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1、时间分辨荧光免疫分析法乙型肝炎血清标志物分析灵敏度的建立与分析Establishment and analysis of analytic sensitivity of hepatitis B virus serum markers by Time-resolved Fluoroimmunoassay谭玉华 陈鲜美美 卢卢顺舵 沈 健（广州市丰丰华生物物工程有有限公司司，广东东广州 55107730）摘 要 对乙型型肝炎表表面抗原原和表面面抗体定定量测定定试剂盒盒（时间间分辨荧荧光免疫疫分析法法）的分分析灵敏敏度进行行建立与与分析，以以便更好好的指导导临床诊诊断和进进行流行行病学研研究。通通过
2、实验验研究，乙乙型肝炎炎病毒表表面抗原原定量检检测试剂剂盒和表表面抗体体定量检检测试剂剂盒的检检测低限限分别为为0.003566ng/mL和和0.5548 mIUU/mLL，生物物检测限限分别为为0.2200 ng/mL和和5.000 mmIU/mL，功功能灵敏敏度分别别为0.2000 ngg/mLL和5.000 mmIU/mL，线线性范围围分别为为0.2200 ng/mL-3000 ngg/mLL和5.00 mIUU/mLL-12200 mIUU/mLL，并达达到中国国药品生生物制品品检定所所检定要要求。时时间分辨辨荧光免免疫分析析法乙型型肝炎病病毒定量量检测试试剂盒具具有灵敏敏度高，线线性
3、范围围宽，特特异性强强的特点点，已能能有效应应用于临临床体外外诊断和和流行病病学研究究。关键词 时时间分辨辨荧光免免疫分析析；乙型型肝炎；标志物物；分析析灵敏Estabblisshmeent andd annalyysiss off annalyyticc seensiitivvityy off heepattitiis BB viiruss seerumm maarkeers by Timme-rresoolveed FFluooroiimmuunoaassaayTAN YYu-hhua,CHEEN XXiann-meei,LLU SShunn-duuo,eet aal. Guaangzzh
4、ouu Feenghhua Bioo-ennginneerringg Coo.,LLTD,Guaangzzhouu 51107330 CChinnaAbstrracttTo esttabllishh annd aanallysee thhe aanallytiic ssenssitiivitty ffor thee quuanttifiicattionn kiits forr heepattitiis BB viiruss(HBBV) surrfacce aantiigenn(HBBsAgg) aand anttiboody to HBssAg (annti-HBss),tthe kitts
5、wweree meeasuuredd byy Tiime-ressolvved Fluuorooimmmunooasssay(TRFFIA),inn orrderr too thhe bbettter insstruuctiion cliiniccal diaagnoosiss annd ccondductts tthe epiidemmiollogyy reeseaarchh. TThrooughh thhe sstuddy,tthe lowwer limmit of dettecttionn off thhe qquanntifficaatioon kkitss foor HHBsAAg
6、aand antti-HHBs forr 0.03556ngg/mLL annd 00.5448 mmIU/mL resspecctivvelyy, tthe bioologgicaal llimiit oof ddeteectiion is 0.2200 ng/mL andd 5.00 mIUU/mLL reespeectiivelly, thee fuuncttionn seensiitivvityy iss 0.2000 ngg/mLL annd 55.000 mIIU/mmL rresppecttiveely, thhe llineear scoope is 0.2200 ng/mL-
7、300 ng/mL andd 5.00 mIUU/mLL-12200 mIUU/mLL reespeectiivelly, andd paasseed tthe exaaminnatiion of thee Naatioonall Innstiitutte ffor Conntrool oof PPharrmacceutticaal aand Bioologgicaal PProdductts. Thee quuanttifiicattionn kiits forr HBBV sseruum mmarkkerss byy TRRFIAA ,wwhicch hhas thee hiigh sen
8、nsittiviity, thhe wwidee liineaar sscoppe,tthe goood sspeccifiicitty,ccoulld hhavee thhe eeffeect to usee inn thhe cclinnicaal iin vvitrro ddiaggnossis andd thhe eepiddemiioloogy ressearrch.Key wwordds TTimee-reesollvedd Flluorroimmmunnoasssayy; HHepaatittis B vviruus;MMarkker;Anaalyttic sennsittivi
9、ity乙型肝炎病病毒表面面抗原（HHBsAAg）的的检出是是乙型肝肝炎病毒毒（HBBV）感感染的金金标准。乙乙型肝炎炎病毒表表面抗体体（抗-HBss）是对对HBVV具有保保护性的的免疫指指标，它它的检出出有助于于乙型肝肝炎（简简称：乙乙肝）的的预防与与接种。随随着时间间分辨荧荧光免疫疫分析法法（TRRFIAA）在定定量检测测HBssAg和和抗-HHBs中的应应用，对对HBssAg和和抗-HHBs的分析析灵敏度度有了进进一步提提高，并并且定量量结果取取代了定定性报告告，为临临床诊断断提供了了更多的的信息。在在实验室室，对试试剂盒和和方法学学有必要要建立自自己的可可定量报报告的生生物检测测限或对对
10、试剂盒盒和方法法学说明明的检测测限进行行确认1-22，以以便更好好的指导导临床的的诊断。作作者在此此对乙型型肝炎HHBsAAg和抗抗-HBBs定量测测定试剂剂盒（时时间分辨辨荧光免免疫分析析法）的的分析灵灵敏度进进行了建建立与分分析。1 材料料与方法法1.1 材料与与仪器 高浓浓度HBBsAgg和抗-HBss血清各各5.000mLL，乙型型肝炎病病毒表面面抗原定定量检测测试剂盒盒（国药药准字SS2000501108）和和表面抗抗体定量量测定试试剂盒（国国药准字字S20005001100）（时时间分辨辨荧光免免疫分析析法），以以及DEEM-IIII自自动酶标标洗板机机和FWWZ-II振荡仪仪均由
11、广广州市丰丰华生物物工程有有限公司司提供。“检测HBsAg血清Panel国家参考品”（批准文号：91卫生参字0003）和“检测抗-HBs血清Panel国家参考品”（批准文号：91卫生参字0004）购于中国药品生物制品检定所。VICTOR2TMD 1420 MULTILABEL COUNTER（时间分辨荧光免疫检测仪）为Wallac产品。1.2 方法 采用用试剂盒盒0标准准品为空空白液（BBLANNK），将将高浓度度HBssAg和和抗-HHBs血清加加入空白白液做系系列稀释释，组成成0.0000ng/mL、00.2000 nng/mmL、00.5000 nng/mmL、11.000ng/mL、2
12、2.000ng/mL和和5.000 nng/mmL的HHBsAAg系列列检测限限品，以以及0.0000mIUU/mLL、5.000mIIU/mmL、110.00mIUU/mLL、200.0mmIU/mL、330.00 mIIU/mmL和440.00 mIIU/mmL的抗抗-HBBs系列检检测限品品。并将将高浓度度HBssAg和和抗-HHBs血清分分别用空空白液按按一定比比例稀释释，各配配得线性性检测品品。各用用三批试试剂测定定“检测HHBsAAg血清清Pannel国国家参考考品”和“检测抗抗-HBBs血清PPaneel国家家参考品品”，同时时做标准准曲线。HHBsAAg采用用双抗体体夹心法法，
13、抗-HBss采用双双抗原夹夹心法，均均按试剂剂盒说明明书严格格操作。空空白样品品做20次批批内重复复测定；对其它它系列检检测限品品做天间间重复测测定，共共连续做做20天天。实验验均在VVICTTOR22TMD 14220 MMULTTILAABELL COOUNTTER上上测定荧荧光值（RRF值）。收收集数据据，按文文献33的方方法分析析TRFFIA 法HBBsAgg和抗-HBss定量检检测试剂剂盒的检检测低限限（LLLD）、生生物检测测限（BBLD）、及及功能灵灵敏度（FFS），参参考文献献4及血清清Pannel国国家参考考品说明明书对试试剂盒进进行检定定。2 结果果2.1 分析灵灵敏度 空
14、白白样品做做20次批批内重复复测定，其其它系列列检测限限品做天天间重复复测定，共共连续做做20天天。其系系列检测测限品的的RF值值检测结结果详见见表1。表1 乙型型肝炎表表面抗原原和表面面抗体系系列检测测限品的的荧光值值检测结结果HBsAgg（ng/mL） 0.00000.2200 0.5500 1.00 22.000 5.000 抗抗-HBBs（mIUU/mLL） 00.0000 5.00 110.00 20.0 330.00 400.0 荧光值 16633 333488 56631 1100112 172291 4110644 116800 55556 84431 1156887 2111
15、488 308837 15533 334133 55513 1104667 175581 3997577 114322 45573 75575 1148997 2114755 347700 15531 335288 61122 96776 170033 3880155 115133 55524 98817 1199004 2880488 400068 14491 335644 56682 98663 173343 3881655 115488 69951 87710 1193552 2888422 376691 13341 332444 55593 1100889 178872 4334633
16、 11387766880 89776 1997655 299942 3394338 13323 333422 53366 1120111 190000 4227577 11507763664 93998 2111000 301173 3374880 13368 333900 52216 97888 156650 3449888 11491148228 82003 1448844 213327 3303772 14429 333444 56650 1100331 136658 3225433 11438848339 70778 2113277 215511 3317668 15568 33269
17、9 52294 92229 171106 3778544 11453359882 94773 2118188 302211 3388442 16694 332177 57719 94995 158873 3558988 11537763997 90996 2007555 294400 3352115 14486 337422 61111 1128882 180023 4116833 11565546991 79446 2006400 304406 4403663 13360 337399 74493 1104442 188826 4009266 11654453336 79119 200793
18、3 304447 4402990 14464 339233 63356 1122442 188878 4334899 11744448777 72555 1553155 250061 3352887 13379 445077 65574 1105661 186640 4111511 11271143448 72996 1338744 265548 3302882 12281 334622 67732 1109551 190045 4885300 11275551338 69880 1770955 246667 3346889 17768 336500 62244 1121222 193336
19、4882066 11227755222 65001 1775200 243377 3347556 14423 333844 55548 1115114 210054 4993622 11254458001 1107553 2009277 328882 3388114 13377 446544 51157 1122110 208808 4771277 113399 58894 90022 2201992 3224744 406697 14499 335811 51115 1133229 220010 4663888 112911 52245 90003 1177775 2665899 38991
20、7 14418 336733 61133 1125887 231149 4002699 114333 52211 96622 1190776 2992277 4099902.1.11检测低低限HBBsAgg空白平平均值BBLANNK均值值）为 14668.330，标标准偏差差（SDD）为1126.56，抗抗-HBBs空白平平均值为为14551.995 ，标标准偏差差（SDD）为1147.49。这这里采用用99.7%的的可能性性来计算算检测低低限。按按文献1的的方法分分析：LLDDHBsAAg= BLLANKK均值+33S0 = 14668.330+331226.556=18447.998；LL
21、LD抗抗-HBBs=18994.442。HHBsAAg若以以空白RRF值均均值为检检测的起起点0,那么有有99.7%的的可能性性,每次次只做一一个空白白时,出出现最高高的空白白RF值值较该空空白RFF值均值值高1226.556的33倍,即即3799.688，这些些RF值值相当于于样品具具有的HHBsAAg，即为本本方法HBsAAg的检检测低限限。同理理得，较较该空白白RF值值均值高高4422.477这些RFF值即为为本方法抗-HBBs的检测测低限。将将上面所所有的RRF值减减去空白白RF值值均值，然然后求每每组的均均值和标标准差。见见表2。表2 乙型型肝炎表表面抗原原和表面面抗体检检测系统统分
22、析灵灵敏度的的计算HBsAgg（ng/mL） 0.2000 0.5000 11.000 22.000 5.000 抗抗-HBBs（mIUU/mLL） 5.00 100.0 220.00 30.0 40.0 X 221300.400 443944.155 995066.755 1669400.555 4401113.445 40035.90 69969.25 1771822.855 2258112.880 3351222.885SD 3844.944 6077.066 112666.499 222233.799 46883.779 7723.74 10088.42 225411.000 3822
23、6.113 36332.770CV（%） 188.077 133.822 133.322 13.13 111.668 17.93 15.62 144.799 114.882 110.334X-3SSD 9975.58 25572.97 57707.28 102269.17 2660622.099 18664.666 37004.000 995599.866 114344.411 2242224.775 3799.688 3779.668 3799.688 3799.688 3379.68 4442.47 4422.477 4442.447 4442.447 4442.47 现在0.2200 n
24、g/mLHHBsAAg组减减去空白白后的RRF值均均值为221300.400，假定定这段范范围内HHBsAAg量和和RF值值间呈线线性.因因此3779.668相当当于：00.2000（3779.668/221300.400）=00.03356（ng/mL）。所以本法HBsAg的检测低限为0.0356ng/mL。同理可得：本法抗-HBs的检测低限为0.548 mIU/mL。2.1.22生物检检测限由由表2得得, 0.2000 ngg/mLLHBsAAg组999.77%的最低RFF值为（221300.400 -333884.994），即975.58，已大于空白RF值均值可能有的最高值379.68，
25、说明0.200 ng/mL的样品RF值有99.7%的可能性,一定大于空白的RF值，能定量地报告结果。0.200 ng/mL为本方法HBsAg的生物检测限。同理可得，本方法抗-HBs的生物检测限为5.00 mIU/mL。2.1.33功能灵灵敏度 从从表2中可知知，0.2200 ng/mLHHBsAAg组和5.00 mIUU/mLL抗-HHBs组的重重复检测测变异系系数CVV%分别别为18.07%和177.933%，重复检检测变异异系数接接近并小小于200%55。所以，本方法HBsAAg和抗-HHBs的功能能灵敏度度为0.2000 ngg/mLL和5.000 mmIU/mL。2.2 线性范范围 H
26、BssAg和和抗-HHBs的血清清线性检检测品，经经三批试试剂检测测，HBBsAgg线性范范围为00.2000 nng/mmL-3300 ng/mL，抗抗-HBBs线性范范围为55.000 mIIU/mmL-112000 mIIU/mmL。2.3 血清PPaneel国家家参考品品检定 三批批HBssAg和和抗-HHBs定量检检测试剂剂盒分别别测定“检测HHBsAAg血清清Pannel国国家参考考品”和“检测抗抗-HBBs血清PPaneel国家家参考品品”：线性性参考品品测定值值均与标标定值相相关系数数 r 988.0%，测定定值与其其真实值值的相对对误差不不大于115.00%；精精密性参参考品
27、CCV%10.0%；HBssAgaadr亚亚型及抗抗-HBBs灵敏度度参考品品的测定定值与其其真实值值的相对对误差不不大于110.00%，HHBsAAgaddr、adww和ay亚型型参考品品最低检检出量不不高于00.2000ngg/mLL；抗-HBss灵敏度度参考品品最低检检出量不不高于55.000 mIIU/mmL。3 讨论分析灵敏度度（检测测限）是是检测系系统能检检出的最最低分析析物浓度度，包括括具有定定性意义义的检测测低限（LLLD）和和具有定定量意义义的生物物检测限限（BLLD）及及功能灵灵敏度（FFS），特特别是定定量检测测报告能能为临床床对患者者的治疗疗监测和和随访的的正确判判断提
28、供供更多的的信息。因因此，在在检测系系统正式式用于实实际检测测病人标标本之前前，实验验室必须须对检测测系统的的分析灵灵敏度进进行建立立或确认认。确定定检测系系统的可可报告低低限是最最重要的的分析性性能。通过本次实实验研究究，乙型型肝炎病病毒表面面抗原定定量检测测试剂盒盒和表面面抗体定定量检测测试剂盒盒（时间间分辨免免疫荧光光分析法法）的LLLD分分别为00.03356nng/mmL和0.5548 mIUU/mLL，BLLD分别别为0.2000 ngg/mLL和5.000 mmIU/mL，FFS分别别为0.2000 ngg/mLL和5.000 mmIU/mL，线线性范围围分别为为0.2200 n
29、g/mL-3000 ngg/mLL和5.00 mIUU/mLL-12200 mIUU/mLL，并均均达到中中国药品品生物制制品检定定所检定定要求。HBV标志志物的检检测常用用于病人人的筛选选和乙型型肝炎的的预防，对对低浓度度的血清清HBssAg及及其亚型型的有效效检测，具具有重要要的临床床和流行行病学意意义；并并且临床床实验室室一般认认为抗-HBss含量110.00 mIIU/mmL为保保护临界界值，但但是抗-HBss含量在在10.0 mmIU/mL-1000 mIIU/mmL时认认为没有有对HBBV中和和作用，只只有定量量在1000 mmIU/mL以以上时才才具有抵抵抗HBBV入侵侵的作用用
30、6，抗-HBss定量检检测对乙乙肝免疫疫力的评评价具有有重要意意义。本本实验也也表明，TTRFIIA法乙乙型肝炎炎病毒定定量检测测试剂盒盒具有灵灵敏度高高，线性性范围宽宽，特异异性强的的特点，已已能有效效应用于于临床体体外诊断断和流行行病学研研究。参考文献：1 周周愍，佟佟素香，李李一荣.几种肿肿瘤标志志物分析析灵敏度度的分析析与确认认J.实用用医学杂杂志.220055，122（211）：113377-13339。2 孙孙云，韩韩凤霞，朱朱萍，等等.5种种肿瘤标标志物分分析灵敏敏度的建建立JJ.上上海医学学检验杂杂志.220033，188（6）：3374-3766.3 冯冯仁丰.分析灵灵敏度（
31、检检测限）J. 上海海医学检检验杂志志.20002，117（33）：1133-1366.4 吴吴绍沅，苏苏涛，林林京香，等等.乙型型肝炎诊诊断试剂剂国家质质控标准准的建立立J.病毒毒学报.19991，77（增刊刊）：1100-1066.5 王王志刚，曹曹浩强，沈沈瑞林. 分析析灵敏度度与功能能灵敏度度的临床床意义区区别JJ.检检验医学学.20005，220（22）：1164.6 HHeijjtinnk RRA,SSchnneebbergger PM,Posstmaa B,et al.Antti2HHBs levvelss affer Hepptittis B iimmuunissatiion deppendd onn reeageentss:rooutiinelly ddeteermiinedd 100 annd 1100 IU/L sserooprootecctioon lleveels unrreliiablle J.Vacccinne,220022,200:28899-29005.