《GB∕T 40458-2021 用于病原微生物高通量检测的核酸提取技术规范.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《GB∕T 40458-2021 用于病原微生物高通量检测的核酸提取技术规范.pdf（10页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、ICS 66.020.01 CCS B 16 GB 中华人民共和国国家标准GB/T 40458-2021 用于病原微生物高通量检测的核酸提取技术规范Specification of nucleic acid extraction used for high-throughput detection of pathogenic microorganisms 2021-08-20发布国家市场监督管理总局毕+国家标准化管理委员会也叩2022-03-01实施GB/T 40458-2021 目Ij1=1 本文件按照GB/T1.1-2020(标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请
2、注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国植物检疫标准化技术委员会CSAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位:中国检验检疫科学研究院、中山海关技术中心。本文件主要起草人:姜帆、张永江、陈健、岳巧云、邱德义。I 1 范围用于病原微生物高通量检测的核酸提取技术规范GB/T 40458-2021 本文件规定了利用二代测序技术对病原微生物进行高通量检测的核酸的提取要求，描述了对应的提取方法。本文件适用于植物及其产品的植物病原细菌、真菌、病毒和病媒生物携带的细菌的核酸提取方法。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
3、其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 19489 实验室生物安 全通用要求SN/T 2752.4 卫生检疫人员的自我防护规范第4部分:实验室人员SN/T 2776 国境口岸医学媒介生物监测实验室管理要求SN/T 4278-2015 国境口岸医学媒介昆虫DNA条形码鉴定操作规程SN/T 4625-2016 DNA条形码筛选与质量要求3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸CDeoxyribonucleicAcid)OD:光密度COpticalDens
4、ity)PCR:聚合酶链式反应CPolymeraseChain Reaction)RNA:核糖核酸CRibonucleicAcid)5 总体要求核酸提取主要包括生物样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其他成分，如蛋白质、多糖、脂类等其他组织或者细胞成分彻底分离的过程。核酸提取应保证核酸一级结构的完整性。排除其他分子，如蛋白质、多糖、脂类、有机溶剂等的污染，保证下游高通量检测试验顺利进行。试验过程中应防止外界环境(如灰尘、气榕胶、RNA酶等)对核酸提取的污染，以及病原物本身及试GB/T 40458-2021 验过程中的废弃物、废弃液等
5、对环境的污染。在整个试验操作过程中应采用安全有效的防护措施。具体要求应符合GB19489,SN/T 2752.4,SN/T 2776中的规定。6 提取步骤6.1 细胞裂解从组织中提取核酸应先将组织分散成单个细胞，然后破碎胞膜及核膜，使核酸释放出来。从各种不同来源的样品中提取高纯度的病原微生物核酸，因细胞结构及所含成分不同，样品预处理的方式也不同，植物及其产品、动物组织等宜采取液氮研磨的方式。6.2 核酸的分离纯化核酸样品中不应存在其他生物大分子(如蛋白质、多糖、多盼和脂类等).以及不应存在对酶(如核酸内切酶、DNA聚合酶等)有抑制作用的成分。同时，应排除其他核酸分子的污染，例如.DNA样品中应
6、去除污染的RNA.反之RNA中应去除DNA。针对不同来源样品的具体核酸提取方法按附录A和附录B的规定执行。6.3 核酸质量检测6.3.1 核酸的完整性检测将提取的核酸样品CDNA或RNA)进行琼脂糖凝胶电泳或芯片检测，并与核酸分子量标准对照。完整性较好的DNA样品呈现出明显而清晰的单一条带，完整性较好的RNA样品呈现出三条带，亮度依次递减。6.3.2 核酸的浓度和纯度检测利用仪器检测核酸的浓度及纯度:核酸浓度可在仪器上直接读出，核酸样品纯度用ODZ60/0Dz80值检测，纯度较高的DNAODZ60/0D280值应为1.71.9.RNA ODZ60/0Dz80值应为1.82.0。6.3.3 PC
7、R法进一步检测核酸质量宜采用PCR法进一步检测核酸质量，按照SN/T4278-2015中的7.4执行，扩增引物按照SN/T 4625-2016中的8章、9章执行。出现目的片段的扩增产物可用于后续高通量检测。细菌、真菌高通量检测宜采用扩增子测序分析，病毒高通量检测宜采用小RNA测序分析。7 样晶保存与记录7.1 样晶保存提取出的核酸样品应先进行分装，妥善保存在80 C超低温冰箱中，以保证其在后续分析中的稳定性，避免反复冻融。7.2 结果记录应做好样品来源、取样人员、核酸浓度、核酸纯度、电泳结果图等文档的登记、标记和存档，便于复核。2 A.1 适用范围附录A(规范性)植物病原微生物的核酸提取方法G
8、B/T 40458-2021 本方法适用于从植物及其产品中提取病原微生物DNA和/或RNA，适用范围 广，可实现植物病原细菌、真菌、病毒的DNA和RNA共提取。A.2 试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯或生化试剂。OMEGA E.Z.N.A.Plant DNA/RNA KitCR6733)试剂盒J)C包括:CPL缓冲液、DNA洗涤缓冲液、PR缓冲液、RWC洗涤缓冲液、RNA洗涤缓冲液H、DNA吸附柱、RNA吸附柱)、2琉基乙醇、三 氯甲皖、无水乙醇。A.3 仪器设备组织细胞破碎仪、高速离心机、振荡器、水浴锅、超微量分光光度计、电泳系统、凝胶成象系统、电子分析天平(分度值为0.001g)、超净
9、工作台、4C冰箱、-80C超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉。A.4 样品携带病原细菌、真菌、病毒的植物及其产品。A.5 提取步骤A.5.1 核酸提取前处理方法称取200mg2 g植物样品或植物种子在液氮中研磨至粉末状，将植物样品粉末或植物种子粉末转入1.5mL离心管中，为保证后续核酸提取质量，每个1.5mL离心管中植物样品粉末100mg或植物种子粉末40mg。随后向每个1.5mL离心管中加入500f-L CPL缓冲液(使用前，每1mL CPL缓冲液加入20L2琉基乙醇?昆合，11昆合液可在室温条件下保存1个月),55 C水浴10min,加入500L三氯甲皖，振荡305，13000r/mi
10、n离心5min,转移350L上清液至新离心管中，并向其中加入350LPR缓 冲液，振荡j昆匀，将泪合液转移至DNA吸附柱CDNA吸附柱放入2mL收集管中),10000 r/min离心1mi口，将DNA吸附柱放置室温或4 C待后续用于DNA提取，洗脱液用于后续RNA提取。A.5.2 DNA提取将A.5.1所得DNA吸附柱放入新的2mL离心宫中，向DNA吸附柱中加入500LDNA洗涤缓冲液，10000r/min离心1min，弃掉滤液。向DNA吸附柱中加入500LDNA洗涤缓冲液，14000 r/min离心2min，弃掉滤液。可适当延长离心时间以保证DNA吸附柱彻底干燥。1)QMEGA公司生产的E.
11、Z.N.A.Plant DNA/RNA Kit(R6733)试剂盒是适合的市售产品的实例。给出这一信息是为了方便本文件的使用者，并不表示对这一产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，那么可使用这些等效产品。3 GB/T 40458-2021 将DNA吸附柱放入新的1.5mL离心管中，向吸附膜中间悬空滴加50L100L洗脱缓冲液，室温放置2min,10000 r/min离心2min，DNA被洗脱到离心管中，分装，做好标记，一80C保存备用。A.5.3 RNA提取向A.5.1所得的洗脱液中加入0.5倍洗脱液体积的元水乙醇，轻轻棍匀，得到溶液A。将700L液体A转移至RNA吸附柱CRNA吸附柱放入2
12、mL收集管中)，10000 r/min离心1 min，弃掉if.l、液。将剩余溶液A所得液体转移至RNA吸附柱，10000r/min离心1min，弃掉滤液。向RNA吸附柱中加入500LRWC洗涤缓冲液，10000r/min离心1min，弃掉滤液。向RNA吸附柱中加入500LRNA洗涤缓冲液1IC使用前按说明要求加入相应量的元水乙醇),10 000 r/min离心1min，弃掉滤液。向RNA吸附柱中加入500LRNA洗涤缓冲液1I,10 000 r/min离心2min，弃掉滤液。可适当延长离心时间以保证RNA吸附柱彻底干燥。将RNA吸附柱放入新的1.5mL离心管中，向吸附膜中间悬空滴加40L70
13、L焦碳酸二乙醋CDEPC)洗脱缓冲液，室温放置2min,14 000 r/min离心1min，RNA被洗脱到离心管中。为提高RNA浓度，可重新吸取离心得到的RNA1容液，再加入RNA吸附柱中，室温放置2min,14 000 r/min离心1min,RNA被洗脱到离心管中，分装，做好标记，-80C保存备用。4 B.1 适用范围附录B(规范性)病媒生物携带细菌性样晶的核酸提取方法GB/T 40458-2021 本方法适用于利用二代测序技术对本底调查或口岸截获的病媒生物携带未知细菌进行高通量检测鉴定的DNA提取工作。B.2 试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯或生化试剂。TIANamp Bacter
14、ia DNA Kit(DP302)试剂盒2)包括:蛋白酶K恪液(20mg/mU、缓冲液GB、缓冲液GD、漂洗液PW、吸附柱CB3、溶菌酶(70000u/mg)、元水乙醇、0.9%NaCl 溶液、纯水。B.3 仪器设备组织细胞破碎仪、高速离心机、振荡器、水浴锅、超微量分光光度计、电泳系统、凝胶成像系统、电子分析天平(分度值为0.001g)、超净工作台、4C冰箱、80 C超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉。B.4 样晶携带未知细菌的病媒生物。B.5 提取步骤B.5.1 DNA提取前处理方法B.5.1.1 体表携带细菌的收集方法取1只病媒昆虫或鼠的组织(毛、足、耳等非内脏组织)置于适中的离心管中
15、，加入可浸没该病媒生物的0.9%NaCll容液，800r/min游涡振荡30s，短暂离心。收集上清转移至新的离心管中12000 r/min离心2min。弃上清，留沉淀。重复以上步骤3次。将收集的细菌沉淀物，加入500L0.9%NaCl溶液悬浮后合并，4C保存备用。收集废弃液和废弃物高压灭菌后丢弃。B.5.1.2 体内携带细菌的收集方法将B.5.1.1处理后病媒生物移入新的灭菌离心管中，加入可漫没病媒生物的75%乙醇浸泡5min,重复3次;将病媒生物转移至另一个新的灭菌离心管中，然后加入可浸没病媒生物的0.9%NaCl溶液，800 r/min游涡振荡30s，弃上清，以上步骤重复3次。将样本放置在
16、生物安全柜中晾干15min。用灭菌慑子将样本移入新离心管中，将标本研碎成糊状。加入3mL生理盐水，800r/mi且被涡振荡30s，短暂离心，将上清液转移至新的10mL离心管中，2)天根生化科技(北京)有限公司生产的TIANampBacteria DNA Kit(DP30Z)试剂盒是适合的市售产品的实例。给出这一信息是为了方便本文件的使用者，并不表示对这一产品的认可。如 果其他产品具有相同的效果，那么可使用这些等效产品。5 GB/T 40458-2021 12 0Oo r飞盯/怡/0.9%NaC1 r榕容液悬浮后合并，4C保存备用。收集废弃液和废弃物高压灭菌后丢弃。若是提取鼠体内细菌，取其内脏组
17、织进行试验，无需进行B.5.1.1的处理直接进行该步骤。B.5.1.3 整只病媒生物携带细菌的收集方法取1只病媒生物或组织、置于适中的离心管中，将标本研碎成糊状。根据样本大小加入适量0.9%NaCl溶液，800r/min游涡振荡30s，短暂离心，将上清液转移至新的离心管中，12000r/min离心2min，弃上清，留沉淀。重复以上收集步骤3次，将收集的细菌沉淀物，加入500L0.9%NaCl 溶液悬浮后合并，4C保存备用。收集废弃液和废弃物高压灭菌后丢弃。B.5.2 细菌基因组DNA的提取将装有菌液的离心管12000r/min离心2min，转移上清液并高压灭菌处理。收集沉淀进行细菌DNA的提取
18、，提取方法如下:6 a)向离心管内加入180L洛菌酶洛液(20mg/mU和20L蛋白酶K榕液，用移液器吸打?昆匀;b)加入220f1L缓冲液GB，振荡15s,70 C放置10mi口，洛液应变的清亮，简短离心去除管盖和内壁的水珠;c)加入220L无水乙醇，充分振荡?昆匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心去除管盖和内壁的水珠;d)将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入到一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中),12000 r/min 离心30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中;e)向吸附柱CB臼3中加入500L缓i冲中液GD(使用前应检查是否加入无水乙醇),12 0Oo r/心3os，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中;f)向吸附柱CB3中加入700L漂洗液PW(使用前应检查是否加入元水乙醇),12000 r/min离心30s，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中;g)向吸附柱CB3中加入500L漂洗液PW，12000 r/八I收集管中;h)将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min离心2mi口，弃废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液;i)将吸附柱CB3转入一个干净的EP管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加50L纯水，室温放置5 min,12 000 r/min离心2min，离心管中收集到的即为提取出的DNA溶液。