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1、基因工程第二章第二章 基因操作的主要技术原理基因操作的主要技术原理第一节第一节 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳第二节第二节 核酸分子杂交核酸分子杂交第三节第三节 PCR基因扩增基因扩增第四节第四节 基因定点诱变基因定点诱变第五节第五节 DNA核苷酸序列分析核苷酸序列分析第六节第六节 研究研究DNA与蛋白质相互作用的方法与蛋白质相互作用的方法 返回目录1.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理分子生物学主要技术分子生物学主要技术密度梯度超速离心和电子显微镜技术密度梯度超速离心和电子显微镜技术DNA分子的切割与连接分子的切割与连接核酸分子杂交、凝胶电泳、核酸分子杂交、凝胶电泳
2、、DNA序列结构分析以及基因的人工合成、基序列结构分析以及基因的人工合成、基因定点突变和因定点突变和PCR扩增等多种新技术、新方法。扩增等多种新技术、新方法。DNA分子的切割与连接，是基因操作的核心部分分子的切割与连接，是基因操作的核心部分返回第二章返回目录2.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理第一节第一节 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 1.基本原理基本原理 2.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 3.脉冲电场凝胶电泳脉冲电场凝胶电泳返回第二章返回目录3.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理2.1.1 原理原理电泳及迁移率电泳及迁移率核苷酸链多聚
3、阴离子核苷酸链多聚阴离子在生理条件下，核酸分子的糖一磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。相同分子量的双链DNA几乎具有等量净电荷无反应活性的稳定的介质无反应活性的稳定的介质 降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，分子大小的不同、构型或形状的差异，所带的净电荷的多寡，便彼此分离开来。4.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理2.1.2 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳n琼脂糖为线性多糖聚合物，红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固，密度由浓度决定的。n分辨能力同凝胶的类型和浓度有关:
4、琼脂糖凝胶分辨范围为0250kb之间.5.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理不同浓度琼脂糖凝胶的分辨能力不同浓度琼脂糖凝胶的分辨能力 凝胶类型及浓度分离DNA片段的大小范围（bp）0.3琼脂糖5000010000.7琼脂糖2000010001.4琼脂糖60003004.0琼脂糖100010010琼脂糖5002520琼脂糖5016.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理电泳装置电泳装置7.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理凝胶电泳的优点凝胶电泳的优点它不单是一种分析的手段，同时也可以用来制备和纯化特定的DNA片段。在
5、这方面，低熔点（LMP）的琼脂糖凝胶较为方便。LMP琼脂糖是一种熔点为6265的琼脂衍生物，它一旦熔解，便可在37下持续保持液体状态达数小时之久，而在25下也可持续保持液体状态约10分钟。LMP琼脂糖可以不经电洗脱或破碎凝胶，即可用来回收DNA分子。8.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同。二甲苯青的水溶液呈兰色，在1%和1.4%琼脂糖中迁移速率分别与2Kb和1
6、.6Kb的双链线性DNA相似.指示剂一般与蔗糖、甘油组成载样缓冲液.作用有增加样品密度.在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置.使样品呈色，加样操作更方便 指示剂指示剂9.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理溴化乙锭染色溴化乙锭染色溴化乙锭溴化乙锭（ethidiumbromide，简称EtBr），是一种具扁平分子的核酸染料，在一切可能的部位同DNA分子结合，却不能同琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶结合并在300nm紫外光照射下放射出，可显现凝胶中0.05ug的微量DNA方法：方法：加入凝胶中，凝胶浸泡重要的特性重要的特性：荧光强度同DNA片段的大小或数量成
7、正比。在包含有数种DNA片段的电泳谱带中，每一条带的荧光强度是随着从最大的DNA片段到最小的DNA片段方向逐渐降低的。10.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理电泳照片电泳照片11.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理银染银染银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色.也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收12.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理LMP琼脂糖回收琼脂
8、糖回收DNA分子分子将凝胶在65下加热数分钟，然后向液态琼脂糖溶液中加入过量的酚液抽提DNA，这样在离心所得的上清液中便含有除去了琼脂糖的DNA分子。另外，一旦LMP琼脂糖已经熔化，并保持在37下，那么就可以直接进行一定的酶催反应。据此，人们可以对业经电泳分离的DNA酶切片段进行第二种酶切消化反应。将这种混合物加到另一个凝胶槽上，待凝固之后，再进行第二次电泳13.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理14.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理变性胶电泳变性胶电泳q方法方法q用途用途15.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术
9、原理2.1.3 脉冲电场凝胶电泳脉冲电场凝胶电泳DNA大分子的分离：实验表明，即便是浓度为0.10.2的琼脂糖凝胶，亦不能分离分子量大于750kb的DNA大分子。原核生物，其染色体基因组DNA超过4000kb，哺乳动物DNA达数千kb。常规凝胶，超过一定大小范围的所有的双链DNA分子，都按相同速率迁移。因为它们在单向恒定电场的作用下，仅以“一端向前”的方式游动穿过整个胶板。1984，Schwartz和Cantor：脉冲电场凝胶电泳（pulsedfieldgelelectrophoresis，简称PFGE）技术，可分离整条染色体。大分子量DNA需更多次数更换构型和方位，以便按新方向游动。迁移速率
10、慢，可分离到107bpDNA大分子。16.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理“电泳电泳”思考题思考题v电泳的原理是什么电泳的原理是什么v请说出以下电泳用胶的区别：普通请说出以下电泳用胶的区别：普通DNA分离、测序胶、分离、测序胶、Southern 杂交杂交v比较分子量相同的三种不同构型的比较分子量相同的三种不同构型的DNA（直链线形、闭合环直链线形、闭合环形、开链环形）在同一电场中的电泳迁移率形、开链环形）在同一电场中的电泳迁移率v比较溴化乙锭染色和银染的区别比较溴化乙锭染色和银染的区别v说明电泳技术在基因工程中的作用说明电泳技术在基因工程中的作用返回第二章返回目录
11、17.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理第二节第二节 核酸分子杂交核酸分子杂交 1.Southern DNA印迹杂交印迹杂交 2.Northern RNA印迹杂交印迹杂交 3.Western印迹杂交印迹杂交 4.菌落菌落(或噬菌斑或噬菌斑)杂交杂交 5.斑点印迹杂交和狭线印迹杂交斑点印迹杂交和狭线印迹杂交返回第二章返回目录18.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理2.2.1 Southern blot2.2.1 Southern blot根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转片段转移
12、并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验片段，这种实验方法叫做方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由印迹杂交技术。由于它是由ESouthern于于1975年首先设计出来的，故又叫做年首先设计出来的，故又叫做Southern DNA印迹转移技术。印迹转移技术。19.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理Southern blotSouthern blot原理模式原理模式变变性性胶胶电电泳泳转膜放射性探针杂交放射自显影回收DNA漂洗2
13、0.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理Southern blotSouthern blot转移装置图转移装置图缓冲液玻璃板21.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理Southern blotSouthern blot自显影图样自显影图样22.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理探探 针针 标标 记记探针探针-单链探针：单链探针：末端标记末端标记lKlenow:标记3端，补平和置换反应lT4 polymerase:标记3端 3-5外切活性强，特别适用于3突出末端lKinase:标记5端 正反应 32P5-OH NNN
14、N5p NNNN 交换反应 过量ATP 使5-pADP then 32P5l末端转移酶标记3DNA片段，Oligo,随机DNAssDNA模板，通用引物，合成ssDNA探针RNA探针，RNApolymerase23.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理 寡核苷酸寡核苷酸 5Kinase,3末端转移酶 标记物标记物 放射性：32P，33P，35S 非放射性：Digoxigenin,Biotin 用于标记dUTP24.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理DIGDIG标记标记/检测举例检测举例q探针标记 6Nt随机寡核苷酸序列引物，Klenow标记
15、q检测 漂洗 blocking 免疫反应 labeled Anti-DiG-Ab-Ap 洗涤 显色反应 化学发光检测 NBT-BCIP 形成棕黄色沉淀返回第二节返回第二节25.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理2.2.2 Northern blot2.2.2 Northern blot类似于Southern blot,但用于检测RNA的分子杂交技术，用于分析总RNA或mRNAv电泳缓冲液 甲醛buf(5)0.1mM MOPS(Ph 2.0)(3-(N-玛琳代)丙磺酸)40 mM NaAc 5mM EDTA(pH 8.0)DEPC H2O 制胶 甲醇（MW 30.03
16、）通常为37%水溶液，12.3M(pH4.0)终浓度，1buf+2.2M甲醇26.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理v 上上 样样 预处理 RNA（up to 30g）4.5l+5buf 2.0l 甲醛 3.5 l 甲酰胺 10 l 65 15min loading buf 50%甘油，1mM EDTA（pH 8.0）0.25%BPB 0.255 二甲苯 TFFv 电电 泳泳 loading之前，预电泳5min 5V/cm 电泳1-2hr之后，混合正负极电泳液27.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理v 转转 膜膜 q预处理 DEPC H2
17、O洗涤去除甲醛如果胶浓度10%或 厚度0.5cm 或 底物2.5kb，需用0.05M NaOH处理20min，部分水解RNA无RNase H2O洗涤，20SSC浸泡45minq转移，同Southern返回第二节返回第二节28.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理2.2.3 Western blot2.2.3 Western blot基基本本原原理理同其它blot方式，用于检测蛋白质，与Southern的关键区别在于探针性质：抗体抗体的要求：抗体的要求：v 单克隆抗体 但并非都合适，由于靶蛋白已变性v 多克隆抗体 抗体为混合物，对其特异性，亲和力及浓度都一无所知，对由S
18、DS/还原剂变性处理的目标蛋白是否还能识别应做预备实验29.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理 简要步骤 制备样品制备样品 SDS-PAGE样品 蛋白质转移蛋白质转移 硝酸纤维素滤膜，电转移：三夹板/隔离电极板；干燥染色丽春红Sor印度墨水（射启性检测适用）但现少采用，由于有prestainMWmarker30.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理 封闭背景 脱脂奶粉 5%第一抗体与靶蛋白结合 二级免疫反应 抗免疫球蛋白抗体或A 蛋白 标记：125I 碱性磷酸酶 辣根过氧化物酶 偶联A蛋白可与IgG的Fc片段binding木瓜蛋白酶切割Ig
19、GFragment antigen binding，Fragment crystalline返回第二节返回第二节31.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理2.2.4 2.2.4 原位杂交：菌落杂交和空斑杂交原位杂交：菌落杂交和空斑杂交v菌落生长点种点种：阳性重组子二个平板上（有/无膜）；加CK影印影印：菌落和空斑，绝大多数应为重组子（白色菌落）vDNA的释放与固定：有多种方法10%SDS0.5N NaOH/1.5N NaCl0.5M Tris 1.5N NaClSSC干燥固定 80 2hr返回第二节返回第二节32.基因工程基因工程第二章第二章 基因工程技术原理基因工程技术原理回答问题回答问题1.什么是什么是 Southern blotting,Northern blotting 和和 Western blotting.各有什么用途？各有什么用途？2.用于核酸杂交的电泳与比较核酸分子大小的电泳有什用于核酸杂交的电泳与比较核酸分子大小的电泳有什么异同？么异同？返回第二节返回第二节33.