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1、ICS 65.100 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3280.2一2018病毒微生物农药棉铃虫核型多角体病毒第2部分:棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂Virus-basedinsecticides-Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus(HearNPV)-Part 2:H elicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus water dispersible granule(W G)2018-07-27发布2018-12-01实施中华人民共和国农业农村部发布目。自NYj T 3280(病毒微生物农药棉
2、铃虫核型多角体病毒分为3个部分:一一第1部分:棉铃虫核型多角体病毒母药;一一第2部分:棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂;一一第3部分:棉铃虫核型多角体病毒悬浮剂。本部分为NYjT3280的第2部分。本部分按照GBjT1.1一2009给出的规则起草。本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。NY/T 3280.2-2018 本部分起草单位:农业农村部农药检定所、武汉中科威睿农业科技有限公司、中国科学院武汉病毒研究所。本部分主要起草人:肖凤平、王晓军、孙修炼、郭明程、类承凤、张忠信、张楠。I NY/T 3280.2-2018 病毒微生物农药棉铃虫核型多角体病毒第2部分:棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂
3、范围本部分规定了棉铃虫核型多角标签、包装、储运、安全和保质期。本部分适用于工而成的棉铃虫核型多角2 下列文件。凡是不注日期的GB/T 1601 GB/T 1604 GB/T 1605 GB 3796 GB/T 4789 GB/T 5451 GB/T 6682 GB/T 8170 GB/T 14825 GB/T 161 GB/T 20813 GB/T 28137 GB/T 32775 3 术语和定义下列术语和定义适用3.1 棉铃虫核型多角体病毒水dispersible granule(WG)以棉铃虫核型多角体病毒包涵体与适宜的载体及分散剂经合适的工艺制作的可以在水中分散的粒剂。3.2 病毒包涵体
4、polyhedral inclusion body(Pffi)病毒水平传播的主要载体形式，其结构特征是病毒粒子包埋于蛋白质基质的多角体中。3.3 生测效价比potency ratio 根据药物的药理和对生物体的作用设计试验，比较样品、标准品引起的生物反应，测定药物效价或其生物学活性。1 NY/T 3280.2-2018 3.4 菌落形成单位colony forming units(CFU)由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落。指在琼脂平板上经过一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算细菌或霉菌数目的单位。3.5 杂菌菌落总数number of microbial
5、 contaminants 将棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂样品稀释后涂布在琼脂营养培养基上，所得到的微生物(真菌和细菌)菌落数之和。4 要求4.1 外观应为干燥的、能自由流动的灰褐色颗粒状，无可见机械杂质。4.2 规范项目及指标棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂还应符合表l的要求。表1棉铃虫核型多角体病毒水分散粒荆控制项目指标项目指标病毒包涵体数量，Pffi/g二z标不值生测效价比(标准品LCso/待测样品LCso)，%二三80杂菌菌落总数，CFU/g王三1.0X107干燥减量，%5.0 细度(通过75m试验筛)，%二?!9 5.0pH 5.07.5 悬浮率(病毒包涵体)，%二日5.0 粒径(0
6、.25 mm1.0 mm),%二?!90.0 分散性，%二三7 5.0润湿时间，s 120 持久起泡量(1mi时，mL-主三25.05 试验方法5.1 一般规定除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，所述溶液均为水溶液，试验用水为GB/T6682中规定的三级水。数值修约规则与极限数值的表示和判定符合GB/T8170的规定。5.2 抽样按GB/T1605中固体制剂采样方法进行。用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样量应不少于200 g。5.3 病毒毒种的鉴定通过提取试样中病毒DNA作为模板，用HearNPVme53基因和dbp基因的特异性引物进行PCR扩增反应，琼脂糖凝胶电泳检测。当PCR扩增片
7、段大小约为0.5kb时，回收扩增片段，并克隆到T载体上，用M13通用引物对克隆后的PCR产物进行测序，将测序结果分别与棉铃虫核型多角体病毒CG4株)的me53基因和dbp基因序列进行比对分析，试样与HearNPVCG4株)的me53基因及dbp基因的一致性均应大于98%，即认定试样中的病毒为棉铃虫核型多角体病毒。棉铃虫核型多角体病毒有效成分描述参见附录A。棉铃虫核型多角体病毒毒种的鉴定方法按照附录B的规定。5.4 病毒包涵体含量的测定5.4.1 方法提要NY/T 3280.2-2018 称取少量的病毒试样，用定量的水稀释成水悬浮液，并稀释至适当倍数后，滴加在血球计数板上，在光学显微镜下计数。根
8、据血球计数板上病毒包涵体的数量以及稀释倍数，计算出单位质量(体积)病毒的数量。5.4.2 仪器、设备分析天平:精确至0.0001g。微量移液器:0.1mLl mL。容量瓶:10mL。光学显微镜。血球计数板及专用盖玻片5.4.3 测定步骤5.4.3.1 准确称取一稀释成适当浓度的悬球计数板的计数室自行缓缓渗入，矩形边缘为宜。5.4.3.2将载及正中央5个中5.4.4 计算试样中棉铃式中:Xj A B 4X106一一-180 一一计数小5.4.5 允许差病毒包涵体含量2次5.5 生测效价比的测定生测效价比(标准品LCso/5.6 杂菌菌落数量的测定按GB/T4789.2的规定执行。5.7 干燥减量
9、的测定5.7.1 仪器、设备分析天平:精确至0.001g。扁形称量瓶:直径40mm。电热干燥箱:控温范围(500C2000C)，误差土20C。干燥器。5.7.2 试验步骤刻度，取此悬液洁干燥的血缘，让悬液片之间的.(1)3 NY/T 3280.2-2018 将称量瓶在(105士2)OC电热恒温干燥箱内烘至恒重(精确至o.001 g)。称取试样10.0 g(精确至0.001 g)，置于预先恒重的称量瓶中，将此瓶放入(105士2)OC的电热恒温干燥箱内干燥，1h后取出，在干燥器中冷却至室温，称重。5.7.3 测定结果干燥减量X2按式(2)计算。X2=气旦X100.(2)式中:Xz-一干燥减量，单位
10、为百分率(%);m一一试样的质量，单位为克(g);mj一干燥后试样的质量，单位为克(g)。5.8 细度的测定按GB/T16150-1995中湿筛法的规定执行。5.9 pH的测定按GB/T1601的规定执行。5.10 悬浮率的测定称取1.00 g试样(精确至0.0001g)，按GB/T14825的规定进行悬浮率测定。5.11 粒度范围的测定5.11.1 仪器标准筛组:0.25rnm标准筛和1.0 rnm标准筛各1个。振筛机:振幅36rnm，263次/min。天平:精度为0.1 g。5.11.2 测定步骤将标准筛上下叠装，大粒径筛置于小粒径筛上面，筛下装承接盘，同时将组装好的筛组固定在振筛机上，准
11、确称取100g(精确至0.1g)样品，置于上面筛中，加盖密封，启动振筛机振荡10min，收集小粒径筛上物称量。5.11.3 计算试样的粒度X3按(3)式计算。式中:X3=些.!.X 100 (3)m X3一一试样的粒度，单位为百分率(%);m-一试样质量，单位为克(g);mj一小粒径筛上试样质量，单位为克(g)。5.11.4 允许误差2次平行测定结果之差，应不大于0.5%，取其算术平均值作为测定结果。5.12 分散性试验按GB/T32775的规定执行。5.13 润湿时间按GB/T5451的规定执行。5.14 持久起泡量的测定按GB/T28137的规定执行。4 NY/T 3280.2-2018
12、6 产品的检验与验收应符合GB/T1604的规定。极限数值处理采用GB/T8170中的修约值比较法。7 标志、标签、包装、储运、安全和保质期7.1 标志、标签应符合GB3796中的有关规定。农药产品标签应符合GB/T20813的规定，注明低毒防曝晒防高温等标志。7.2 包装应符合GB3796和GB20813中的有关规定。7.3储运储运过程中应有遮避装置，严防日晒和潮湿。7.4 安全在使用说明书或包装容器上，除有相应的毒性标志外，还应有毒性说明、中毒症状、解毒方法和急救措施。7.5 保质期在规定储运条件下，棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂的质量保证期从生产日期算起为2年.2年保质期内，生测效价比和
13、病毒包涵体数量不低于4.2中的指标。5 NY/T 3280.2-2018 A.1 中文通用名称棉铃虫核型多角体病毒。A.2 拉丁文学名Helicovera A.4.2 A.4.3包括低pH有A.4.4宿A.5 有效成分主要存棉铃虫核型多角体病毒A.6 生物活性杀虫。A.7 溶解性不溶于水，溶于弱碱。A.8 稳定性附录A(资料性附录)棉铃虫核型多角体病毒有效成分描述。本品低毒。噬消耗虫体组，形成流行性在40C以下可以长期保存，加工过程中处理温度不得高于600C，在弱碱溶液、1000C以上高温条件下极快丧失生物活性。见光易丧失生物活性。NY/T 3280.2-2018 附录B(规范性附录)棉铃虫核
14、型多角体病毒毒种的鉴定B.1 方法提要通过提取试样病毒DNA作为模板，用棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)me53基因和db基因的特异性引物进行PCR扩增反应，琼脂糖凝胶电泳反应检测后，回收扩增片段，克隆到T载体上，用M13通用引物对克隆后的PCR产物进行测序，将测序结果与HearNPV(G4株)的me53基因或dbp基因序列进行比对分析，确定试样的病毒是否为棉铃虫核型多角体病毒。B.2 试剂和溶液碱裂解液:Na2C0331.8 g,NaCl 29.25 g,Na2EDTA.2H20 10.09 g，溶于800mL蒸馆水，最后加蒸馆水定容至1L。乙二胶四乙酸(EDTA)。冰醋酸。十二皖基硫
15、酸铀溶液(10%SD曰:100 g/Lo 蛋白酶K(20mg/mL):将200mg的蛋白酶K加入到9.5mL水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10mL，然后分装成小份储存于一20.C。10%SDS溶液:在90mL水中溶解10.0g SDS，加热至68.C助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH至7.2，加水定容至100mL，分装备用。Tris.HCl缓冲液(0.01mol/L):取Tris.HCl储存液稀释100倍。Tris.HCl储存液(1mol/U:称取121.1 g Tris碱，加入700mL双蒸水，用浓HCl调节至pH至7.0，定容至1L。TE缓冲液:0.01mm
16、ol/L Tris.HCl,l mmol/L EDTA,pH=8.0。TAE缓冲液:50X储存液，pH约8.5,242 g Tris碱、57.1mL冰醋酸、37.2g Na2EDTA 2H20、加水至1L。Tris饱和苯酷(含0.1%日-疏基乙醇)。氯仿。异戊醇。Taq酶。Taq酶缓冲液。dNTP。10XDNA上样缓冲液:10mmol/L EDTA，50%丙三醇，0.25%澳酣蓝。琼脂糖凝胶:8g/L。漠化乙键溶液:1 g/Lo 1 kb DNA Marker T载体。大肠杆菌DH5a感受态细胞。X-Gal。7 NY/T 3280.2-2018 IPTG。Amp抗生素。LB培养基。PCR引物:
17、me53基因上游引物:TGTAAAACGACGGCCAGTTCCGAGAATACATTTGAA;me53基因下游引物:CAGGAAACAGCTATGACCGTAGCCGCACACCGAACA。db基因上游引物:TGTAAAACGACGGCCAGTGCCGACAACGGAGACACTGAGT;db基因下游引物:CAGGAAACAGCTATGACCTGAACGTGCATGTTGGGCCATGoM13基因上游引物:TGTM13基因下游引物:B.3 仪器设备分析天平:精确微量移液器。高速离心机:振荡器。恒温水浴紫DN 离心管。量筒。容量瓶。培养皿。试管。水99.0mL，在振荡器上振荡,.碱裂解液，置人
18、3 7C水浴中保持30 min。取出再加人200LTris.HCl 室喃喃跚跚跚跚F霄;心8min，取出上清液，加入5L蛋白酶K和60LSDS，然后置人650C水浴中保持2h，取出冷却至室温后，加人650LTris饱和苯酣混合均匀，10000Xg离心5min，取出上清液到一个新离心管中，再加人650L苯酣:氯仿(1:1)混合均匀，10000Xg离心5min，取出上清液到一个新离心管中，再加人650L氯仿:异戊醇(24:1)混合均匀，10000Xg离心5min，取出上清液到一个新离心管中，用紫外分光光度计测定DNA浓度，置40C备用。B.5 PCR扩增实验及琼脂糖凝胶电泳取提取的病毒DNA10
19、ng50 吨，加人Taq酶1L、对应的10XTaq酶缓冲液3L、出.JTP2L、me53基因或者dbp基因上下游引物各2L(10mmol/L)，添加灭菌纯水至30L，置于PCR仪进行NY/T 3280.2-2018 PCR扩增。PCR扩增条件:940C，5min热变性后，进行30个35个下述循环:940C 15 s,550C 30 s,720C 30 s，最后再720C延伸5min。取me53基因、db基因PCR扩增产物1L或者1kb DNA Marker 与DNA上样缓冲液混匀，依次点样于琼脂糖凝胶中，60V电泳至澳酣蓝带达到凝胶的另一端。电泳结束后于澳化乙链溶液中进行DNA染色5min，在
20、凝胶成像系统中观察PCR产物。me53基因、db基因PCR产物的大小都为0.5kb。B.6 PCR产物的T载体克隆和转化首先，PCR产物与T载体按比例混合，加人连接酶混合反应后，转化至大肠杆菌感受态细胞中。然后，均匀地涂在含有与T载体相应的抗生素、IPTG、X-gal的琼脂平板上，37C培养箱中过夜后，挑出白色菌落，加入至5mL含有抗生素的液体LB培养基中。最后，370C恒温摇床中振荡培养过夜后，取菌液送测序公司，使用M13引物对其进行测序。B.7 PCR产物测序及序列比对取100L大肠杆菌DH5a用M13上游引物和M13下游引物，对克隆后的PCR产物进行DNA测序。用DNAMAN软件对所测到
21、的me53基因及db基因序列与HearNPV(G4株)的me53基因或dbp基因的DNA序列进行比对。B.7.1 HearNPV meS3基因序列ACACGTCTTGGAGCTGTGTCGTCATGGATTTATTCGAAAATATTTTCTGCCCATCAATCCCGAC CTGTATTCGGAACGTCGAGTGGACATTGTTCGTAACGAAACTTACAAAGTCAACGACATCTAC GCTACGATTCAAGATATCATATCCAACAAGAATCCGCACGAACAAATTACTAAAATATCATTT CGTACCATTGGACGAGTTTTTTTCGACGAAACAT
22、TCGAAGACATGTTTGTAGAGAAGCGCGGC ACGATCTCCGTTGTACCTGGACCGAGCAAAATGCTCGAATTTTTGTCGAAACCTTTTGATTTTA CACCAAATTTTACCTATTACTATCATGTACATGTTGCGGTCGGAAGGGAAAAACAACGCTATGT AATGTATTTGGAGATACCATGTTTGCGCTATTGTAAATTGTGCACTTTGGAAAAACAACATAAA GGCTATCCGGTGGTTTGG B.7.2 He创-NPVdbp基因序到CCAAACGTGCAAAACTAG ACAGTTCCGTTCCGAGT
23、 ACGACGTTGGCTGTCTATCGCAATGAAA ACGACAACGACGACAGCGACGAAATTGTAGAGTACGACGAATCTGACAAGATGTTGTGCATCT TTAAACCGCAAACCGAAACACGATCTATAACATGGGTGGACAAATTTACACATAATCTCCAAA AG AAAAATTTG ACGGTGCT AAGGTGTCAT ACGCCTTTT AACAAACTGTTCG AGTCGCTGGGCTT TCTGAATGAAAGCATTTCATTGGAGTCTTGGATAGACAAATTGTATCCGCAAGTCAACGACAA GGTGGTG
24、ATCGAACCGTTGAAACCGCCTAAACTCACATACAAGATTGGCGTTCTCGTTAAAGG GGGTATGTTTCATTTTTACTTTTTCGACATGGTCAAAATG AAACGTT ACAAAAGCGTTT ACGGT GAATTTTTCATGATCACAT B.8 结果分析试样与HearNPV(G4株)的me53基因及dbp基因的一致性均应该大于98%，即认定为相同病毒。9 NY/T 3280.2-2018 附录C(规范性附录)生测效价比标准品LCso/待测样品LCsol的测定C.1 试剂或材料棉铃虫核型多角体病毒标准品:2.0 X 1011 PIB/g。棉铃虫
25、CHeliothisar吨era)初孵幼虫(孵化后12h内)。酵母粉:工业用。大豆粉:黄豆烤熟后磨碎过60目筛。大麦粉:过60目筛。酵母粉:工业用。36%乙酸溶液。苯甲酸铀。维生素C.医用。琼脂粉。磷酸缓冲液:磷酸缓冲液CpH=7.0):称取NaCl8.0 g、Na2HP04 1.44 g、KH2P04 O.24 g、KCl0.2 g溶于800mL蒸馆水，用1mmol/L盐酸调节溶液的pH至7.0，最后加蒸馆水定容至1L，于冰箱中40C下保存。C.2 仪器和设备微波炉。分析天平:精确到0.1mg。电动搅拌器。振荡器。水浴锅。细胞培养板:24孔。搪瓷盘:30cmX20 cm。塑料离心管:10mL
26、。量筒:5mL、10mL、100mL、250mL、500mLo 容量瓶:50mL、100mL。注射器(无针头):50 mL。微量移液器及吸头:10L、1mL。标本缸:1L。恒温培养箱:C28+2)OC。烧杯:1L。C.3 测定步骤C.3.1 饲料配制取酵母粉24.0g、黄豆粉48.0g、维生素C3.0 g、苯甲酸铀0.84g、36%乙酸7.8mL放人1L烧杯10、NY/T 3280.2-2018 内，加200mL蒸馆水湿润备用。取40.0g琼脂粉于1L烧杯中，加人4rnL蒸馆水，在微波炉内加热至沸腾，使琼脂完全制七，取出冷却至70.C，倒人预先配制的混合液中，用电动搅拌器高速搅拌1min，迅速
27、移至60.C水浴锅中加盖保温备用。C.3.2 感染液的配制将待测样品摇匀后根据标识含量取适量置于10mL塑料离心管中，加磷酸缓冲液9.0mL，在振荡器上振荡1min，取该悬浮液1.0 mL于100mL容量瓶中，加磷酸缓冲液定容，制成待测样品母液(棉铃虫核型多角体病毒包涵体浓度约为2.OX 106 PIB/mL)。称取标准品10.0mgC精确至0.1mg)置于10mL塑料离心管中，加磷酸缓冲液10.0mL，在振荡器上振荡1min，取该悬浮液1.0 mL于100mL容量瓶中，加磷酸缓冲液定容，制成标准品母液(棉铃虫核型多角体病毒包涵体浓度为2.OX 106 PIB/mL)。将样品和标准品母液用水以
28、一定的倍数等比稀释，每个样品和标准品至少各稀释5个浓度，并设清水作对照。C.3.3 饲料和感染液的混合将配好的饲料用注射器分装至24孔细胞培养板上，每孔约1mL，待饲料完全冷却后，每孔滴加病毒感染液10L，每个浓度用2块细胞培养板，轻轻转动细胞培养板，使病毒感染液在饲料表面分布均匀。C.3.4 接虫感染于26.C30.C室温下，将未经取食的初孵幼虫连同纱布一起放人标本缸中，静待数分钟，选取爬上缸口的健康幼虫作供试虫，用毛笔轻轻地将它们移人己添加感染液和饲料的细胞培养板小孔内，每孔一头虫，用3层吸水纸盖住，然后将细胞培养板逐个叠起，用橡皮筋捆紧，置于C28+2).C恒温培养箱内培养，168h检查
29、并记录死亡虫数。C.3.5 检查和统计分析判断死虫的标准是以细签轻轻触动虫体，元任何反应者判为死亡。记录各浓度的死亡虫数，计算死亡率及校正死亡率CW1)。空白对照死亡率10%以下需要校正，大于10%则试验结果无效。校正死亡率W1按式Cc.1)计算。T-C W1=一一一一X100 Cc.1)1-C 式中:W1一一校正死亡率，单位为百分率C%);T一一感染液处理死亡率，单位为百分率C%);C一一空白对照死亡率，单位为百分率C%)。将感染液各浓度换算成对数值，校正死亡率转换成死亡几率值，用最小二乘法分别求出标准品LCso值和待测样品LCso值(可以使用DPS或者SPSS等统计软件)。C.3.6 计算
30、待测样品的生测效价比(标准品LCso/待测样品LCso)Wz按式Cc.2)计算。Wz=手X100.CC.2)式中:Wz一一一待测样品的生测效阶比，单位为百分率C%);Y一一待测样品LCso值;Z一一标准品LCso值。C.3.7 允许差2次平行测定结果之差，不得超过20%。11 FON|N.gSHFZ中华人民共和国农业行业标准病毒微生物农药棉铃虫核型多角体病毒第2部分:棉铃虫核型多角体病毒水分散粒剂NY/T 3280.2-2018 争e中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码100125网址)北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销*开本880=X1230=1/16 印张1字数20千字2018年11月第1版2018年11月北京第1次印刷书号16109 4640 定价24.00元争e争6版权专有侵权必究举报电话(010)59194261