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1、时间分辨荧光免疫分析法乙型肝炎血清标志物分析灵敏度的建立与分析Establishment and analysis of analytic sensitivity of hepatitis B virus serum markers by Time-resolved Fluoroimmunoassay谭玉华 陈鲜美 卢顺舵 沈 健（广州市丰华生物工程有限公司，广东 广州 510730）摘 要 对乙型肝炎表面抗原和表面抗体定量测定试剂盒（时间分辨荧光免疫分析法）的分析灵敏度进行建立与分析，以便更好的指导临床诊断和进行流行病学研究。通过实验研究，乙型肝炎病毒表面抗原定量检测试剂盒和表面抗体定量检测
2、试剂盒的检测低限分别为0.0356ng/mL和0.548 mIU/mL，生物检测限分别为0.200 ng/mL和5.00 mIU/mL，功能灵敏度分别为0.200 ng/mL和5.00 mIU/mL，线性范围分别为0.200 ng/mL-300 ng/mL和5.00 mIU/mL-1200 mIU/mL，并达到中国药品生物制品检定所检定要求。时间分辨荧光免疫分析法乙型肝炎病毒定量检测试剂盒具有灵敏度高，线性范围宽，特异性强的特点，已能有效应用于临床体外诊断和流行病学研究。关键词 时间分辨荧光免疫分析；乙型肝炎；标志物；分析灵敏Establishment and analysis of anal
3、ytic sensitivity of hepatitis B virus serum markers by Time-resolved FluoroimmunoassayTAN Yu-hua,CHEN Xian-mei,LU Shun-duo,et al. Guangzhou Fenghua Bio-engineering Co.,LTD,Guangzhou 510730 ChinaAbstract To establish and analyse the analytic sensitivity for the quantification kits for hepatitis B vir
4、us(HBV) surface antigen(HBsAg) and antibody to HBsAg (anti-HBs),the kits were measured by Time-resolved Fluoroimmunoassay(TRFIA),in order to the better instruction clinical diagnosis and conducts the epidemiology research. Through the study,the lower limit of detection of the quantification kits for
5、 HBsAg and anti-HBs for 0.0356ng/mL and 0.548 mIU/mL respectively, the biological limit of detection is 0.200 ng/mL and 5.00 mIU/mL respectively, the function sensitivity is 0.200 ng/mL and 5.00 mIU/mL respectively, the linear scope is 0.200 ng/mL-300 ng/mL and 5.00 mIU/mL-1200 mIU/mL respectively,
6、and passed the examination of the National Institute for Control of Pharmaceutical and Biological Products. The quantification kits for HBV serum markers by TRFIA ,which has the high sensitivity, the wide linear scope,the good specificity,could have the effect to use in the clinical in vitro diagnos
7、is and the epidemiology research.Key words Time-resolved Fluoroimmunoassay; Hepatitis B virus;Marker;Analytic sensitivity乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的检出是乙型肝炎病毒（HBV）感染的金标准。乙型肝炎病毒表面抗体（抗-HBs）是对HBV具有保护性的免疫指标，它的检出有助于乙型肝炎（简称：乙肝）的预防与接种。随着时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）在定量检测HBsAg和抗-HBs中的应用，对HBsAg和抗-HBs的分析灵敏度有了进一步提高，并且定量结果取代了定性报告，为
8、临床诊断提供了更多的信息。在实验室，对试剂盒和方法学有必要建立自己的可定量报告的生物检测限或对试剂盒和方法学说明的检测限进行确认1-2，以便更好的指导临床的诊断。作者在此对乙型肝炎HBsAg和抗-HBs定量测定试剂盒（时间分辨荧光免疫分析法）的分析灵敏度进行了建立与分析。1 材料与方法1.1 材料与仪器 高浓度HBsAg和抗-HBs血清各5.00mL，乙型肝炎病毒表面抗原定量检测试剂盒（国药准字S20050108）和表面抗体定量测定试剂盒（国药准字S20050110）（时间分辨荧光免疫分析法），以及DEM-III自动酶标洗板机和FWZ-I振荡仪均由广州市丰华生物工程有限公司提供。“检测HBsA
9、g血清Panel国家参考品”（批准文号：91卫生参字0003）和“检测抗-HBs血清Panel国家参考品”（批准文号：91卫生参字0004）购于中国药品生物制品检定所。VICTOR2TMD 1420 MULTILABEL COUNTER（时间分辨荧光免疫检测仪）为Wallac产品。1.2 方法 采用试剂盒0标准品为空白液（BLANK），将高浓度HBsAg和抗-HBs血清加入空白液做系列稀释，组成0.000ng/mL、0.200 ng/mL、0.500 ng/mL、1.00ng/mL、2.00ng/mL和5.00 ng/mL的HBsAg系列检测限品，以及0.000mIU/mL、5.00mIU/m
10、L、10.0mIU/mL、20.0mIU/mL、30.0 mIU/mL和40.0 mIU/mL的抗-HBs系列检测限品。并将高浓度HBsAg和抗-HBs血清分别用空白液按一定比例稀释，各配得线性检测品。各用三批试剂测定“检测HBsAg血清Panel国家参考品”和“检测抗-HBs血清Panel国家参考品”，同时做标准曲线。HBsAg采用双抗体夹心法，抗-HBs采用双抗原夹心法，均按试剂盒说明书严格操作。空白样品做20次批内重复测定；对其它系列检测限品做天间重复测定，共连续做20天。实验均在VICTOR2TMD 1420 MULTILABEL COUNTER上测定荧光值（RF值）。收集数据，按文献
11、3的方法分析TRFIA 法HBsAg和抗-HBs定量检测试剂盒的检测低限（LLD）、生物检测限（BLD）、及功能灵敏度（FS），参考文献4及血清Panel国家参考品说明书对试剂盒进行检定。2 结果2.1 分析灵敏度 空白样品做20次批内重复测定，其它系列检测限品做天间重复测定，共连续做20天。其系列检测限品的RF值检测结果详见表1。表1 乙型肝炎表面抗原和表面抗体系列检测限品的荧光值检测结果HBsAg（ng/mL） 0.000 0.200 0.500 1.00 2.00 5.00 抗-HBs（mIU/mL） 0.000 5.00 10.0 20.0 30.0 40.0 荧光值 1633 334
12、8 5631 10012 17291 41064 1680 5556 8431 15687 21148 30837 1533 3413 5513 10467 17581 39757 1432 4573 7575 14897 21475 34700 1531 3528 6122 9676 17033 38015 1513 5524 9817 19904 28048 40068 1491 3564 5682 9863 17343 38165 1548 6951 8710 19352 28842 37691 1341 3244 5593 10089 17872 43463 1387 6680 897
13、6 19765 29942 39438 1323 3342 5366 12011 19000 42757 1507 6364 9398 21100 30173 37480 1368 3390 5216 9788 15650 34988 1491 4828 8203 14884 21327 30372 1429 3344 5650 10031 13658 32543 1438 4839 7078 21327 21511 31768 1568 3269 5294 9229 17106 37854 1453 5982 9473 21818 30211 38842 1694 3217 5719 949
14、5 15873 35898 1537 6397 9096 20755 29400 35215 1486 3742 6111 12882 18023 41683 1565 4691 7946 20640 30406 40363 1360 3739 7493 10442 18826 40926 1654 5336 7919 20793 30447 40290 1464 3923 6356 12242 18878 43489 1744 4877 7255 15315 25061 35287 1379 4507 6574 10561 18640 41151 1271 4348 7296 13874 2
15、6548 30282 1281 3462 6732 10951 19045 48530 1275 5138 6980 17095 24667 34689 1768 3650 6244 12122 19336 48206 1227 5522 6501 17520 24377 34756 1423 3384 5548 11514 21054 49362 1254 5801 10753 20927 32882 38814 1377 4654 5157 12210 20808 47127 1339 5894 9022 20192 32474 40697 1499 3581 5115 13329 220
16、10 46388 1291 5245 9003 17775 26589 38917 1418 3673 6133 12587 23149 40269 1433 5211 9622 19076 29227 40990 检测低限 HBsAg空白平均值BLANK 均值）为 1468.30，标准偏差（SD）为126.56，抗-HBs空白平均值为1451.95 ，标准偏差（SD）为147.49 。这里采用99.7%的可能性来计算检测低限。按文献1的方法分析：LLDHBsAg= BLANK 均值+3S0 = 1468.30+3126.56=1847.98；LLD抗-HBs=1894.42。HBsAg若以空
17、白RF值均值为检测的起点0,那么有99.7%的可能性,每次只做一个空白时,出现最高的空白RF值较该空白RF值均值高126.56的3倍,即379.68，这些RF值相当于样品具有的HBsAg，即为本方法HBsAg的检测低限。同理得，较该空白RF值均值高442.47这些RF值即为本方法抗-HBs的检测低限。将上面所有的RF值减去空白RF值均值，然后求每组的均值和标准差。见表2。表2 乙型肝炎表面抗原和表面抗体检测系统分析灵敏度的计算HBsAg（ng/mL） 0.200 0.500 1.00 2.00 5.00 抗-HBs（mIU/mL） 5.00 10.0 20.0 30.0 40.0 X 2130
18、.40 4394.15 9506.75 16940.55 40113.45 4035.90 6969.25 17182.85 25812.80 35122.85SD 384.94 607.06 1266.49 2223.79 4683.79 723.74 1088.42 2541.00 3826.13 3632.70CV（%） 18.07 13.82 13.32 13.13 11.68 17.93 15.62 14.79 14.82 10.34X-3SD 975.58 2572.97 5707.28 10269.17 26062.09 1864.66 3704.00 9559.86 1434.
19、41 24224.75 379.68 379.68 379.68 379.68 379.68 442.47 442.47 442.47 442.47 442.47 现在0.200 ng/mLHBsAg组减去空白后的RF值均值为2130.40，假定这段范围内HBsAg量和RF值间呈线性.因此379.68相当于：0.200（379.68/2130.40）=0.0356（ng/mL）。所以本法HBsAg的检测低限为0.0356ng/mL。同理可得：本法抗-HBs的检测低限为0.548 mIU/mL。 生物检测限 由表2得, 0.200 ng/mLHBsAg组99.7%的最低RF值为（2130.40
20、-3384.94），即975.58，已大于空白RF值均值可能有的最高值379.68，说明0.200 ng/mL的样品RF值有99.7%的可能性,一定大于空白的RF值，能定量地报告结果。0.200 ng/mL为本方法HBsAg的生物检测限。同理可得，本方法抗-HBs的生物检测限为5.00 mIU/mL。 功能灵敏度 从表2中可知，0.200 ng/mLHBsAg组和5.00 mIU/mL抗-HBs组的重复检测变异系数CV%分别为18.07%和17.93%，重复检测变异系数接近并小于20%5。所以，本方法HBsAg和抗-HBs的功能灵敏度为0.200 ng/mL和5.00 mIU/mL。2.2 线
21、性范围 HBsAg和抗-HBs的血清线性检测品，经三批试剂检测，HBsAg线性范围为0.200 ng/mL-300 ng/mL，抗-HBs线性范围为5.00 mIU/mL-1200 mIU/mL。2.3 血清Panel国家参考品检定 三批HBsAg和抗-HBs定量检测试剂盒分别测定“检测HBsAg血清Panel国家参考品”和“检测抗-HBs血清Panel国家参考品”：线性参考品测定值均与标定值相关系数 r 98.0%，测定值与其真实值的相对误差不大于15.0%；精密性参考品CV%10.0%；HBsAg adr亚型及抗-HBs灵敏度参考品的测定值与其真实值的相对误差不大于10.0%，HBsAg
22、adr、adw和ay亚型参考品最低检出量不高于0.200ng/mL；抗-HBs灵敏度参考品最低检出量不高于5.00 mIU/mL。3 讨论 分析灵敏度（检测限）是检测系统能检出的最低分析物浓度，包括具有定性意义的检测低限（LLD）和具有定量意义的生物检测限（BLD）及功能灵敏度（FS），特别是定量检测报告能为临床对患者的治疗监测和随访的正确判断提供更多的信息。因此，在检测系统正式用于实际检测病人标本之前，实验室必须对检测系统的分析灵敏度进行建立或确认。确定检测系统的可报告低限是最重要的分析性能。通过本次实验研究，乙型肝炎病毒表面抗原定量检测试剂盒和表面抗体定量检测试剂盒（时间分辨免疫荧光分析法
23、）的LLD分别为0.0356ng/mL和0.548 mIU/mL，BLD分别为0.200 ng/mL和5.00 mIU/mL，FS分别为0.200 ng/mL和5.00 mIU/mL，线性范围分别为0.200 ng/mL-300 ng/mL和5.00 mIU/mL-1200 mIU/mL，并均达到中国药品生物制品检定所检定要求。HBV标志物的检测常用于病人的筛选和乙型肝炎的预防，对低浓度的血清HBsAg及其亚型的有效检测，具有重要的临床和流行病学意义；并且临床实验室一般认为抗-HBs含量10.0 mIU/mL为保护临界值，但是抗-HBs含量在10.0 mIU/mL-100 mIU/mL时认为没
24、有对HBV中和作用，只有定量在100 mIU/mL以上时才具有抵抗HBV入侵的作用6，抗-HBs定量检测对乙肝免疫力的评价具有重要意义。本实验也表明，TRFIA法乙型肝炎病毒定量检测试剂盒具有灵敏度高，线性范围宽，特异性强的特点，已能有效应用于临床体外诊断和流行病学研究。参考文献：1 周愍，佟素香，李一荣.几种肿瘤标志物分析灵敏度的分析与确认J.实用医学杂志.2005，12（21）：1337-1339。2 孙云，韩凤霞，朱萍，等.5种肿瘤标志物分析灵敏度的建立J.上海医学检验杂志.2003，18（6）：374-376.3 冯仁丰.分析灵敏度（检测限）J. 上海医学检验杂志.2002，17（3）
25、：133-136.4 吴绍沅，苏涛，林京香，等.乙型肝炎诊断试剂国家质控标准的建立J.病毒学报.1991，7（增刊）：100-106.5 王志刚，曹浩强，沈瑞林. 分析灵敏度与功能灵敏度的临床意义区别J.检验医学.2005，20（2）：164.6 Heijtink RA,Schneeberger PM,Postma B,et al.Anti2HBs levels afer Heptitis B immunisation depend on reagents:routinely determined 10 and 100 IU/L seroprotection levels unreliable J.Vaccine,2002,20:2899-2905.内容总结（1）HBsAg若以空白RF值均值为检测的起点0,那么有99.7%的可能性,每次只做一个空白时,出现最高的空白RF值较该空白RF值均值高126.56的3倍,即379.68，这些RF值相当于样品具有的HBsAg，即为本方法HBsAg的检测低限