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1、微 生 物 实实 验 教 案案第一部分分 基础础性实验验实验一 显微镜镜油镜的的使用和和细菌形形态的观观察一、实验验目的以染色玻玻片及活活菌为例例，熟练练掌握显显微镜油油镜的使使用方法法。二、显微微镜油镜镜使用的的原理1普通光光学显微微镜的基基本构造造（1）光光学部分分:接目镜镜、接物物镜、照照明装置置(聚光镜镜、虹彩彩光圈、反反光镜等等)。它使检检视物放放大, 造成成物象。（2）机机械部分分:镜座、镜镜臂、镜镜筒、物物镜转换换器、载载物台、载载物台转转移器、粗粗调节器器、细调调节器等等部件。它它起着支支持、调调节、固固定等作作用。2显微镜镜的放大大倍数和和分辨率率（1）放放大倍数数=接物镜镜
2、放大倍倍数接目镜镜放大倍倍数（2）显显微镜的的分辨率率：表示显显微镜辨辨析物体体（两端端）两点点之间距距离的能能力，可可用公式式表示为为：D=/2nsinn(/2 ) 式中D：物镜分分辨出物物体两点点间的最最短距离离。：可见见光的波波长（平平均0.55m）n: 物物镜和被被检标本本间介质质的折射射率。a：镜口口角（即即入射角角）。3油镜使使用的原原理油镜，即即油浸接接物镜。当当光线由由反光镜镜通过玻玻片与镜镜头之间间的空气气时，由由于空气气与玻片片的密度度不同，使使光线受受到曲折折，发生生散射，降降低了视视野的照照明度。若若中间的的介质是是一层油油（其折折射率与与玻片的的相近），则则几乎不不发
3、生折折射，增增加了视视野的进进光量，从从而使物物象更加加清晰。三、实验验材料1显微镜镜、香柏柏油、二二甲苯、擦擦镜纸、吸吸水纸、盖盖玻片、接接种环、酒酒精灯等等。2细菌三三种形态态的玻片片染色标标本。3培养112-118h的的枯草芽芽孢杆菌菌。四、实验验方法与与步骤1染色细细菌玻片片的油镜镜观查（1）用用前检查查：零件件是否齐齐全，镜镜头是否否清洁。（2）调调节光亮亮度。（3）低低倍镜观观察：先先粗调再再微调至至物象清清晰。（4）转转入中倍倍、高倍倍观察，每每一不只只需调微微调旋纽纽即可看看到清晰晰的物象象。（5）油油镜观察察：高倍倍镜下找找到清晰晰的物象象后，旋旋转转换换器，在在标本中中央滴
4、一一滴香柏柏油，使使油镜镜镜头浸入入香柏油油中，细细调至看看清物象象为止。（6）绘绘出所观观察到的的细菌形形态图像像。（7）、换片片：另换换新片观观察，必必须从（33）步开开始操作作。（8）、用后后复原：观察完完毕，上上悬镜筒筒，先用用擦镜纸纸擦去油油镜头上上的香柏柏油，然然后再用用擦镜纸纸沾取少少量二甲甲苯擦去去残留的的油，最最后用擦擦镜纸擦擦去残留留的二甲甲苯，后后将镜体体全部复复原。2、活菌菌制片观观察取一张干干净的载载玻片，在在其中央央滴上一一滴干净净的蒸馏馏水，取取培养112-118h的的枯草芽芽孢杆菌菌一小环环，在水水滴上反反复涂抹抹至菌体体充分分分散，盖盖上盖玻玻片，用用吸水纸纸
5、吸去多多余的水水分，按按照油镜镜的使用用步骤，观观察草芽芽孢杆菌菌形态，边边观察边边绘图。五、实验验报告油镜使用用的原理理六、思考考题1油镜与与普通物物镜在使使用方法法上有何何不同？应特别别注意些些什么？2使用油油镜时，为为什么必必须用镜镜头油？3镜检标标本时，为为什么先先用低倍倍镜观察察，而不不是直接接用高倍倍镜或油油镜观察察？七、实验验注意事事项1不准擅擅自拆卸卸显微镜镜的任何何部件,以免损损坏。2镜面只只能用擦擦镜纸擦擦，不能能用手指指或粗布布，以保保证光洁洁度。3观察标标本时，必必须依次次用低、中中、高倍倍镜，最最后用油油镜。当当目视接接目镜时时，特别别在使用用油镜时时，切不不可使用用
6、粗调节节器，以以免压碎碎玻片或或损伤镜镜面。4观察时时，两眼眼睁开，养养成两眼眼能够轮轮换观察察的习惯惯，以免免眼睛疲疲劳，并并且能够够在左眼眼观察时时，右眼眼注视绘绘图。5拿显微微镜时，一一定要右右手拿镜镜臂，左左手托镜镜座，不不可单手手拿，更更不可倾倾斜拿。6显微镜镜应存放放在阴凉凉干燥处处，以免免镜片滋滋生霉菌菌而腐蚀蚀镜片。实验二 细菌的的简单染染色和革革兰氏染染色一、实验验目的1学习微微生物涂涂片、染染色的基基本技术术，掌握握细菌的的简单染染色方法法及革兰兰氏染色色。2了解革革兰氏染染色法的的原理及及其在细细菌分类类鉴定中中的重要要性。二、实验验原理1 简单单染色的的原理大多数微微生
7、物细细胞质是是带负电电荷，简简单染色色时采用用已知的的、带正正电荷的的碱性染染料。染染料适用用于热固固定的涂涂片，染染料与菌菌体细胞胞质黏附附使菌体体着色。经经染色后后的细菌菌细胞与与背景形形成鲜明明对比。2 革兰兰氏染色色的原理理革兰氏阳阳性菌的的细胞壁壁主要有有肽聚糖糖形成的的网状结结构组成成，在染染色过程程中，当当用955%乙醇醇处理时时，由于于脱水而而引起网网状结构构中的孔孔径变小小，细胞胞壁的通通透性降降低，使使结晶紫紫-碘复合合物被保保留在细细胞壁内内而不易易脱色，因因此呈蓝蓝紫色。革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加
8、，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。三、实验验材料1大肠杆杆菌244h的斜斜面培养养物。2葡萄球球菌244h的斜斜面培养养物。3简单染染色液（美美蓝染色色液、黑黑色素液液或炭素素墨水）4革兰氏氏染色液液（结晶晶紫染液液、卢戈戈氏碘液液、955%乙醇醇、石碳碳酸复红红）5载玻片片、盖玻玻片、接接种环、镊镊子、酒酒精灯、火火柴、玻玻璃铅笔笔、蒸馏馏水等。6显微镜镜、香柏柏油、二二甲苯、擦擦镜纸、吸吸水纸等等。四、实验验方法和和步骤附表1细细菌染色色法分类类附表2 微生物物染色常常用染料料A酸性染染料：如如酸性复复红、刚刚果红、伊伊红、藻藻红、苯苯
9、胺黑等等。B碱性染染料：一一般有碱碱性复红红、中性性红、孔孔雀绿、番番红、结结晶紫、美美兰、甲甲基紫等等，细菌菌易被碱碱性染料料染色。C中性（复复合）染染料：如如伊红、美美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞核染色）。D单纯染染色：这这类染料料物，不不溶于水水，但溶溶于脂肪肪溶剂中中，如苏苏丹类（Sudan b）的染料1、简单单染色(1)涂涂片:取两块块干净的的载玻片片，各滴滴一小滴滴生理盐盐水于载载玻片中中央，用用无菌操操作分别别挑取金金黄色葡葡萄球菌菌和大肠肠杆菌于于二载玻玻片的水水滴中（每每一种菌菌制一片片），调调匀并涂涂成薄膜膜。注意意滴生理理盐水时时不宜过过多，涂涂片
10、必须须均匀。(2)干干燥：自自然气干干或酒精精灯高处处微微加加热。(3)固固定:于火焰焰上通过过23次。(4) 染色：在整个个涂面上上滴加齐齐氏石炭炭酸复红红，染色色分钟钟。（5）水水洗：倾倾去染液液，用自自来水细细流冲洗洗至流下下的水中中无染料料颜色为为止。（6）干干燥：空空气中自自然干燥燥或在酒酒精灯高高处微微微加热。（7）镜镜检：在在油镜下下观察细细菌形态态。2革兰氏氏染色（1）涂涂片。（2）初初染：在在做好的的涂面上上滴加草草酸铵结结晶紫染染液，染染1分钟，倾倾去染液液，流水水冲洗至至无紫色色。（3）媒媒染：先先用新配配的卢哥哥氏碘液液冲去残残水，而而后用其其覆盖涂涂面1分钟，后后水洗
11、。（4）脱脱色：除除去残水水后，滴滴加955%酒精精进行脱脱色约330秒，后后立即用用流水冲冲洗。（5）复复染：滴滴加番红红染色液液，染11分钟，水水洗后用用吸水纸纸吸干。（6）镜镜检：观观察染色色结果。五、实验验报告1 革兰兰氏染色色的基本本原理和和意义2 革兰兰氏染色色成败的的关键六、思考考题1根据实实验体会会，你认认为制备备染色标标本时，应应注意哪哪些事项项？2制片为为什么要要完全干干燥后才才能用油油镜观察察？3做革兰兰氏染色色涂片为为什么不不能过于于浓厚？其染色色成败的的关键一一步是什什么？4当你对对一株未未知菌进进行革兰兰氏染色色时，怎怎样能确确证你的的染色技技术操作作正确，结结果可
12、靠靠?实验三细细菌的鞭鞭毛染色色及其运运动观察察一、实验验目的1学习并并掌握细细菌鞭毛毛染色的的基本方方法及观观察细菌菌鞭毛的的着生情情况。2用压滴滴法观察察细菌的的运动3用悬滴滴法观察察细菌的的运动二、实验验原理鞭毛是细细菌的运运动“器官”，一般般细菌的的鞭毛都都非常纤纤细，其其直径为为0.01-0.02m，在普普通光学学显微镜镜的分辨辨力限度度以外，故故需要用用特殊的的鞭毛染染色法，才才能看到到。鞭毛毛染色是是借媒染染剂和染染色剂的的沉淀作作用，使使染料堆堆积在鞭鞭毛上，以以加粗鞭鞭毛的直直径，同同时使鞭鞭毛着色色，在普普通光学学显微镜镜下能够够看到。三、实验验材料1 菌种种：普通通变形杆
13、杆菌斜面面菌种2 鞭毛毛染色液液：A液，B液。3 0.01的美蓝蓝水溶液液、无菌菌水，凹凹玻片、载载玻片，盖盖玻片、香香柏油、镊镊子、酒酒精灯、擦擦镜纸、二二甲苯、吸吸水纸等等。四、实验验方法(一) 细菌鞭鞭毛染色色1制片：在载玻玻片的一一端滴一一滴蒸馏馏水，用用接种环环挑取少少许备用用的菌苔苔，最好好从菌落落的边缘缘取菌苔苔，在载载玻片的的水滴中中轻沾几几下。将将载玻片片稍倾斜斜，使菌菌液随水水滴缓慢慢流到另另一端，然然后平放放在空气气中干燥燥。2染色：涂片干干燥后滴滴加A液染3-5分钟，用用蒸馏水水冲洗，或或将残水水沥干或或用B液冲去去残水（注注意：一一定要充充分洗净净A液后再再加B液，否
14、否则背景景很脏）。洗洗净A液滴加加B液后，将将玻片在在酒精灯灯上稍加加热，使使其微冒冒蒸汽且且不干，一一般染330-60秒钟钟。然后后用蒸馏馏水冲洗洗，自然然干燥。3镜检：镜检时时，如未未见鞭毛毛，应在在整个涂涂片上多多找几个个视野，有有时只在在部分涂涂片上染染出鞭毛毛。菌体体为深褐褐色，鞭鞭毛为褐褐色。注意点：染色成成功的关关键主要要决定于于：(aa)菌种种活化的的情况，即即要连续续移种几几次；(b)菌菌龄要合合适，一一般在幼幼龄时鞭鞭毛情况况最好，易易于染色色；(cc) 新新鲜的染染色液。（d）制片时不能加热固定（二）细细菌运动动的观察察1 压滴滴法(1) 制备菌菌液：从从幼龄普普通变形形
15、菌斜面面上，挑挑数环菌菌放入装装有1-2mLL无菌水水的试管管中，制制成轻度度混浊的的菌悬液液。(2) 取2-3环稀稀释菌液液于洁净净载玻片片个央，再再加入一一环0.01的美蓝蓝水溶液液，混匀匀。(3) 用镊子子夹一洁洁净的盖盖玻片，先先使其一一边接触触菌液，然然后慢慢慢地放下下盖玻片片，这样样可防止止产生气气泡。(4) 镜检：将光线线适当调调暗，先先用低倍倍镜找到到观察部部位，再再用高倍倍镜观察察。要区区分细菌菌鞭毛运运动和布布朗运动动，后者者只是在在原处左左右摆动动，细菌菌细胞间间有明显显位移者者，才能能判定为为有运动动性。2 悬滴滴法(1) 取洁净净盖玻片片，在四四周涂少少许凡士士林。(
16、2) 在盖玻玻片中央央滴一小小滴菌液液(3) 将凹玻玻片的凹凹窝向下下，使凹凹窝中心心对准盖盖玻片中中央的菌菌液，轻轻轻地盖盖在盖玻玻片上，使使凹玻片片与盖玻玻片粘在在一起(注意液液滴不得得与凹玻玻片接触触)。(4) 小心将将玻片翻翻转过来来，使菌菌液正好好悬在窝窝的中央央。再用用火柴棒棒轻压盖盖玻片四四周使封封闭，以以防菌液液干燥。(5) 镜检：将光线线适当调调暗，先先用低倍倍镜找到到悬滴的的边缘后后，再将将菌液移移至视野野中央，换换用高倍倍镜观察察，注意意细菌是是如何运运动的，它它与分子子布朗运运动的不不同。五、实验验结果和和报告1绘出你你所观察察到的细细菌的形形态及鞭鞭毛着生生情况。2试
17、描述述你所观观察的细细菌有无无运动性性，是如如何运动动的？六、思考考题1制片时时为什么么不能加加热固定定？2没有鞭鞭毛的活活细菌在在光学显显微镜下下完全不不动吗？真实地地记录你你观察到到的现象象，并进进行解释释。3鞭毛染染色的菌菌种为什什么要先先连续传传几代，并并且要采采用幼龄龄菌种?4根据你你的实验验体会，哪哪些因素素影响鞭鞭毛染色色的效果果?如何何控制?5试设计计实验，如如何鉴别别某种细细菌是否否能运功功，是否否有鞭毛毛，其鞭鞭毛的着着生位置置。实验四 细菌的的芽孢、荚荚膜染色色一、实验验目的1掌握细细菌的芽芽孢染色色法。2掌握细细菌的荚荚膜染色色法。二、实验验材料1 枯草草芽抱杆杆菌、褐
18、褐球固氮氮菌的斜斜面菌种种。2 二甲甲苯、香香柏油、蒸蒸馏水、55孔雀雀绿水溶溶液、00.5沙黄水水溶液(或0.05碱性复复红)、绘绘图墨水水(用滤滤纸过滤滤后备用用)、995乙乙醇、石石炭酸复复红染液液。3显微镜镜、接种种环、酒酒精灯、载载玻片、盖盖玻片、小小试管(1x66.5ccm)、烧烧杯(3300mmL)、滴滴管、试试管夹、擦擦镜纸、吸吸水纸。三、实验验方法和和步骤（一）芽芽孢染色色法1方法11(1) 取377培养118-224h的的枯草芽芽孢杆菌菌作涂片片，并干干燥，固固定。(2) 于载片片上滴入入3-55滴5孔雀绿绿水溶液液。(3) 用试管管夹夹住住载玻片片在火焰焰上用微微火加热热
19、，自载载玻片上上出现蒸蒸汽时，开开始计算算时间约约4-55minn。加热热过程中中切勿使使染料蒸蒸干，必必要时可可添加少少许染料料。(4) 倾去染染液，待待玻片冷冷却后，用用自来水水冲洗至至孔雀绿绿不再褪褪色为止止。(5) 用05沙沙黄水溶溶液(或或0.005碱碱性复红红)复染染1miin，水水洗。(6) 制片干干燥后用用油镜观观察。芽芽孢呈绿绿色，菌菌体红色色。2 方法法2(1) 加1-2滴自自来水于于小试管管中，用用接种环环从斜面面上挑取取2-33环培养养18-24hh的枯草草芽孢杆杆菌菌苔苔于试管管中，并并充分混混匀打散散，制成成浓稠的的菌液。(2) 加5孔雀绿绿水溶液液2-33滴于小小
20、试管中中，用接接种环搅搅拌使染染料与菌菌液充分分混合。(3)将将此试管管浸于沸沸水浴(烧杯)中，加加热155-200minn。(4)用用接种环环从试管管底部挑挑数环菌菌于洁净净的载玻玻片上，并并涂成薄薄膜，将将涂片通通过微火火3次固固定。(5)水水洗，至至流出的的水中无无孔雀绿绿颜色为为止。(6)加加沙黄水水溶液，染染2-33minn后，倾倾去染液液，不用用水洗，直直接用吸吸水纸吸吸干。(7)干干燥后用用油镜观观察。芽芽孢绿色色，菌体体红色。(二)荚荚膜染色色法1石炭酸酸复红染染色（1）取取培养了了72hh的褐球球固氮菌菌制成涂涂片，自自然干燥燥(不可可用火焰焰烘干)。(2)滴滴入1-2滴99
21、5乙乙醇固定定(不可可加热固固定)。(3)加加石炭酸酸复红染染液染色色1-22minn，水洗洗，自然然干燥。(4)在在载玻片片一端加加一滴墨墨汁，另另取一张张边缘光光滑的载载玻片与与墨汁接接触，涂涂成均匀匀的薄层层，自然然干燥。(5)干干燥后用用油镜观观察。菌菌体红色色，荚膜膜无色，背背景黑色色。2背背景染色色（1）先先加1滴滴墨水于于洁净的的玻片上上，并挑挑少量褐褐球固氮氮菌与之之充分混混合均匀匀。(2)放放一清洁洁盖玻片片于混合合液上，然然后在盖盖玻片上上放一张张滤纸，向向下轻压压，吸收收多余的的菌液。(3)干干燥后用用油镜观观察。背背景黑色色，菌体体较暗。在在其周围围呈现一一明亮的的透明
22、圈圈即荚膜膜。四、实验验报告(一)绘绘图1枯草芽芽孢杆菌菌的芽孢孢形态，芽芽孢的着着生位置置。2褐球固固氮菌菌菌体及荚荚膜的形形态。(二)试试制片，但但不进行行染色，观观察是否否能看到到芽孢和和荚膜?五、问题题和思考考1为什么么芽孢染染色要加加热？为为什么芽芽孢及营营养体能能染成不不同的颜颜色?2组成荚荚膜的成成分是什什么?涂涂片一般般用什么么固定方方法，为为什么?3试设汁汁实验如如何鉴定定果一产产芽孢菌菌株的芽芽孢形态态、着生生位置及及所属分分类地位位。实验五 放线菌菌的形态态观察一、实验验目的1辨认放放线菌的的基本结结构：营营养菌丝丝、气生生菌丝、孢孢子丝、孢孢子的形形态；2用水封封片法、
23、玻玻璃纸法法、印片片法观察察放线菌菌的形态态特征。二、实验验材料1细黄链链霉菌的的平皿培培养物，棘棘孢小单单孢菌的的玻璃纸纸平皿培培养物。2 0.1美美蓝染色色液、石石炭酸复复红染色色液。3盖玻片片、载玻玻片、镊镊子、接接种环、显显微镜、涂涂布器、玻玻璃纸、打打孔器。三、实验验方法和和步骤(一) 观察自自然生长长状态的的放线菌菌用镊子小小心取出出用插片片法培养养的细黄黄链霉菌菌皿中的的一张盖盖玻片，将将其背面面附着的的菌丝体体擦干净净，然历历将长有有菌的一一面向上上放在洁洁净的载载玻片上上，用低低倍镜、高高倍镜观观察。找找出3类类菌丝及及其分生生孢子，注注意放线线菌的基基内曲丝丝、气生生菌丝的
24、的粗细和和色泽差差异。(二) 水封片片观察取一滴美美蓝染色色液置于于载玻片片中央，将将用搭片片法培养养的棘孢孢小单孢孢菌培养养皿中的的盖玻片片取出，并并将有菌菌的面朝朝下，放放在载玻玻片上，浸浸在染色色液中。制制成水封封片，用用高倍镜镜观察其其中个分分生孢子子及其基基内菌丝丝。（三） 玻璃纸纸法的镜镜检观察察1直接玻玻璃纸观观察 分别用用细黄链链霉菌和和棘孢小小单孢菌菌的玻璃璃纸制片片观察。制制片时，于于载玻片片上放一一小滴蒸蒸馏水，将将含菌玻玻璃纸片片小心剪剪下一小小块，移移至载玻玻片上，并并使有菌菌面向上上。在玻玻璃纸与与载玻片片间不能能有气泡泡，以免免影响观观察。将将制片于于显微镜镜下观
25、察察，先用用低倍镜镜观察菌菌的立体体生长状状况、再再用高倍倍镜仔细细观察。注注意区分分黄链霉霉菌的基基内菌丝丝、气生生菌丝和和弯曲状状或螺旋旋状的孢孢子丝。观观察棘孢孢小单孢孢菌时注注意把视视野调暗暗，其基基内菌丝丝纤细发发亮，其其单个分分生孢子子发暗，直直接生长长在基内内菌丝长长出的小小梗上。2 印片片染色法法观察 用镊镊子取洁洁净载玻玻片并微微微加热热，然后后用这微微热载玻玻片盖在在长有黄黄链霉菌菌或棘孢孢小单孢孢菌的平平皿并轻轻轻压一一下，注注意将载载玻片垂垂直放下下和取出出，以防防载玻片片水平移移动而破破坏放线线菌的自自然形态态，反转转有印痕痕的载玻玻片微微微加热固固定，用用石炭酸酸复
26、红染染色1mmin，水水洗，晾晾干。用用油镜观观察。四、实验验结果和和报告l 绘图图 玻玻璃纸法法、水封封片法、印印片法及及自然生生长状态态下观察察的；2 试比比较细黄黄链霉菌菌与棘孢孢小单孢孢菌特征征的异同同。五、问题题和思考考l 在高高倍镜或或油镜下下如何区区分放线线菌的基基内菌丝丝和气生生菌丝?2用插片片法和搭搭片法如如何制备备放线菌菌标本，其其主要优优点是什什么?实验六 霉菌的的形态观观察一、实验验目的1 掌握握微生物物载玻片片湿室培培养方法法。2 曲霉霉、青霉霉、根霉霉、毛霉霉形态观观察。3 根霉霉假根的的观察。二、实验验材料1 产黄黄青霉、黑黑曲霉、黑黑根霉、总总状毛霉霉等斜面面菌
27、种。2 半固固体PDDA培养养基、乳乳酸苯酚酚固定液液、棉蓝蓝染色液液、200甘油油。3 透明明胶带、剪剪刀、培培养皿、载载玻片、门门形玻棒棒搁架、盖盖玻片、圆圆形滤纸纸片、接接种环。三、实验验方法和和步骤(一)霉霉菌的载载玻片湿湿室培养养1准备湿湿室：在在培养皿皿底铺一一张圆形形滤纸片片，其上上放一“门”形载玻玻片搁架架，在搁搁架上放放一块载载玻片和和两块盖盖玻片，盖盖上皿盖盖，外用用纸包扎扎。经112l湿热灭灭菌300minn后，置置60烘箱中中烘干，备备用。2取菌接接种：用用接种环环挑取少少量待观观察的霉霉菌孢子子至湿室室内的载载玻片上上，每张张载玻片片可接同同一菌种种的孢子子两处。接接
28、种时只只要将带带菌的接接种环在在载玻片片上轻轻轻碰几下下即可(务必记记住接种种的位置置)。3 加培培养基 用无无菌细口口滴管吸吸取少量量融化约约60的培养养基，滴滴加到载载玻片的的接种处处。培养养基应滴滴得圆而而薄，其其直径约约为0.5cmm(滴加加量一般般以1/2小滴滴为宜)。4加盖玻玻片 在培养养基未彻彻底凝固固前，用用无菌镊镊子将皿皿内盖玻玻片盖在在琼脂块块薄层上上，用镊镊子轻压压。使盖盖玻片和和载玻片片间的距距离相当当接近，但但不能压压扁否否则不透透气。5 倒保保湿剂 每皿皿倒人约约3mLL 200的无无菌甘油油，使皿皿内的滤滤纸完全全润滑，以以保持皿皿内湿度度。皿盖盖上注明明菌名、组
29、组别和接接种日期期；此为为制成的的载玻片片湿室，置置28恒温培培养3-5天。(二)黑黑根霉假假根的培培养将融化的的PDAA培养基基，冷却却至500倒入无无菌平皿皿，其量量约为半半皿高度度的1/2、冷冷凝后，用用接种环环沾取根根霉孢子子，在平平板表面面划线接接种。然然后将平平皿倒置置，在盖盖内放一一无菌载载玻片，于于28培养22-3天天后，可可见根霉霉的气生生菌丝倒倒挂成胡胡须状，有有许多菌菌丝与载载玻片接接触，并并在载玻玻片上分分化出假假根和匍匍匐菌丝丝等结构构。(三)镜镜检观察察1 湿室室培养霉霉菌镜检检载玻片片 从从培养116-220h开开始，通通过连续续观察，可可了解孢孢子的萌萌发、曲曲
30、丝体的的生长分分化和子子实体的的形成过过程。将将湿室内内的载玻玻片取出出，直接接置于低低倍镜和和高倍镜镜下观察察曲霉、青青霉、毛毛霉、根根霉等霉霉菌的形形态，重重点观察察菌丝是是否分隔隔，曲霉霉和青霉霉的分生生孢子形形成特点点，曲霉霉的足细细胞，根根霉和毛毛霉的孢孢子囊和和泡囊孢孢子。2 粘片片观察 取一一滴棉蓝蓝染色液液置于载载玻片中中央，取取一段透透明胶带带，打开开霉菌平平板培养养物取菌菌体，粘粘面朝下下，放在在染液上上。镜检检。3假根观观察 将培养养根霉假假根的平平皿打开开，取出出皿盖内内的载玻玻片标本本，在附附着菌丝丝体的一一面盖上上盖玻片片，置显显微镜下下观察。只只要用低低倍镜就就能
31、观察察到假根根及从根根节上分分化出的的孢子囊囊梗、孢孢子囊、孢孢囊孢子子和两个个假根间间的匍匐匐菌丝，观观察时注注意调节节焦距以以看清各各种构造造。4制成永永久装片片 把把观察到到霉菌形形态较清清晰，完完整的片片子，制制成标本本作较长长期保存存。制备备方法是是，轻轻轻揭去盖盖玻片，如如果载玻玻片上有有琼脂，仔仔细挑去去，然后后滴加少少量乳酸酸苯酚固固定液，盖盖上清洁洁盖玻片片，在盖盖玻片四四周滴加加树胶封封固。四、实验验结果和和报告绘制并标标注镜几几种霉菌菌镜检形形态图五、问题题和思考考1 什么么叫载玻玻片湿室室培养，它它适用于于观察怎怎样的微微生物，有有何优点点?2 湿室室培养时时为何用用2
32、0甘油作作保湿剂剂？3 本实实验中观观察假根根的设计计原理是是什么？此设计计还适合合于培养养哪类菌菌？六、注意意事项载玻片湿湿室培养养时，盖盖玻片不不能紧贴贴载玻片片，要彼彼此有极极小缝隙隙。结构构平行排排列，易易于观察察。实验七 酵母母形态观观察和大大小测定定一、实验验目的1了解自自然存在在的酵母母菌及其其形态结结构。2了解酵酵母菌产产生子囊囊泡子的的条件及及其形态态。3了解酵酵母菌死死活的判判别方法法。4以酵母母菌为例例，学会会测微尺尺的使用用和计算算方法及及对微生生物细胞胞大小的的测定方方法。二、实验验材料1 酿酒酒酵母、热热带假丝丝酵母斜斜面菌种种。2 PDDA培养养基、麦麦氏培养养基
33、（醋醋酸钠培培养基）。3 0.05%美蓝染染色液(以pHH6.00的0.02%moll/L磷磷酸缓冲冲液配制制)、碘碘液、00.044%中性性红染色色液、55孔雀雀绿、00.5%的沙黄黄液、995乙乙醇。4 显微微镜、载载玻片、擦擦镜纸、孟孟玻片、接接种环、vv形玻璃璃棒、放放置一个个三角形形玻璃棒棒支架的的培养皿皿。5 目镜镜测微尺尺、镜台台测微尺尺。三、实验验方法与与步骤(一)酵酵母菌形形态观察察1酵母菌菌的活体体染色观观察及死死亡率的的测定(1)以以无菌水水洗下PPDA斜斜面培养养的酿酒酒醉母菌菌苔，制制成菌悬悬液。(2)取取0.005美美蓝染色色液1滴滴，置载载玻片中中央，并并用接种种
34、环取酵酵母菌悬悬液与染染色液混混匀，染染色3mmin，加加盖玻片片，在高高倍镜下下观察酵酵母菌个个体形态态，区分分其母细细胞与芽芽体，区区分死细细胞(蓝蓝色)与与活细胞胞(不着着色)。2酵母菌菌液泡系系的活体体观察 于洁洁净载玻玻片中央央加一滴滴中性红红染色液液，取少少许上述述酵母菌菌悬液与与之混合合，染色色5miin，加加盖玻片片在胶微微镜下观观察。细细胞无色色，液泡泡呈红色色。3 酵母母菌细胞胞中肝糖糖粒的观观察 将1滴滴碘液置置于载破破片中央央，接入入上述酵酵母菌悬悬液，混混匀，盖盖上盖玻玻片，显显微镜观观察，细细胞内的的贮藏物物质肝糖糖颗粒呈呈深红色色。4 酵母母菌子囊囊孢子的的观察挑
35、取产孢孢菌苔涂片固定染色水洗干燥镜检计数。(1)活活化酿酒酒酵母：将酿酒酒酵母按按种至新新鲜的麦麦芽汁培培养基上上，置228培养养2-33天，然然后再移移接2-3次。(2)移移接产孢孢培养基基：将活活化的酿酿洒酵母母移接至至醋酸钠钠培养基基上，置置30恒温培培养144天。(3)观观察：挑挑取少许许产孢菌菌苔于载载玻片的的水滴上上，经涂涂片、热热固定后后，加数数滴孔雀雀绿，11minn后水洗洗，加995乙乙醇300s，水水洗，最最后用00.5沙黄液液复染330s，水水洗去染染色液，最最后用吸吸水纸吸吸干。制制片干燥燥后，镜镜检，子子囊孢子子呈绿色色，子囊囊为粉红红色。注注意观察察子囊孢孢子的数数
36、目、形形状和子子囊的形形成率。(4)计计算子囊囊形成的的百分率率：计数数时随机机取3个个视野，分分别计数数产子囊囊孢子的的子囊数数和不产产孢子的的细胞，然然后按下下列公式式计算：5 酵母母菌假菌菌丝的观观察 取一无无菌载玻玻片浸于于溶化的的PDAA培养基基中，取取出放在在湿室培培养的支支架上，待待培养基基凝固后后，进行行酵母菌菌划线接接种，然然后将无无菌盖玻玻片盖在在接菌线线上，培培养2-3天后后，取出出载玻片片，擦去去载玻片片周围的的培养基基，在显显微镜下下直接观观察。可可见到芽芽殖酵母母形成的的藕节状状假菌丝丝，裂殖殖酵母则则形成竹竹节状假假菌丝。酵母菌假假菌丝的的观察：取出长长有假菌菌丝
37、的载载玻片，擦擦去载玻玻片周围围的培养养基，放放在再拨拨片载玻玻片上，在在显微镜镜下直接接观察。（二）酵酵母大小小的测定定l 测微微尺的构构造：显显微镜测测微尺是是由目镜镜测微尺尺和镜台台接物测测微尺组组成，目目镜测微微尺是一一块圆形形玻璃片片，其中中有精确确的等分分刻度，在在5mmm刻尺上上分500份。目目镜测微微尺每格格实际代代表的长长度随使使用接目目镜和接接物镜的的放大倍倍数而改改变，因因此在使使用前必必须用镜镜台测微微尺进行行标定。（测测微尺的的构造）镜台测微微尺为一一专用中中央有精精确等分分线的载载玻片，一一般将长长为1mmm的直直线等分分成1000个小小格，每每格长00.011mm
38、，是是专用于于校正目目镜测微微尺每格格长度的的。2目镜测测微尺的的标定：把目镜镜的上透透镜旋开开，将目目镜测微微尺轻轻轻放入目目镜的隔隔板上，使使有刻度度的一面面朝下。将将镜台测测微尺放放在显微微镜的载载物台上上，使有有到度的的一面朝朝上。先先用低倍倍镜观察察，调焦焦距，待待看清镜镜台测微微尺的刻刻度后，转转功目镜镜，使目目镜测微微尺的刻刻度与镜镜台测微微尺的刻刻度相平平行，并并使两尺尺左边的的一条线线重合，向向右寻找找另外一一条两尺尺相重合合的直线线。（目目镜测微微尺的标标定）3计算方方法菌体的大大小=目目镜测微微尺下菌菌占的格格数目镜测测微尺没没格的标标定值。4酵母菌菌大小的的测定 将镜镜
39、台测微微尺取下下，换上上酿酒酵酵母菌玻玻片标本本，先在在低倍镜镜下找到到目的物物，然后后在高倍倍镜下用用目镜测测微尺测测量菌体体的大小小。先量量出菌体体的长和和宽占目目镜测微微尺的格格数，再再以目镜镜测微尺尺每格的的长度计计算出菌菌体的长长和宽。并并详细记记录于表表中，最最后，求求出平均均值，才才能代表表该菌的的大小。（酵酵母菌大大小的测测定）四、实验验结果与与报告五、问题题和思考考1 为什什么更换换不同放放大倍数数的目镜镜和物镜镜时必须须重新用用镜台测测微尺对对目镜测测微尺进进行标定定?2若目镜镜不变，目目镜测微微尺也不不变，只只改变物物镜，那那么目镜镜测微尺尺每格所所测量的的镜台上上的菌体
40、体细胞的的实际长长度(或或宽度)是否相相同?为为什么?六、注意意事项1镜台测测微尺的的玻片很很薄，在在标定油油镜头时时，要格格外注意意，以免免压碎镜镜台测微微尺或损损坏镜头头。2标定目目镜测微微尺时要要注意淮淮确对正正目镜测测微尺与与镜台测测微尺的的重合线线。目镜镜测微尺尺、镜台台测微尺尺的显微微镜下示示范。实验八 细菌的的生理生生化反应应一、实验验目的1了解细细菌鉴定定中常用用的主要要生理生生化反应应实验法法及其原原理。2比较44种菌的的V.PP反应结结果。3比较44种菌的的甲基红红反应结结果。4比较44种菌的的吲哚反反应结果果。5学习使使用杜氏氏小管进进行糖发发酵试验验，并比比较3种种菌的
41、糖糖发酵试试验结果果。二、实验验材料1大肠杆杆菌、产产气肠杆杆菌、普普通变形形杆菌、枯枯草芽孢孢杆菌的的斜面菌菌种。2葡萄糖糖蛋白胨胨水培养养基、蛋蛋白胨水水培养基基、糖发发酵培养养基(葡葡萄糖、乳乳糖或蔗蔗糖)。3 400NaaOH溶溶液、肌肌酸、甲甲基红试试剂、吲吲哚试剂剂、乙醚醚、1.6溴溴甲酚紫紫指示剂剂。4超净工工作台、恒恒温培养养箱、高高压蒸汽汽灭菌锅锅、试管管、移液液管、杜杜氏小套套管。三、实验验方法与与步骤(一) V.PP反应1 试管管标记：以5支支装有葡葡萄糖蛋蛋白胨水水培养基基的试管管，分别别标记大大肠杆菌菌、产气气肠杆菌菌、普通通变形杆杆菌、枯枯草芽孢孢杆和空空白对照照。
42、2接种培培养：以以无菌操操作分别别接种少少量菌苔苔至以上上相应试试管中，空空白对照照不接菌菌。置337恒温培培养箱中中，培养养24-48hh。3观察记记录：取取出以上上试管，振振荡2mmin。另另取5支支空试管管相应标标记菌名名，分别别加入33-5mmL以上上对应管管中的培培养液，再再加入440NNaOHH溶液110-220滴，并并用牙签签挑入约约0.55-1mmg微量量肌酸，振振荡试管管，以使使空气中中的氧溶溶入，放放在377恒温箱箱中保温温15-30mmin后后，若培培养液呈呈红色，记记录为VV.P.试验阳阳性反应应(用“+”表示)；若不不呈红色色，则记记录为VV.P.试验阴阴性反应应(用
43、“-”表示)注意：原原试管中中留下的的培养液液供作甲甲基红试试验用。(二)甲甲基红试试验(MM.R.试验)于V.PP.试验验留下的的培养液液中，各各加入22-3滴滴甲基红红试指示示剂，注注意沿壁壁加入，仔仔细观察察培养液液上层，若若培养液液上层变变成红色色，则为为阳性反反应；若若仍成黄黄色，则则为阴性性反应。(三)吲吲哚试验验1试管标标记：取取装有蛋蛋白胨水水培养基基的试管管5支，分分别标记记大肠杆杆菌、产产气肠杆杆菌、普普通变形形菌、枯枯草芽孢孢杆菌和和空白对对照。2接种培培养：以以无菌操操作分别别接种少少量菌苔苔到以上上相应试试管中，第第5管作作空白对对照不接接种，置置37恒温箱箱中培养养
44、24-48hh。3观察记记录：在在培养基基中加入入乙醚11-2mml，经经充分振振荡使吲吲哚萃取取至乙醚醚中，静静置片刻刻后乙醚醚层浮于于培养液液的上面面，此时时沿管壁壁缓慢加加入5-10滴滴吲哚试试剂(加加入吲哚哚试剂后后切勿摇摇动试管管，以防防破坏乙乙醚层影影响结果果观察)，如有有吲哚存存在，乙乙醚层呈呈现玫瑰瑰红色，此此为吲哚哚试验阳阳性反应应。否则则为阴性性反应。阳阳性用“+”表示，阴阴性用“-”表示。(四) 糖发酵酵试验原理：可可根据细细菌分解解利用糖糖能力的的差异表表现出是是否产酸酸产气作作为鉴定定菌种的的依据。是是否产酸酸，可在在糖发酵酵培养基基中加入入指示剂剂溴甲酚酚紫指示示剂
45、(即B.C.PP指示剂剂，其ppH在55.2以以下呈黄黄色，66.8以以上呈紫紫色)，经经培养后后根据指指示剂的的颜色变变化来判判断是否否产气，可可在发酵酵培养基基中放人人倒置杜杜氏小管管观察。1试管标标记：取取分别装装有葡萄萄糖、蔗蔗糖和乳乳糖发酵酵培养液液试管各各4支，每每种糖发发酵试管管中均分分别标记记大肠杆杆菌、产产气肠杆杆菌、普普通变形形菌和空空白对照照。2接种培培养：以以无菌操操作分别别接种少少量菌苔苔至以上上相应试试管中，每每种糖发发酵培养养液的空空白对照照均不接接菌。将将装有培培养液的的杜氏小小管倒置置放入试试管中，置置37恒温箱箱中分别别培养224h、448h和和72hh观察
46、结结果。3观察记记录：与与对照管管比较，若若接种培培养液保保持原有有颜包，其其反应结结果为阴阴性，表表明该种种菌不能能利用该该种糖，记记录用“-”表示；如培养养液呈黄黄色，反反应结果果为阳性性，表明明该菌能能分解该该种糖产产酸，记记录用“+”表示。培培养液中中的杜氏氏小管内内有气泡泡为阳性性反应，表表明该菌菌分解糖糖能产酸酸并产气气记录录用“”表示；如杜氏氏小管内内没有气气泡为阴阴性反应应，记录录用“”表示。四、实验验结果和和报告1细菌的的生理生生化反比比试验测测定结果果。2 在VV.P.反应中中加入NNaOHH溶液和和肌酸，在在吲哚试试验中加加入乙醚醚，它们们各有什什么作用用？五、问题题与思
47、考考1以上生生理生化化反应能能用于鉴鉴别细菌菌，其原原理是什什么?2细菌生生理生化化反应试试验中，为为什么要要设空白白对照?3现分离离到一株株肠道细细菌，试试结合本本实验学学到的知知识设计计一个实实验方案案进行鉴鉴别。六 演 示1 杜氏氏小管倒倒置装入入培养液液管中不不残留气气泡的操操作过程程。2 分别别显示、甲甲基红试试验、吲吲哚试验验和糖发发酵试验验培养液液阳性反反应和阴阴性反应应结果的的颜色变变化情况况。七、注意意事项1 V.P反反应中加加入NaaOH溶溶液和肌肌酸后要要反复振振荡试管管，使空空气中氧氧溶入培培养液中中。2甲基红红试验中中，不要要过多滴滴加甲基基红指示示别，以以免出现现假阳性性反应。3 吲哚哚试验中中宜选用用色氨酸