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1、ICS 65.020.30 CCS B 41 中华人民共和国国家标准GB/T 40256-2021 牡航马尔太虫病诊断规程显微镜检查组织法Code of diagnosis for marteiliosis of oysters-Microscopic methods 2021-05-21发布2021-12-01实施国家市场监督管理总局发布国家标准化管理委员会GB/T 40256-2021 目。吕本文件按照GB/T1.1-2020(标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农
2、村部提出。本文件由全国水产标准化技术委员会CSAC/TC156)归口。本文件起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站。本文件主要起草人:自吕明、杨冰、王崇明、黄健、李清、万晓援、李晨、辛鲁生、余卫忠。I 1 范围牡蜘马尔太虫病诊断规程显微镜检查组织法GB/T 40256-2021 本文件规定了牡蜘马尔太虫病诊断规程中普遍适用的显微镜检查组织法的要求，针对主要病原折光马尔太虫CMarteiliare升-ingens)，给出了组织印片检测法和组织病理检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定。本文件适用于牡蜘感染折光马尔太虫的普查和初步诊断，以及牡蜘感染折光马
3、尔太虫的流行病学调查及诊断。其他贝类也可参照执行。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SC/T 7205.1-2007 牡蜘包纳米虫病诊断规程第1部分:组织印片的细胞学诊断法SC/T 7207.3-2007 牡蜘马尔太虫病诊断规程第3部分:透射电镜诊断法3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。DAFA:戴维森氏乙醇福尔马林乙酸固定液Cdavidsons alcohoHormalin-acetic acid fixati
4、ve)5 试剂或材料除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馆水或去离子水或相当纯度的水。5.1 苏木素。5.2 腆酸俐。5.3 饵明矶。5.4 拧朦酸。5.5 水合三氯乙眶。5.6 伊红YC水溶性)。5.7 焰红BC水溶性)。5.8 石蜡(熔点52oC54 OC):切片级。5.9 中性树胶:生物染色用。5.10 甲醇。GB/T 40256-2021 5.11 二甲苯。5.12 无水乙醇。5.13 95%乙醇。5.14甲M(37%)。5.15 冰醋酸。5.16 吉姆萨(Gimesa)染液。5.17 过滤海水:经纱网(注200目)过滤的海水。5.18 DAFA固定液:按附录A的A.1配
5、制。5.19 迈尔-班尼特苏木精(Mayer-BennettHematoxylin)染色液:按A.2配制。5.20 伊红焰红染色液:按A.3配制。5.21 85%乙醇:按A.4配制。5.22 80%乙醇:按A.5配制。5.23 75%乙醇:按A.6配制。5.24 70%乙醇:按A.7配制。5.25 50%乙醇:按A.8配制。6 仪器设备6.1 显微镜:配备高倍镜(40X)和油镜(100X)。6.2 石蜡切片机:满足4m7m厚度的石蜡连续切片要求。6.3 展片水浴锅。6.4 烘片机。6.5 恒温箱。7 样品7.1 采样对象牡蜘、扇贝和蛤等易感双壳贝类。7.2 采样数量、方法和保存运输采样数量、方
6、法和保存运输应符合SC/T7205.1-2007附录B的要求。海水温度高于17oc时为采样的最佳时期。7.3 样品的采集稚贝(附着后2mm)和幼贝(2mm30 mm)取内脏团;成贝(30mm)取胃、肠道、消化腺和闭壳肌。8 试验步骤8.1 组织即片检测法8.1.1 印片制作用解剖刀将样本剖开，用吸水纸轻轻吸去剖面过多的秸液，将剖面在载玻片上印迹，制成印片，自然2 干燥后滴加甲醇覆盖印片部分，固定5min7 mino空气干燥。8.1.2 染色8.1.2.1 将干燥的印片移人吉姆萨染液中染色，染色时间约30min。8.1.2.2 用缓慢的自来水流或洗瓶冲洗，去除多余染液。8.1.2.3 室温晾干。
7、8.1.3 封片滴加2滴中性树胶，封片。8.1.4 观察GB/T 40256-2021 用显微镜低倍镜搜索适合观察的视野，放大400或1000倍观察抱子和抱囊特征。马尔太虫胞体细胞质为嗜碱性，细胞核为嗜酸性(参见附录B)。8.2 组织病理检测法8.2.1 切片制作8.2.1.1 兑水将组织块依次浸入盛有不同浓度乙醇溶液的烧杯中，流程如下:75%乙醇oh 45 min)-85%乙醇(1 h 45 min)85%乙醇oh 45 min)-95%乙醇(45min)-95%乙醇(45min)-无水乙醇(45min)-无水乙醇(45min)。8.2.1.2 透明脱水后的组织块依次浸人盛有无水乙醇:二甲苯
8、0:1)混合液和二甲苯珞液的烧杯中，流程如下:无水乙醇:二甲苯o:1)(25 min)-二甲苯(20min)-二甲苯(20min)。8.2.1.3 浸蜡恒温箱温度调节至高于石蜡熔点，流程如下:透明后的组织块依次浸入两个盛有融化石蜡的烧杯中各80min。8.2.1.4 包埋在恒温箱(温度调节至高于石蜡熔点)中熔蜡，将熔蜡倒入包埋盒与包埋模具(也可用折叠纸盒)，用预温的慑子迅速夹取组织块，切面朝下平放在模具底部;轻轻提起模具，置于冰上使其冷却凝固。8.2.1.5 切片用蜡铲或刀片将包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，保留组织周围附着宽2mm3 mm 的石蜡。用石蜡切片机切片，厚度5m。对每个石蜡
9、包埋块至少切取两张不连续的切片。8.2.1.6 展片将切片平放于展片机或水浴锅水面上，待伸展平整后，用载玻片捞出，置于烘片机上或烘箱内，45 oC烘片2h。8.2.2 染色将切片放在玻片架上，依次浸入盛有不同溶液的烧杯中，流程如下:二甲苯(5min)二甲苯3 GB/T 40256-2021(5 min)无水乙醇(2min)无水乙醇(2min)95%乙醇(2min)95%乙醇(2min)80%乙醇(2 min)80%乙醇(2min)50%乙醇(2min)蒸馆水(2min)蒸馆水(2min)蒸馆水(2min)迈尔-班尼特苏木精染色液(5min)-缓慢流动的自来水(6min)-伊红-焰红染色液(2m
10、in)-95%乙醇cl min 20 s)-95%乙醇(2min)-无水乙醇(2min)-无水乙醇(2min)-二甲苯(2min 30 s)-二甲苯(2min 30 s)-二甲苯(2min 30 s)。8.2.3 封片滴加2滴中性树胶，封片。8.2.4 观察用显微镜低倍镜搜索不同的视野，观察组织坏死和血细胞浸润情况;放大400倍或1000倍观察抱子和抱囊特征(参见附录B)。9 结果判定9.1 组织印片检测法9.1.1 在折光马尔太虫病流行区域的易感宿主中(参见附录。，观察到发育早期(大小4m8m)和抱囊形成期(20m40m)的虫体(参见附录B)，细胞质呈蓝色或浅蓝色，细胞核呈红色(因使用商品化
11、染色产品不同，显色略有差异)，则组织印片检测结果为阳性，判定为折光马尔太虫感染。9.1.2 在其他种类宿主中，或者在折光马尔太虫病流行区域以外，组织印片检测结果为阳性，则判定为疑似折光马尔太虫感染。9.2 组织病理检测法9.2.1 在折光马尔太虫病流行区域的易感宿主中(参见附录。，在胃、肠和消化道的上皮细胞观察到发育早期(大小4m8m)的虫体;同时在消化道的上皮细胞中观察到子包子形成期(大小20m40m)虫体(参见附录B)，则组织病理检测结果为阳性，判定为折光马尔太虫感染。9.2.2 在其他种类宿主中，或者在折光马尔太虫病流行区域以外，组织病理检测结果为阳性，则判定为疑似折光马尔太虫感染。9.
12、3 疑似折光马尔太虫感染的确诊在其他种类宿主中，或者在折光马尔太虫病流行区域以外(参见附录。，组织印片检测法或组织病理检测法检测结果为阳性，PCR检测结果阳性且PCR产物序列与折光马尔太虫一致，同时按SC/T7207.3-2007透射电镜诊断法检测结果阳性，则判定为折光马尔太虫感染。4 A.1 DAFA固定液95%乙醇甲醒C37%)冰醋酸过滤海水混匀，室温密封贮存。A.2 迈尔-班尼特苏木精染色液附录A(规范性)试剂配方330 mL 220 mL 115 mL 335 mL 水(50oc 60 OC)1 000 mL 苏木素1.0 g 腆酸纳0.2 g 饵明矶90.0 g 拧棱酸1.0 g 水
13、合兰氯乙醒50.0 g 按上述顺序混合，溶解后即可使用，室温贮存。A.3 伊红-焰红染色液伊红YC水溶性)焰红B(水溶性)95%乙醇冰醋酸混匀后即可使用，室温贮存。A.4 85%z.醇95%乙醇加水定容至混匀，室温贮存。A.5 80%乙醇95%乙醇加水定容至混匀，室温贮存。1 g 0.1 g 780 mL 4 mL 850 mL 950 mL 800 mL 950 mL GB/T 40256-2021 GB/T 40256-2021 A.6 75%Z.醇95%乙醇750 mL 加水定容至950 mL 混匀，室温贮存。A.7 70%Z.醇95%乙醇700 mL 加水定容至950 mL 混匀，室温
14、贮存。A.8 50%Z.醇95%乙醇500 mL 加水定容至950 mL 混匀，室温贮存B.1 组织印片检测法附录B(资料性)显微镜检查组织法观察折光马尔太虫形态图组织印片检测法示例见图B.1。说明:单箭头表示幼体期(直径4m8m)，双箭头表示抱囊期(直径20m40m)。GB/T 40256-2021 图B.1马尔太虫感染地中海贻贝CMytilusgllo p rovincilis)消化腺B.2 组织病理检测法组织病理检测法示例见图B.2。说明:箭头表示于包子形成期马尔太虫(直径20m40m)。图B.2马尔太虫感染欧洲牡蜗COstreaedulis)消化腺7 GB/T 40256-2021 附
15、录C(资料性)牡断马尔太虫病及其病原简介牡蜘马尔太虫病也称Aber病(由Marteiliare斤1gens引起)或QX病(由悉尼马尔太虫，M.syd-neyz引起)，该病由丝足虫门(Cercozoa)无孔目(Paramyxida)马尔太虫属的原生动物感染双壳贝类引起，病变主要发生在双壳贝类的消化系统，可引起生理功能紊乱和死亡。马尔太虫早期感染发生在胃、消化管和鲤、的上皮细胞(图C.1)，发病个体表现出体征不健康、瘦弱、能量(糖原)耗竭、消化腺变色、生长停滞和死亡等一系列症状，死亡与寄生虫袍子形成相关。6.原抱子不断发育成熟，同时产抱体内生成折光颗粒(R)R 7.成熟抱子(MSp)被释放，今f之
16、二飞飞-(i).JNS 4.产泡体不断发育成熟并增殖至8个16个标引序号说明:MSp:成熟抱子(maturespore);NS:原抱体核(nucleusof sporangiosorus);NSP:产抱体核(nucleusof sporangial primordium);R:折光颗粒(refringent bodies);S:原子包体(sporangiosorus);SP:产于包体(sporangialprimordium);SpP:原抱子(sporeprimordium)。S 1.马尔太虫原抱你(S)通过消化道或鲍侵染易感宿主2.原抱体内发育出产抱体(Sp)NSP 3.产抱体经二分裂增殖图
17、C.1马尔太虫不同发育阶段及其在牡断体内分布模式图该病全年都可能会发生，给贝类养殖业造成较大经济损失。世界动物卫生组织(OIE)水生动物卫生法典(2016版)将引起该病发生的主要病原一折光马尔太虫(M.refrigens)列为需通报的贝类动物病原。折光马尔太虫分为O型和M型，其易感宿主种类广泛，包括:欧洲牡蜘(Ostreaedulis)、普罗旺斯牡蜘(0.stenti)、紫贻贝(Mytilusedulis)、地中海贻贝(M.gallorovznclis)、沟纹竹蛙(Solenmarginatus)和黑贻贝(Xenostrobussecuris)。其他马尔太虫(Marteiliaspp.)还可感
18、染智利牡蜘(0.chile川)、阿根廷牡蜘(0.uelchana)和密鳞牡蜘(0.denselamellosa)，但感染这些牡蜘的马尔太虫未被鉴定到种。在欧洲鸟尾蛤(Cerastodermaedule)、沟纹帘蛤(Ruditaesdecussatus)、菲律宾蛤GB/T 40256-2021 仔CR.hiliinarum)和美讪|牡蜘CCrassostrea virginica)等双壳贝类中，曾观察到包括成熟期在内不同发育阶段的类马尔太虫寄生虫。此外，一种挠足类小型节肢动物CParacartiagrani)也显示出对折光马尔太虫的易感性，且被认为在该寄生虫的水平传播过程中起作用。目前已知的折光
19、马尔太虫地理分布主要集中在地中海和北大西洋沿岸，包括:阿尔巴尼亚、克罗地亚、法国、希腊、意大利、摩洛哥、葡萄牙、西班牙、突尼斯和英国。受季节、养殖方式等因素的影响，折光马尔太虫的感染率变化很大，在欧洲牡蜘群体中可高达98%。牡蜘感染该寄生虫后，在夏季和秋季温度较高的季节，死亡率较高，一般在50%90%，死亡发生和寄生虫子包子形成过程密切相关。贻贝对寄生虫的敏感性比牡蜘低，死亡率达40%。有研究报道初次接触该病原的贻贝，在疫区养殖6个月后，死亡率达100%。目前我国仅有一例有关折光马尔太虫感染养殖贝类的报道，且仅为PCR扩增的阳性结果，并未引起贝类死亡。使用组织病理和PCR检测方法，已在我国养殖
20、紫贻贝中检测到马尔太虫样寄生虫，其18S rRNA基因与折光马尔太虫的基因相似度为88%。虽然目前我国尚无折光马尔太虫感染导致贝类死亡的报道，但随着近年来我国从折光马尔太虫病疫区国家进口鲜活贝类贸易活动的日益增多，该类寄生虫对我国贝类养殖业构成潜在威胁。9-NON-NO寸FHh闰。国华人民共和国家标准牡蜗马尔太虫病诊断规程显微镜检查组织法GB/T 40256-2021 中争夺中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址:WWW服务热线:400-168-00102021年5月第一 版侵权必究争夺书号155066 1-66410 版权专有G8/T 40256-2021