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1、ICS 65.100 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3280.1一2018病毒微生物农药棉铃虫核型多角体病毒第1部分:棉铃虫核型多角体病毒母药Virus-basedinsecticides-H elicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus(HearNPV)一Part 1:Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus technical concentrate(TK)2018-07-27发布2018-12 一01实施中中华人民共和国农业农村部发布目U吕NY/T 3280(病毒微生物农药棉铃虫核型多角体
2、病毒分为3个部分:一一第1部分:棉铃虫核型多角体病毒母药;一一第2部分:棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂;一一第3部分:棉铃虫核型多角体病毒悬浮剂。本部分为NY/T3280的第1部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。NY/T 3280.1-2018 本部分起草单位:农业农村部农药检定所、武汉中科威睿农业科技有限公司、中国科学院武汉病毒研究所。本部分主要起草人:孙修炼、王晓军、肖凤平、杨峻、类承凤、张忠信、郭明程。I NY/T 3280.1-2018 1 范围病毒微生物农药棉铃虫核型多角体病毒第1部分:棉铃虫核型多角体病毒母药本部分规定了
3、棉铃虫核型装、储运、安全和保质期。与验收以及标志、标签、包本部分适用于下列3.1 棉铃虫核型多centrate(TK)以棉铃虫核型多角还会包含伴随病毒扩增而产生3.2 病毒包涵体polyhedral inclusion b创y病毒水平传播的主要载体形式，其结构特征是病毒粒子包埋于蛋白质基质的多角体中。3.3 生测效价比potency ratio 根据药物的药理和对生物体的作用设计试验，比较样品、标准品引起的生物反应，测定药物效价或其生物学活性。3.4 菌落形成单位colony fonning units(C町)由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落。指在琼脂平板上经过
4、一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算细菌或霉菌数目的单位。1 NY/T 3280.1-2018 3.5 杂菌菌落总数number of microbial contaminants 将棉铃虫核型多角体病毒母药样品稀释后涂布在琼脂营养培养基上，所得到的微生物(真菌和细菌)菌落数之和。4 要求4.1 外观通常为灰白色或褐色均匀粉状物，无可见机械杂质，不应有结块;或者灰白色或褐色液体，存放过程中可能出现沉淀，经搅动能恢复原状，不应有结块。4.2 规范项目及指标棉铃虫核型多角体病毒母药还应符合表1的要求。表1棉铃虫核型多角体病毒母药控制项目指标项目指标病毒包涵体数量，PIB/g或PIB/mL二
5、?!100亿生测效价比(标准品LC，o/待测样品LC，o),%二主80.0杂菌菌落总数，CFU/g或CFU/mL;1.0X10 pH 5.07.5(团体)干燥减量，%王三5.0细度(通过75n标准筛)，%二?!95.05 试验方法5.1 一般规定除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液，试验用水为GB/T6682中规定的三级水。5.2 抽样按GB/T1605中固体制剂采样液体制剂采样方法进行。用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样量应不少于200gCmL)。5.3 PCR扩增及DNA测序法对病毒毒种的鉴定通过提取试样中病毒DNA作为模板，用HearNPVme53基因和db基因
6、的特异性引物进行PCR扩增反应，琼脂糖凝胶电泳检测。当PCR扩增片段大小约为0.5kb时，回收扩增片段，并克隆到T载体上，用M13通用引物对克隆后的PCR产物进行测序，将测序结果分别与棉铃虫核型多角体病毒CG4株)的me53基因和dbp基因序列进行比对分析，试样与HearNPVCG4株)的me53基因及db基因的一致性均应大于98%，即认定试样中的病毒为棉铃虫核型多角体病毒。棉铃虫核型多角体病毒有效成分描述参见附录A。棉铃虫核型多角体病毒毒种的鉴定的方法按照附录B的规定。5.4 病毒包涵体含量的测定5.4.1 方法提要称取少量的病毒试样，用定量的水稀释成水悬浮液，并稀释至适当倍数后，滴加在血球
7、计数板上在光学显微镜下计数。根据血球计数板上病毒包涵体的数量以及稀释倍数，计算出单位质量(体积)病毒的数量。5.4.2 仪器、设备分析天平:精确至0.0001go 2 微量移液器:0.1mLl mL。容量瓶:10mL。光学显微镜。血球计数板及专用盖玻片。5.4.3 测定步骤NY/T 3280.1-2018 5.4.3.1 将试样充分振荡摇匀后，准确称取一定量的试样(精确到0.0002g)置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，取此悬液稀释成适当浓度的悬浮液(最终稀释液使每小格有2个4个病毒包涵体)。计数时，将清洁干燥的血球计数板的+蜒量移液器吸取稀释后的病毒悬液，滴于盖玻片边缘，让悬液自行-团团
8、.-.自泡，充人悬液的量以不超过计数室台面与盖玻片之间的5.4.3.2 将载有及正中央5个中方格，结果。5.4.4 计算试样中棉铃式中:X1 A B 4X 106 80 5.4.5 允许差病毒包涵体5.5 生测效价比生测效价比按GB4789.2的规定5.7 pH的测定按GB/T1601的规定执行。5.8 干燥减量的测定5.8.1 仪器、设备分析天平:精确至0.001g。扁形称量瓶:直径40mm。电热干燥箱:控温范围(500C2000C)，误差+20C。干燥器。5.8.2 试验步骤个计数池选取4角均值即为计数每毫升将称量瓶在005:l:2)OC电热恒温干燥箱内烘至恒重(精确至0.001g)。称取
9、试样10.0g(精确至O.001 g)，置于预先称重的称量瓶中，放入005:l:2)OC的电热恒温干燥箱内干燥，1h后取出，在干燥器中冷却至室温，称重。3 NY/T 3280.1-2018 5.8.3 测定结果干燥减量Xz按式(2)计算。Xz二气旦X100.(2)式中:Xz一一干燥减量，单位为百分率(%);m-一一试样的质量，单位为克(g);mj一干燥后试样的质量，单位为克(g)。5.8.4 允许误差2次平行测定结果之差，应不大于0.5%，取其算术平均值作为测定结果。5.9 细度的测定按GB/T16150-1995中2.2的规定执行。6 产品的检验与验收应符合GB/T1604的规定。极限数值处
10、理采用GB/T8170中的修约值比较法。7 标志、标签、包装、储运、安全和保质期7.1 标志、标签应符合GB3796和GB20813的规定，注明低毒川防曝晒防高温等标志。7.2 包装应符合GB3796和GB20813中的有关规定。7.3 储运棉铃虫核型多角体病毒母药包装件，应在100C以下的避光环境中储运。储运过程中应有遮避装置，严防日晒和潮湿。7.4 安全在使用说明书或包装容器上，除有相应的毒性标志外，还应有毒性说明、中毒症状、解毒方法和急救措施。7.5 保质期在规定储运条件下，棉铃虫核型多角体病毒母药的质量保证期从生产日期算起为2年。2年保质期内，生测效价比和病毒包涵体数量不低于4.2中的
11、指标。4 NY/T 3280.1-2018 附录A(资料性附录)棉铃虫核型多角体病毒有效成分描述A.1 中文通用名称棉铃虫核型多角体病毒。A.2 拉丁文学名Helicover户aarmigera Nucleopolyhedrovirus，简称HearNPV。A.3 生物学分类杆状病毒科、Alpha杆状病毒属。A.4 生物学特性A.4.1 形态结构:基本毒粒为杆状，毒粒有囊膜，囊膜内含有一个杆状的核衣壳，核衣壳中含有病毒基因组。病毒颗粒被包藏在蛋白晶体内形成包涵体CPIB)。光学显微镜下观察，PIB呈强折光性的颗粒;电子显微镜下观察，PIB呈多面体形状，直径O.5m15m之间。A.4.2 分子结
12、构:杆状病毒基因组为双链、环状DNA分子。A.4.3 包涵体生物学特征:包涵体可以保护病毒颗粒，包涵体非常稳定，对细菌、热和许多化学物质包括低pH有抵抗，使其在土壤中可以存活多年。A.4.4 宿主范围及传播机理本产品系通过自然界中分离棉铃虫核型多角体病毒毒株，使其在活体宿主昆虫中扩增、分离纯化而成。该产品对棉铃虫有特效，对其他生物安全，特别对人类和家畜等脊椎动物及鸟类元害。本品低毒。病毒包涵体经害虫取食叶片进人目标害虫体内，在虫体内大量复制增殖扩散，急剧吞噬消耗虫体组织，导致害虫染病后组织细胞液化而亡，并通过死亡虫体的体液、粪便在害虫之间继续传播，形成流行性昆虫病毒病，药效持久。A.5 有效成
13、分主要存在形态棉铃虫核型多角体病毒包涵体。A.6 生物活性杀虫。A.7 溶解性不溶于水，溶于弱碱。A.8 稳定性在4.C以下可以长期保存，加工过程中处理温度不得高于60.C，在弱碱溶液、100.C以上高温条件下极快丧失生物活性。见光易丧失生物活性。5 NY/T 3280.1-2018 B.1 方法提要通过提取试样病毒特异性引物进行通用引物对克隆后列进行比对分析A B.2 十附录B(规范性附录)棉铃虫核型多角体病毒毒种的鉴定me53基因和db基因的到T载体上，用M133基因或db户基因序蛋白噩2:;)gFmU:牛描蛐启酶K蝠磊豁缰疆鬓矗牵制，圄蛋白酶K完全溶解。10%至7.2，Tris Tris
14、 7.0，定容至lTE缓冲液:TAE缓冲液应存将每翩，2锦击键搓搓每版自益.g NazEDTA.2HzO、加水至1L。6 Tris饱和苯酣(含氯仿。异戊醇。Taq酶。Taq酶缓冲液。dNTP。10XDNA上样缓冲液:10 mmol/L EDTA，50%丙三醇，0.25%澳酣蓝。琼脂糖凝胶:8g/L。澳化乙链溶液:1 g/Lo 1 kb DNA Marker。T载体。大肠杆菌DH5感受态细胞。X-Gal。IPTG。Amp抗生素。LB培养基。PCR引物:NY/T 3280.1-2018 me53基因上游引物:TGTAAAACGACGGCCAGTTCCGAGAATACATTTGAA;me53基因下游
15、引物:CAGGAAACAGCTATGACCGTAGCCGCACACCGAACA。db户基因上游引物:TGTAAAACGACGGCCAGTGCCGACAACGGAGACACTGAGT;db户基因下游引物:CAGGAAACAGCTATGACCTGAACGTGCATGTTGGGCCATG。岛但3基因上游引物:TGTAAAACGACGGCCAGT;儿但3基因下游引物:CAGGAAACAGCTATGACC。B.3 仪器设备分析天平:精确到0.0001g。微量移液器。高速离心机:最高转速10000r/min。振荡器。恒温水浴。紫外分光光度计。PCR仪。电泳仪。水平电泳槽。凝胶成像系统。生化培养箱。恒温摇床
16、。DNAMAN(6.0)软件。离心管。量筒。容量瓶。培养皿。试管。B.4 病毒DNA提取取试样1.0 g(母药)或者1mL(悬浮剂)，置于100mL离心管中，蒸馆水99.0mL，在振荡器上振荡1 mino取振荡后的混悬液300L于离心管中，再加人100L3X碱裂解液，置人3rc水浴中保持30 min。取出再加人200LTris HCl缓冲液，10000Xg离心8min，取出上清液，加人5L蛋白酶K和60LSDS，然后置人650C7j(浴中保持2h，取出冷却至室温后，加入650LTris饱和苯酣混合均匀，10000Xg离心5min，取出上清液到一个新离心管中，再加人6 50L苯酣:氯仿(1:1)
17、混合均匀，10000Xg离心5min，取出上清液到一个新离心管中，再加人650L氯仿:异戊醇(24:1)混合均匀，10000Xg离心5min，取出上清液到一个新离心管中，用紫外分光光度计测定DNA浓度，置40C备用。B.5 PCR扩增实验及琼脂糖凝胶电泳取提取的病毒DNA10 ng50 吨，加人Taq酶lL、对应的10XTaq酶缓冲液3L、dNTP2L、me53基因或者db基因上下游引物各2L(10mmol/L)，添加灭菌纯水至30L，置于PCR仪进行NY/T 3280.1-2018 PCR扩增。PCR扩增条件:940C,5 min热变性后，进行30个35个下述循环:940C 15 s,550
18、C 30 s,720C 30 s，最后再720C延伸5min。取meS3基因、dbp基因PCR扩增产物lL或者1kb DNA Marker 与DNA上样缓冲液混匀，依次点样于琼脂糖凝胶中，60V电泳至澳酣蓝带达到凝胶的另一端。电泳结束后于澳化乙链溶液中进行DNA染色5min，在凝胶成像系统中观察PCR产物。meS3基因、db基因PCR产物的大小都为0.5kb。B.6 PCR产物的T载体克隆和转化首先，PCR产物与T载体按后，均匀地涂在含有与T白色菌落，加人至5mL液送测序公司，使用取100序。用DNdb基因的B.7.1 B.7.2 CTCCAAAAGAAAAA，转化至大肠杆菌感受态细胞中。然上
19、，370C培养箱中过夜后，挑出中振荡培养过夜后，取菌产物进行DNA测)的meS3基因或ATCGCAATGA TTTACACA TAA T AACAAACTGTTCGAGT CGCTGGGCTTTCTGAATG AGTCAACGACAAGGTGGTGATCGAACCGTTGAAACCGCCTAAACTCACATACAAGATTGGC GTTCTCGTTAAAGGGGGTATGTTTCATTTTTACTTTTTCGACATGGTCAAAATGAAACGTTA CAAAAGCGTTTACGGTGAATTTTTCATGATCACAT B.8 结果分析试样与HearNPVCG4株)的meS3基因及db基
20、因的致性均应该大于98%，即认定为相同病毒。8 附录C(规范性附录)生测效价比(标准晶LCso/待测样品LCso的测定C.1 试剂或材料标准品:棉铃虫核型多角体病毒2.0 X 1011 PIB/g。试虫:棉铃虫(Heliothis armigera)初孵幼虫(孵化后12h内)。酵母粉:工业用。大豆粉:黄豆烤熟后磨碎过60目筛。大麦粉:过60目筛。酵母粉:工业用。36%乙酸溶液。苯甲酸锅。维生素C.医用。琼脂粉。NY/T 3280.1-2018 磷酸缓冲液:磷酸缓冲液(pH=7.0):称取NaCl8.0 g、NazHP04 1.44 g、KHzP04 O.24 g、KCl0.2 g溶于800mL
21、蒸馆水，用1mmol/L盐酸调节溶液的pH至7.0，最后加蒸馆水定容至1L，于冰箱中40C下保存。C.2 仪器和设备微波炉。分析天平:精确到0.1mg。电动搅拌器。振荡器。水浴锅。细胞培养板:24孔。搪瓷盘:30cmX20 cm。塑料离心管:10mL。量筒:5mL、10mL、100mL、250mL、500mL。容量瓶:50mL、100mL。注射器(元针头):50 mL。微量移液器及吸头:10L、1mL。标本缸:1L。恒温培养箱:(28士2)OC。烧杯:1L。C.3 测定步骤C.3.1 饲料配制取酵母粉24.0g、黄豆粉48.0g、维生素C3.0 g、苯甲酸铀0.84g、36%乙酸7.8mL放入
22、1L烧杯内，加200mL蒸馆水湿润备用。9 NY/T 3280.1-2018 取40.0g琼脂粉于1L烧杯中，加人400mL蒸馆水，在微波炉内加热至沸腾，使琼脂完全溶化，取出冷却至700C，倒人预先配制的混合液中，用电动搅拌器高速搅拌1min，迅速移至600C水浴锅中加盖保温备用。C.3.2 感染液的配制将待测样品摇匀后根据标识含量取适量置于10mL塑料离心管中，加磷酸缓冲液9.0mL，在振荡器上振荡1min，取该悬浮液1.0 mL于100mL容量瓶中，加磷酸缓冲液定容，制成待测样品母液(棉铃虫核型多角体病毒包涵体浓度约为2.OX 106 PIB/mL)。称取标准品10.0mgC精确至0.1m
23、g)置于10mL塑料离心管中，加磷酸缓冲液10.0mL，在振荡器上振荡1min，取该悬浮液1.0 mL于100mL容量瓶中，加磷酸缓冲液定容，制成标准品母液(棉铃虫核型多角体病毒包涵体浓度为2.0 X 106 PIB/mL)。将样品和标准品母液用水以一定的倍数等比稀释，每个样品和标准品至少各稀释5个浓度，并设清水作对照。C.3.3 饲料和感染液的混合将配好的饲料用注射器分装至24孔细胞培养板上，每孔约1mL，待饲料完全冷却后，每孔滴加病毒感染液10L，每个浓度用2块细胞培养板，轻轻转动细胞培养板，使病毒感染液在饲料表面分布均匀。C.3.4 接虫感染于260C300C室温下，将未经取食的初孵幼虫
24、连同纱布一起放人标本缸中，静待数分钟，选取爬上缸口的健康幼虫作供试虫，用毛笔轻轻地将它们移人已添加感染液和饲料的细胞培养板小孔内，每孔一头虫，用3层吸水纸盖住，然后将细胞培养板逐个叠起，用橡皮筋捆紧，置于C28士2)OC恒温培养箱内培养，168h检查并记录死亡虫数。C.3.5 检查和统计分析判断死虫的标准是以细签轻轻触动虫体，无任何反应者判为死亡。记录各浓度的死亡虫数，计算死亡率及校正死亡率CWj)。空白对照死亡率10%以下需要校正，大于10%则试验结果无效。校正死亡率Wj按式Cc.1)计算。式中:T-C Wj-一一一X100 Cc.1)1-C Wj一一校正死亡率，单位为百分率C%);T一一感
25、染液处理死亡率，单位为百分率C%);C一一空白对照死亡率，单位为百分率C%)。将感染液各浓度换算成对数值，校正死亡率转换成死亡几率值，用最小二乘法分别求出标准品LC，o值和待测样品LC，。值(可以使用DPS或者SPSS等统计软件)。C.3.6 计算待测样品的生测效价比(标准品LCso/待测样品LCSO)W2按式Cc.2)计算。W2=号X100.CC.2)式中:W2一一待测样品的生测效价比，单位为百分率C%);Y一一待测样品LC，o值;Z一一标准品LC，。值。C.3.7 允许差2次平行测定结果之差，不得超过20%。10 goN|.gNZ主中华人民共和国农业行业标准病毒微生物农药棉铃虫核型多角体病毒第1部分:棉铃虫核型多角体病毒母药NY/T 3280.1-2018 9号中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼(邮政编码:100125阿址:)北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销*导开本880rnrnX1230rnrn 1/16 印张1字数20千字2018年11月第1版2018年11月北京第1次印刷书号16109 4639 定价24.00元头争导版权专有侵权必究举报电话(010)59194261 NY/T 3280.1-2018