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1、ICS 65.020.30 CCS B 41 中华人民共和回国家标准GB/T 40253-2021 牡航小胞虫病诊断规程显微镜检查组织法Code of diagnosis for mikrocytosis of oysters-Microscopic methods 2021-05-21发布国家市场监督管理总局岳舍国家标准化管理委员会保W2021-12-01实施GB/T 40253-2021 目IJ1=1 本文件按照GB/T1.1-2020(标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共
2、和国农业农村部提出。本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。本文件起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站。本文件主要起草人:白昌明、杨冰、王崇明、黄佳、李清、万晓援、辛鲁生、李晨、余卫忠。I GB/T 40253-2021 牡师小胞虫病诊断规程显微镜检查组织法1 范围本文件规定了牡蜘小胞虫病诊断规程中普遍适用的显微镜检查组织法的要求，针对主要病原马可尼小胞虫(Mikrocytosmac走川仆，给出了组织印片检测法和组织病理检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定o本文件适用于牡蜘感染马可尼小胞虫的普查和初步诊断;以及牡蜘感染马可尼小
3、胞虫的流行病学调查和诊断;其他贝类可参照执行。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SC/T 7205.1-2007 牡蜘包纳米虫病诊断规程第1部分:组织印片的细胞学诊断法SC/T 7209.3-2007 牡蜘小胞虫病诊断规程第3部分:透射电镜诊断法3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义o4 缩略语下列缩略语适用于本文件。DAFA:戴维森氏乙醇福尔马林乙酸固定液(davidson s alcohol-formalin-acet
4、ic acid fixa tive)5 试剂或材料5.1 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馆水或去离子水或相当纯度的水。5.2 苏木素。5.3 腆酸铀。5.4 锦明矶。5.5 拧棱酸。5.6 水合三氯乙眶。5.7 伊红Y(水溶性)。5.8 焰红BC水溶性)。5.9 石蜡(熔点52oc 54 OC):切片级。5.10 中性树胶:生物染色用。5.11 甲醇。GB/T 40253-2021 5.12 二甲苯。5.13 元水乙醇。5.14 95%乙醇。5.15 甲醒(37%)。5.16 冰醋酸。5.17 吉姆萨(Gimesa)染液。5.18 过滤海水:经纱网(二三200目)过滤的海水
5、。5.19 DAFA固定液:按附录A的A.1配制。5.20 迈尔班尼特苏木精(Mayer-BennettHematoxylin)染色液:按A.2配制。5.21 伊红焰红染色液:按A.3配制。5.22 85%乙醇:按A.4配制。5.23 80%乙醇:按A.5配制。5.24 75%乙醇:按A.6配制。5.25 70%乙醇:按A.7配制o5.26 50%乙醇:按A.8配制。6 仪器设备6.1 显微镜:配备高倍镜(40X)和油镜(100X)。6.2 石蜡切片机:满足4f1.m7m厚度的石蜡连续切片要求。6.3 展片水浴锅o6.4 烘片机。6.5 恒温箱。7 样品7.1 采样对象牡虫厉、扇贝和蛤等易感双
6、壳贝类。7.2 采样数量、方法和保存运输采样数量、方法和保存运输应符合SC/T7205.1-2007附录B的要求。海水温度低于10oc时为采样的最佳时期。7.3 样晶的采集稚贝(附着后2mm)和幼贝(2mm30 mm)取内脏团;成贝(30mm)取闭壳肌和外套膜。8 试验步骤8.1 组织即片检测法8.1.1 印片制伟用解剖刀将样本剖开，用吸水纸轻轻吸去剖面过多的站液，随后将剖面在载玻片上印迹，制成印片，自然干燥后滴加甲醇覆盖印片部分，固定5min7 min。空气干燥。8.1.2 染色8.1.2.1 将干燥的印片移人吉姆萨染液中染色，染色时间约30mino 8.1.2.2 用缓慢的自来水流或洗瓶冲
7、洗，去除多余染液。8.1.2.3 室温晾干。8.1.3 封片滴加2滴中性树胶，封片。8.1.4 观察GB/T 40253-2021 用显微镜低倍镜搜索适合观察的视野，油镜下观察虫体特征。马可尼小胞虫呈卵圆形，直径2m4m(参见附录B)。8.2 组织病理检测法8.2.1 切片制作8.2.1.1 兑水将组织块依次浸人盛有不同浓度乙醇溶液的烧杯中，流程如下:75%乙醇(1h 45 min)85%乙醇(1 h 45 min)85%乙醇(1h 45 min)95%乙醇(45min)95%乙醇(45min)无水乙醇(45min)无水乙醇(45min)。8.2.1.2 透明脱水后的组织块依次浸入盛有元水乙醇
8、:二甲苯(1:1)混合液和二甲苯溶液的烧杯中，流程如下:元水乙醇:二甲苯(1:1)(25 min)二甲苯(20min)二甲苯(20min)。8.2.1.3 浸蜡恒温箱温度调节至高于石蜡熔点，流程如下:透明后的组织块依次浸人两个盛有融化石蜡的烧杯中各80min。8.2.1.4 包埋在恒温箱(温度调节至高于石蜡熔点)中熔蜡，将熔蜡倒人包埋盒与包埋模具(也可用折叠纸盒)，用预温的慑子迅速夹取组织块，切面朝下平放在模具底部;轻轻提起模具，置于冰上使其冷却凝固。8.2.1.5 切片用蜡铲或刀片将包埋块四周修平，使上下两面修成平行面，保留组织周围附着宽2mm3 mm的石蜡。用石蜡切片机切片，厚度5m。对每
9、个石蜡包埋块至少切取两张不连续的切片。8.2.1.6 展片将切片平放于展片机或水浴锅水面上，待伸展平整后，用载玻片捞出，置于烘片机上或烘箱内，450C烘片2h。8.2.2 染色将切片放在玻片架上，依次浸人盛有不同溶液的烧杯中，流程如下:二甲苯(5min)二甲苯GB/T 40253-2021(5 min)元水乙醇(2min)元水乙醇(2min)95%乙醇(2min)95%乙醇(2min)80%乙醇(2 min)80%乙醇(2min)50%乙醇(2min)蒸馆水(2min)蒸馆水(2min)蒸馆水(2min)迈尔-班尼特苏木精染色液(5min)缓慢流动的自来水(6min)伊红-焰红染色液(2min
10、)95%乙醇(1 min 20 s)95%乙醇(2min)无水乙醇(2min)无水乙醇(2min)二甲苯(2min 30 s)二甲苯(2min 30 s)三甲苯(2min 30 s)。8.2.3 封片?商加2滴中性树胶，封片。8.2.4 观察用显微镜低倍镜搜索不同的视野，油镜下放大1000倍，在泡状结缔组织和闭壳肌血细胞浸润区及其周围观察虫体特征(参见附录B)。9 结果判定9.1 组织印片检测法在油镜下观察到球形或卵圆形，直径2m4m的虫体(参见附录酌，细胞质呈蓝色或浅蓝色，细胞核皇红色(因使用商品化染色产品不同，显色略有差异)，则组织印片检测结果为阳性，判定为疑似小胞虫感染。9.2 组织病理
11、检测法9.2.1 在马可尼小胞虫病流行区域的已知易感宿主中(参见附录。，油镜下在泡状结缔组织细胞和/或肌纤维细胞细胞质中观察到球形或卵圆形、直径2m4m的胞体(参见附录凹，则组织病理检测结果为阳性，判定为马可尼小胞虫感染。9.2.2 在其他种类宿主中，或者在马可尼小胞虫病流行区域以外，组织病理检测结果为阳性，则判定为疑似马可尼小胞虫感染。9.3 疑似马可尼小胞虫感染的确诊组织印片检测法或组织病理检测法检测结果为阳性，同时原位杂交检测或按SC/T7209.3-2007 透射电镜诊断法检测结果阳性，则判定为马可尼小胞虫感染。4 A.l DAFA固定液95%乙醇甲眶(37%)冰醋酸过滤海水1昆匀，室
12、温密封贮存。A.2 迈尔-IjI尼特苏木精染色液水(50oC60 OC)苏木素腆酸纳押明矶拧朦酸附录A(规范性)试剂配方330 mL 220 mL 115 mL 335 mL 1 000 mL 1.0 g 0.2 g 90.0 g 1.0 g 水合三氯乙醒50.0 g 按上述顺序混合，溶解后即可使用，室温贮存。A.3 伊红焰红染色液伊红y(水路性)焰红B(水溶性)95%乙醇冰醋酸1昆匀后即可使用，室温贮存。A.4 85%乙醇:95%乙醇加水定容至1昆匀，室温贮存。A.5 80%乙醇;95%乙醇加水定容至1昆匀，室温贮存。1 g 0.1 g 780 mL 4 mL 850 mL 950 mL 8
13、00 mL 950 mL GB/T 40253-2021 GB/T 40253-2021 A.6 75%乙醇95%乙醇750 mL 加水定容至950 mL 混匀，室温贮存。A.7 70%乙醇95%乙醇700 mL 力0*定容至950 mL 混匀，室温贮存。A.8 50%Z:醇95%乙醇500 mL 加水定容至950 mL 1昆匀，室温贮存6 附录B(资料性)显微镜检查组织法观察马可尼小胞虫形态图B.1 组织印片检测法组织印片检测法示例见图B.l。/。Ifremer20m 说明:粗箭头示血细胞内马可尼小胞虫，细箭头示细胞外马可尼小胞虫。GB/T 40253-2021 图B.1马可尼小胞虫感染长牡
14、蜻CCrassostregigs)闭壳肌泡状结缔组织B.2 组织病理检测法组织病理检测法示例见图B.2。7 GB/T 40253-2021 说明:箭头示结缔组织细胞内马可尼小胞虫，直径2m4m。图B.2马可尼小胞虫感染长牡蜗消化腺泡状结缔组织8 附录C(资料性)牡蜗小胞虫病及其病原简介GB/T 40253-2021 牡蜘小胞虫病主要是由马可尼小胞虫(Mi走rocytosmackini)感染牡蜘等双壳贝类，引起结缔组织血细胞浸润、组织坏死，进而导致闭壳肌、外套膜等部位的泡状结缔组织产生水泡、服肿、愤殇和个体死亡的疫病。患病严重的牡蜘(2年以上成贝)外套膜具有肉眼可见的服肿和溃痛，服肿由颗粒细胞和
15、透明细胞组成，并包含有2m4m的小胞虫体。由于该病最早发现于加拿大的丹名岛(DenmanIs-land)，因此通常被称作丹名岛病(DenmanIsland Disease)。最初发现该寄生虫主要感染长牡蜘(Crsostrgigas)，随后在美国加利福尼亚州沿岸的熊本牡蜘(C.si归m)中检测到该寄生虫。20世纪60年代，位于低潮线处较大牡蜘(3年以上成贝)的死亡率可达40%左右。温度低于10oc和高盐度可以促使本病暴发。世界动物卫生组织(OIE)水生动物卫生法典(2016版)将引起该病发生的主要病原(马可尼小胞虫)列为需通报的贝类动物病原。马可尼小胞虫病主要发生在加拿大的西南海岸，其分布遍及加
16、拿大多个地区。在美国加利福尼亚和华盛顿州也发现有马可尼小胞虫感染案例;自加拿大出口到法国的欧洲牡蜘中曾检测到马可尼小胞虫。从我国黄海北部长牡!脑中检测到一种低感染率的小胞虫未定种(Mikrocytossp.);该种小胞虫序列与马可尼小胞虫的相似度为89%。虽然目前我国尚无马可尼小胞虫的感染案例，随着近年来我国从马可尼小胞虫病疫区国家进口鲜活贝类贸易活动的日益增多，该病对我国贝类养殖业构成潜在威胁。马可尼小胞虫的宿主范围非常广泛，除天然宿主外，在人工感染条件下，该寄生虫可以感染欧洲牡蜘(Ostreaed ulis)、奥林匹亚牡蜘(0.lurida O.conchahila)和美洲牡蜘(C.vir
17、ginica)等。目前已知象拔蚌(Pan。如upta)和菲律宾蛤仔(VenerulShili纠arum)对马可尼小胞虫感染具有抗性。马可尼小胞虫的生长发育主要包括三个阶段:休眠期(quiescentstage)，囊泡期(vesicularstage)和内体期(endosomalstage)。休眠期的小胞虫又称为休眠细胞(quiescentcells，QC)，主要分布于囊状结缔组织、血淋巴细胞以及闭壳肌和心肌细胞。QC有一个细胞核，核内具颗粒状染色质，胞质内有高尔基体和囊泡体(图c.l)。囊泡期的小胞虫又称为囊泡细胞(vesicularcells,VC)，仅在肌细胞内及其周边(细胞外)被观察到。
18、VC内细胞核增大为一个池腔Ccisternal cham ber)，膜结构的高尔基体消失，胞质内散布大小不等囊泡体(lv)(图C.2)。内体期小胞虫又称为内体细胞(endosomalcells,EC)，分布于血淋巴细胞内或细胞外和囊状结缔组织，但肌细胞内及周边观察不到ECoEC整体形状与QC非常相似，但VC胞质内细胞器更加多样，主要有球状厚壁体Cstb)，吻合内质网(aER)C图C.3)。GB/T 40253-2021-比例尺500nm 比例尺500nm 标引序号说明:标引序号说明:G 类高尔基体CGolgi-likecisternae);aER 吻合内质网Canastomosingendop
19、lasmic reticulum)lb 类榕酶体Clysosome-likebody);lb 类溶酶体Clysosome-likebody);lv一一囊泡体Clarge vesicles);lv 一一囊泡体Clargevesicles);n一一核(口ucleus)。n 一一核(口ucleus)。图C.1休眠期小胞虫图C.2囊泡期小胞虫比例尺500nm 标引序号说明:aER一一吻合内质网Canastomosingendoplasmic reticulum)cv 有被囊泡Ccoated vesicles);E 类内体Cendosome-likebodies);G 一一类高尔基体CGolgi-like cisternae);gm 颗粒物Cgranularmateria);lb 类恪酶体Clysosome-likebody);lv 一一囊泡体Clargevesicles);n核Cnucleus);stb 球状厚壁体Cspherical thick-walled bodies);tvs一一高尔基体样微管泡结构CGolgi-like tubulovesicular structL凹的。图C.3内体期小胞虫10