蛋白质质产量的的下降85，这就就有必要要优化抑抑制基因因和操纵纵基因的的比例86。由噬菌体体介导的的诱导更更增加了了系统的的复杂性性，利用用反转启启动子迂迂回方法法又引入入了复杂杂的载体体结构。尽尽管这些些表达系系统大多多数尚未未用于蛋蛋白质的的大规模模、高产产量生产产，但是是它们为为基因表表达提供供了重要要的工具具。l 翻译水平的的调控1 mRNA翻翻译起始始有关转录过过程的大大量知识识使得能能够在不不被附近近核苷酸酸序列影影响的情
25、情况下，在在表达盒盒中使用用原核启启动子87。对于于决定蛋蛋白质合合成的起起始因素素，虽然然尚不能能完全弄弄清楚，但但目前已已经明白白，mRRNA转转录本55末端的的独特结结构是mmRNAA翻译起起始效率率的最主主要决定定因素。至至今还没没有发现现通用的的有效起起始翻译译的共同同序列。已已知序列列的绝大大部分（991%）E.coli基因的翻译起始区均含有起始密码子AUG，GUG的利用率为8%，而UUG的利用率则为1%88,89。Shine-Dalgarno(SD)位点在翻译起始阶段与16S rRNA的3端相互作用。SD与起始密码子间的距离约为5-13bp，这一距离影响翻译起始的效率90。人们对
26、此进行了深入的研究，以确定最佳的SD区序列和SD与起始密码子之间的最有效间隔91,92。Ringquist等93研究了RBS的翻译功能，得出了以下结论：（1）在间隔相同的情况下，UAAGGAGG的SD序列比AAGGA的SD序列能使蛋白质的产量提高3-6倍；（2）对于同一SD序列，存在一最佳的间隔。AAGGA的间隔为5-7个核苷酸，而UAAGGAGG的间隔为4-8个核苷酸；（3）对于同一SD序列，有一翻译所必需的最小间隔。AAGGA的最小间隔为5个核苷酸，而UAAGGAGG的最小间隔为3-4个核苷酸。这些间隔提示，在16S rRNA的3末端和结合于核糖体P位点的fMet-tRNAf的反义密码子之
27、间存在精确的物理关系。在mRNAA的翻译译起始区区的二级级结构在在决定基基因表达达效率方方面具有有重要作作用994,995,996。如如用一发发卡结构构封闭SSD区和和/或AAUG密密码子就就会阻止止其与330S核核糖体亚亚单位的的结合，从从而抑制制翻译97。已经经设计了了几种不不同的策策略以使使mRNNA形成成二级结结构的可可能性最最小。提提高RBBS中AA、T残残基的丰丰度能增增强某些些基因的的表达98。同样样地，突突变SDD区上游游或下游游的某些些特定核核苷酸就就会抑制制mRNNA二级级结构的的形成和和提高翻翻译效率率999。另另一途径径得益于于在E.colli中自自然发生生的一种种翻译
28、偶偶联现象象1000。翻译译偶联的的机制已已被用来来解释来来自多顺顺反子mmRNAA的不同同基因的的并列表表达。已已经证明明，当ggalKK与上游游基因偶偶联翻译译时，经经修饰的的gall强启动动子能够够指导半半乳糖激激酶的高高水平合合成。这这提示即即使很弱弱的RBBS，如如果与核核糖体结结合也能能非常有有效。这这种调节节机制有有可能在在蛋白质质超量生生产生物物技术中中发挥重重要作用用。事实实上，翻翻译偶联联已经被被广泛用用于不同同基因的的高效表表达。除了SD区区与166S rrRNAA结合之之外，mmRNAA和核糖糖体的其其他相互互作用也也参与翻翻译的起起始。如如核糖体体S1蛋蛋白直接接参与
29、330S亚亚基对mmRNAA的识别别和结合合1001。2 翻译增强子子 已经在在细菌和和噬菌体体中鉴定定了一些些在E.colli中显显著增强强异源基基因表达达的序列列。Ollinss等从TT7噬菌菌体基因因10前前导序列列（ gg10-L）中中鉴定了了一9bbp的序序列，该该序列似似乎能替替代有效效的RBBS。同同SD共共有序列列相比，g10-L能使多种基因的表达水平提高40-340倍102。若将其置于合成SD序列的上游，按照-半乳糖苷酶的活性与LacZ mRNA的水平来估计，g10-L序列能使 LacZ的翻译水平提高110倍103。另外的研究小组在mRNA的5非翻译区（UTR）鉴定了一U富含
30、序列，该序列同样具有翻译增强子活性。McCarthy等104在 E.coli atpE基因中紧接于SD位点下游鉴定一类似区域。有文献用一30bp的序列超量产生IL-2和IFN-105。另有人证明在编码RNase D的rnd mRNA SD位点的上游，有一U8序列对该mRNA的有效翻译是必需的。缺失这一区域会显著降低翻译，但不影响rnd mRNA的水平和转录起始位点106。研究证明这些类似序列的靶位是30S核糖体亚单位的S1蛋白107。在另一项有趣的研究中，研究者证明在紧接起始密码子下游的序列在翻译起始过程中发挥重要作用。位于T7基因0.3编码区+15至+26之间或位于T7基因10编码区+9至+
31、21之间被称做下游框（DB）的特定区域具有翻译增强子的功能。DB区与16S rRNA的1469-1483核苷酸互补，这一区域称做反下游框（ADB）。缺失DB将废除翻译活性。相反，如果优化DB和ADB之间的互补则会以最高水平表达dhfr融合基因。有趣的是，如果将DB从起始密码子的上游移到SD序列的位置，DB则失去功能。DB序列存在于一些E.coli和噬菌体基因中108,109。上述这些发发现充分分证明，除除了SDD位点和和起始密密码子以以外，mmRNAA中的其其他序列列对于有有效的翻翻译也是是重要的的。尽管管其精确确的机制制还不太太清楚，但但有可能能利用翻翻译增强强子来达达到超量量表达蛋蛋白质的
32、的目的。3 mRNA的的稳定性性 mRNNA的快快速降解解势必影影响蛋白白质的产产生。因因此在这这一部分分重点阐阐述决定定mRNNA稳定定性的因因素，这这将在EE.cooli高高效表达达外源基基因中有有实际应应用。在在E.ccolii中有多多种不同同的RNNasee参与mRRNA的的降解，其其中包括括内切核核酸酶（RNase E, RNase K和RNase III）和3外切核酸酶（RNase II和多聚核苷酸磷酸化酶PNPase），目前尚未在原核细胞中发现5外切核酸酶110。mRNA的降解并非由非特异性的外切核酸酶随机剪切而引起，因为在mRNA的长度和半衰期之间并没有反向相关性111。已经证
33、明，在E.coli中有两类保护性元件能够稳定mRNA。一类由mRNA的5UTRs中的序列组成112；另一类由3UTRs和多顺反子间区的发卡结构组成113。其中一些元件与异源mRNA融合后起稳定剂作用，但只在严格的条件下如此。例如，噬菌体T4基因32的5UTR在T4噬菌体感染的细胞中延长非稳定mRNA在E.coli中的半衰期114。革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的红霉素抗性基因（erm）编码的mRNA 5UTR含有稳定元件。但ermC和ermA 5UTRs的稳定作用需要由抑制翻译和引起核糖体失控的抗生素来诱导115。同样，噬菌体PL对于PL-trp转录本的稳定作用需要噬菌体的感染116。
34、与此相反，E.coli ompA转录本能够在细胞快速增殖的正常情况下延长一系列异源mRNA在E.coli中的稳定性117。Emory等证明，在接近或紧接ompA 5UTR的5末端存在发卡结构对于其稳定效果是必需的。而且可以通过在5末端添加发卡结构来延长在正常情况下不稳定的mRNA的半衰期118。这样看来，对异源基因添加ompA 5稳定元有可能提高E.coli中的基因表达。另一类由3UTR组成的mRNA保护性元件能够形成发卡结构，因而能够阻断外切核酸酶从3末端对转录本的降解113。Wong和Chang119在苏云金杆菌的晶体蛋白基因的转录终止子中鉴定了一个这样的元件。将该“阳性反调节子”与地衣杆
35、菌的青霉素酶基因(penP)的3末端和人IL-2 cDNA融合，能够延长mRNA的半衰期，且提高了相应多肽在枯草杆菌和E.coli中的产量。然而，同某些5稳定元一样，这类3反向调节子不可能作为一个通用的mRNA稳定元。而且有证据表明，可以通过选用缺乏某些特定RNase如RNaseII或PNPase的宿主菌来提高基因的表达。这同样并非一有效途径。因为缺乏RNaseII或PNPase与RNase过量表达一样，对于E.coli整体mRNA的平均半衰期并无多大影响。而且缺乏RNaseII或PNPase的菌株常常是不稳定的120,121。 44翻译译终止 在mRNNA中存存在终止止信号是是翻译终终止过程
36、程必不可可少的。除除了三个个终止密密码子UUAA、UUGA、和UAG外外，翻译译终止这这一复杂杂事件还还包括核核糖体、mRNA和终止位点的几种释放因子的特异相互作用122。在E.coli中，RF-1在终止密码子UGA处终止翻译；RF-2在UAA密码子处终止翻译123。最近还克隆了另外一个因子RF-3124。在设计表达达载体时时，通常常插入三三个终止止密码子子以防止止核糖体体的跳跃跃。在EE.cooli中中偏向于于使用UUAA密密码子1255。一一项对于于20000多个个E.ccolii基因的的统计分分析表明明，在终终止密码码子和紧紧接三联联体的核核苷酸序序列中存存在局部部非随机机性1126。同
37、时时他们还还利用体体内终止止试验测测定122个可能能的四核核苷酸“终止信信号”（UAAAN、UUGANN、UAAGN）的的终止力力量。在在体内终终止试验验中，通通过其与与框架移移位的竞竞争测定定其终止止效率。转转录效率率依据终终止密码码子和第第四个核核苷酸而而有显著著的差异异，这种种差异从从80%（UAAAU）到到7%（UUGACC）不等等。这些些研究表表明，紧紧接终止止密码子子后的核核苷酸特特性强烈烈地影响响E.ccolii中的翻翻译终止止效率1277。UUAAUU是E.colli中最最有效的的转录终终止序列列。此外外，终止止密码子子5末端的的邻近序序列也影影响终止止的效率率。因此此，新生生
38、肽中倒倒数第二二位（-2位）CC-末端端氨基酸酸残基的的电荷和和疏水性性能引起起多达330倍不不同的UUGA终终止效率率，而在在UAGG位的终终止对于于-2位位氨基酸酸残基的的特性不不敏感1288。对对于-11位，-螺旋旋、-链和和回转倾倾向是UUGA终终止中的的决定因因素1129。l 蛋白质靶向向确定将目目的蛋白白表达在在特定的的细胞室室，即细细胞质、细细胞间质质或是培培养基中中，需要要权衡各各自的利利弊。1细胞质质表达包涵体的形形成仍然然是在细细胞质中中进行基基因表达达的一个个主要障障碍。包包涵体虽虽然具有有多方面面的好处处，但这这些优越越之处与与后期繁繁琐的蛋蛋白重新新折叠工工作、重重叠
39、蛋白白的生物物活性的的未知性性以及重重叠和纯纯化后蛋蛋白的总总产量降降低相比比，则显显得微不不足道。至至今尚不不明了包包涵体形形成的精精确机制制。对于于形成和和不形成成包涵体体的811种蛋白白质的统统计学分分析表明明，有66个主要要的理化化指标与与此有关关。这66个指标标是电荷荷平均数数、转变变形成的的残基组组分、半半胱氨酸酸组分、脯脯氨酸组组分、亲亲水性和和残基总总数。其其中前两两个指标标与包涵涵体形成成密切相相关。一一种基于于这些指指标的模模型可以以根据某某种蛋白白质的氨氨基酸组组成来预预测包涵涵体形成成的可能能性。该该模型曾曾成功地地预测人人T细胞胞受体VV5.3在E.ccolii中的可
40、可溶性1300 。已经建立了了多种策策略以帮帮助蛋白白质天然然空间结结构的形形成1131。这些些策略包包括在较较低温度度下培养养细菌1322，选选择不同同的E.colli菌株株1333，替替换某些些氨基酸酸残基1344，与与分子伴伴侣共表表达1135,1366,1337，利利用高溶溶解性的的多肽作作为共表表达分子子1338，在在山梨糖糖醇和甘甘氨酸三三甲内盐盐存在时时，以低低渗透压压培养和和诱导细细胞1139，改变变培养基基的pHH值1440。与与分子伴伴侣共表表达或许许是一种种有望提提高蛋白白质可溶溶性和折折叠效率率的途径径1441。但但这种策策略似乎乎具有蛋蛋白质特特异性1422。即即便在
41、分分子伴侣侣存在的的条件下下，仍有有多种因因素使得得过量表表达的蛋蛋白不能能折叠成成其天然然构象。这这些因素素包括缺缺乏二硫硫键和/或翻译译后修饰饰；细胞胞质的氧氧化还原原状态妨妨碍了二二硫键的的形成。在在E.ccolii中，有有两条途途径参与与二硫键键的还原原。即硫硫氧还蛋蛋白系统统，该系系统由硫硫氧还蛋蛋白还原原酶和硫硫氧还蛋蛋白组成成；谷氧氧还蛋白白系统，该该系统由由谷胱甘甘肽还原原酶、谷谷胱甘肽肽和三种种谷氧还还蛋白组组成1143。制造造次还原原细胞质质环境，以以利于二二硫键形形成的策策略包括括选用硫硫氧还蛋蛋白还原原酶（ttrxBB）缺陷陷的E.colli菌株株,这有助助于巯基基还原
42、势势能。蛋白质在细细胞质中中被降解解的可能能性比其其他细胞胞室要大大得多。因因为在细细胞质中中含有大大量的蛋蛋白酶。另另外，从从细胞质质蛋白混混合物中中纯化目目的蛋白白相对比比较困难难，因为为在此细细胞室包包含总细细胞蛋白白的绝大大部分蛋蛋白1144。2细胞外外周质表表达在细胞外周周质进行行蛋白质质表达有有许多优优越之处处。在外外周质只只有4%的总细细胞蛋白白，这显显然有利利于目的的蛋白的的纯化，外外周质的的氧化环环境有利利于蛋白白质的正正确折叠叠，在转转移到外外周质的的过程中中，信号号肽在细细胞内剪剪切更有有可能产产生目的的蛋白的的天然NN-末端端。此外外，外周周质中的的蛋白质质降解也也少得
43、多多1445。蛋蛋白质通通过内膜膜转运到到外周质质需要信信号肽1466，1447，1148。许多多原核和和真核细细胞来源源的信号号肽已成成功地用用于Eccolii中蛋白白质从内内膜到外外周质的的转运。如如E.ccolii的PhooA信号号1449、OmppA1150、OmppT1151、LammB和OmppF1152以及金金黄色葡葡萄球菌菌的A蛋蛋白1153，鼠RNNasee1554和和人生长长激素信信号肽1555等。但但是，蛋蛋白质转转运到细细菌外周周质是一一个特别别复杂和和尚未完完全明了了的过程程，信号号肽的存存在并不不总能保保证有效效的蛋白白质通过过内膜转转运1156。改善善蛋白质质转运
44、到到外周质质的策略略包括提提供蛋白白质转运运和加工工所需的的成分：过量表表达信号号肽酶II1557，利利用prrlF突突变株1588，共共表达参参与膜转转运的几几种蛋白白质，降降低蛋白白质的表表达水平平以防止止转运工工具的过过载1159。3 细胞外分泌泌（外泌泌） 将蛋白质质分泌到到细胞外外是人们们最期望望的一种种策略。因因为这样样容易纯纯化目的的蛋白质质，减少少细菌的的蛋白酶酶对目的的蛋白质质的裂解解。但是是，E.colli在正正常情况况下只有有很少量量的蛋白白质分泌泌到细胞胞外。要要解决蛋蛋白质外外泌方面面的难题题，必须须弄清EE.cooli的的分泌途途径。PPugssleyy1660对对
45、革兰氏氏阴性菌菌的分泌泌途径进进行了详详细的研研究。在在E.ccolii中将蛋蛋白质分分泌到培培养基中中的方法法大致分分为两类类：（11）利用用已有的的“真正”的分泌泌蛋白所所采用的的途径1611；（22）利用用信号肽肽序列、融融合伴侣侣和具有有穿透能能力的因因子。第第一种方方法具有有将目的的蛋白质质特异性性分泌的的优点，并并最小限限度地减减少了非非目的蛋蛋白的污污染。最最突出的的例子是是溶血素素基因，该该基因曾曾被用于于构建分分泌的杂杂交蛋白白1662，1163；第二二种方法法依赖于于有限渗渗透的诱诱导而导导致蛋白白质的分分泌。例例如应用用pellB1164、ompAA1655和AA蛋白引引导序列列1553，1166；与细细菌素释释放蛋白白的共表表达1167；丝裂裂霉素诱诱导的细细菌素释释放蛋白白和在培培养基中中添加甘甘氨酸1688以及及与kiil基因因共表达达而进行行膜穿透透1669。但但通常情情况下，外外泌蛋白白质的产产量是中中等的。有有文献报报道1170，在大大肠杆菌菌表达系系统中，金金黄色葡葡萄球菌菌A蛋白白的信号号肽能引引导带有有E结构构域的AA蛋