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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3293-2012 水仙花叶病毒、水仙潜隐病毒、水仙黄条病毒的检疫鉴定方法Detection and identification of narcissus mosaic virus,narcissus latent virus and narcissus yellow stripe virus 2012-10-23发布2013-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局中华人民共和国出入境检验检疫行业标准7.1仙花叶病毒、7.1仙潜隐病毒、水仙黄条病毒的检疫鉴定方法SN/T 3293-2012 兴中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里
2、西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)64275323网Jlf:www.spc.且已 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷兴开本88012301/16 印张0.75字数17千字2013年3月第一版2013年3月第一次印刷印数1-1600 兴书号155066 2-24691 定价16.00兀SN/T 3293-2012 目。昌本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草O本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口O本标准起草单位:中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中国检验检疫科学院究院、福建农林大学。本标准主
3、要起草人:沈建国、廖富荣、张永江、林双庆、王念武、虞费、同诚、黄可辉、翁瑞泉、吴祖建。1 范围水仙花叶病毒、水仙潜隐病毒、水仙黄条病毒的检疫鉴定方法SN/T 3293-2012 本标准规定了水仙花叶病毒、水仙潜隐病毒、水仙黄条病毒检测的程序和方法O本标准适用于进出境水仙中水仙花叶病毒、水仙潜隐病毒、水仙黄条病毒的检测O2 方法原理水仙花叶病毒、水仙潜隐病毒、水仙黄条病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。二三不11病毒的分类地位、奇主也田、病害抗状、分布地厌、传播途径、粒体形态、且国主11.等参见|咐录A。3 仪器设备、用具及试剂3.1 仪器设备高速冷冻离心机、微量天平0/
4、1000 g)、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、200C低温冰箱、800C超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pHH、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭雨锅、超净工作台、晦标仪等O3.2 用具各种量和的可调哆液器(1000L、200L、100L，20.uL、10.uL,2.uL)、PCR反应仔、兀RNase离心管C1.5mL)、研钵、酶联板等O3.3 试剂酶联板捕获抗原酶联免疫吸附测定法CPlate-trappedantigen ELISA,PTA-ELISA)试剂见附录B、RT-PCR.l-剂见附录Co4 检测与鉴定4.1 PTA-ELISA 具体方法见附录B。4.2 RT-PCR 具体方法见附
5、录C。SN/T 3293-2012 5 结果判定与记录5.1 结果判定当水仙花叶病毒PTA-ELISA、RT-PCR两种检测方法的检测结果均呈阳性时，则判定为检出水仙花叶病毒。当水仙潜隐病毒PTA-ELISA、RT-PCR两种检测方法的检测结果均呈阳性时，则判定为检出水仙潜隐病毒O当水仙黄条病毒PTA-ELISA、RT-PCR两种检测方法的检测结果均呈阳性时，则判定为检出水仙黄条病毒O若任一病毒仅PTA-ELISA或RT-PCR为阳性，则需进一步采用电镜鉴定或PCR产物序列测定等方法进行鉴定。5.2 结果记录记录好各项实验数据，包括样品来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经
6、于人和实验人员的签字O血清学检测结果保留吸光值的数据报告，分子生物学检测结果保留电泳照片O6 样品的保存经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在20 oC-80 oc超低温冰箱中，并作好登记和标记工作，以备复核用。2 附录A(资料性附录)水仙花叶病毒、水仙潜隐病毒和水仙黄条病毒的背景资料.1 分类地位水仙花叶病毒:学名:Narcissus mosaic virus，缩写:NMV。分类地位:线性病毒科CFlexiviridae)、马铃薯X病毒属CPtexvirus)0 水仙潜隐、病毒:学名:N arciss us la ten t virus，缩写:NLV。分类l也(:吨铃薯Y病干年科CPotyv
7、iridae)、和桥病市)国CMaclura-uirus)0 水仙茧条病毒学名:Narcissus yellow stripe virus，缩写:NYSV。分类地位:马铃薯Y病毒科CPotyviridae)、马铃薯Y病毒属CPty-Ulru仆。.2 寄主范围SN/T 3293-2012 NMV:自然奇主主要为黄水仙CNrCISSu五户sdna口ISS);NLV:自然寄主主要包括黄水仙CNrCISSUS卢seudnarcissus)、莺尾CIris.Tihiurn)、剑兰CGladiulushybrids)、根希百合CNerine sarlensis);NYSV:自然奇主主要为水仙属CNciss
8、usspp.)。.3 病害症状NMV:侵染水仙后初期无症状或叶片上部仅有轻微的不规则褪绿小斑，但随着病情加重，病斑表现明显的花叶，并扩展为较大的斑块O发病严重时，引起叶片扭曲、黄化，植株矮小畸形，鳞茎变小，种球退化。NLV:单独侵染水仙后引起叶片顶端产生褪绿黄色条斑，与其他病毒复合侵染时导致水仙植株出现花叶、斑驳、黄化、坏死、花箭减少、香味变淡以及矮化畸形等症状ONYSV:侵染水仙后引起的典型症状为沿叶脉产生褪绿黄色条斑，系统花叶，病叶表面有凸起，花梗产生褪绿斑，病株花朵着色不均，最后导致鳞茎变小、植株矮化，直至提前枯萎。.4 分布地区NMV:主里分什T英国、荷兰、rjl国;NLV:主要分:1
9、lJ二英国、荷兰、德国、远大利、以色列、澳大利亚、中国;NYSV:主要分布于英国、荷兰、立陶宛、美国、新西兰、中国。.5 传播途径NMV:汁液接触;NLV:汁液接触、蚂虫传播;NYSV:汁液接触、期虫传播O3 SN/T 3293-2012.6 粒体形态NMV:病毒粒体为线条状，大小约550日mX 13 nm(见图A.1);NLV:病毒粒体为线状，大小约650 nm13日m(见图A.2);NYSV:病毒粒体为线条状，大小约755nm12日m(见图A.3)0 图.1NMV病毒粒体图.2NLV病毒粒体图.3NYSV病毒粒体注:图A.l图A.3引自http:/www.dpvwcb.nct。.7 病毒基
10、因组NMV:正义单链RNA病毒，全长约6955bp;NLV:正义单链RNA病毒，全长尚未见报道;NYSV:正义单链RNA病毒，全长约9650 bp。4 附录B(规范性附录)PTA-ELISA.1 试剂.1.1 包被缓冲液CpH9.6)碳酸的CNa2C03)1.59g 碳酸勾的CNaHC03)2.93 g 叠氮化呐CNaN3)0.2 g 加人蒸f留水900mL，用HCl调节pH值到9.6，然后加蒸情水至1L,4 oC储存O.1.2 磷酸盐缓冲液CPS，pH7.4)氯化饷CNaCl)磷酸二氢悍CKHzP04)8.0 g 0.2 g 磷酸氢二饷CNa2日POt)1.15 g 氧化押CKCl)0.2
11、g 叠氮化饷CNaNJ)0.2 g 加人900mL蒸榴水溶解，用NaOH或HCl调节pH值到7.4，然后加水至1Lo.1.3 PST 每升PBS中加人0.5mL的吐温200.1.4 抗体稀释缓冲液/酶标抗体稀释缓冲液三捏基氨甲皖盐酸盐CTris-HCl)13.0 g 妇111基氨基111炕CTris)2.0 g 氧化铀CNaCl)9.0 g 吐温-20CTween-20)25.0 mL 脱脂奶粉50.0 g 加入蒸馆水定容至1L,4 oC储存O.1.5 底物CpNPP)缓冲液CpH9.8)氧化伎CMgClz)叠氮化纳CNaN1)0.1 g 0.2 g 二乙醇胶HNCCH2CH.0日)2J97.
12、0mL 溶于800mL蒸悟水中，用HCl调p日值至9.8，蒸馆水定容至1L,4 oC储存。.1.6 抗体病毒抗体:水仙花叶病毒抗体、水仙潜隐病毒抗体、水仙黄条病毒抗体。酶标抗体:碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG。SN/T 3293-2012。SN/T 3293-2012 B.2 程序.2.1 样品制备称取O.5 g 1.0 g待测样品，按1:10(质量:体积)比例加入包被缓冲液，用研钵研磨成浆，8000r/min 离心5mi口，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按说明书进行OB.2.2 包被抗原加入制备好的检测样品，同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照O每个处理至少设2个重
13、复O100L/孔，37oc孵育1h或4oc冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，用PBST洗涤46次。B.2.3 加病毒抗体将病毒抗体J安说明稀释:予工作浓度，加|入到酶联板的手Lrj r,100.uL/-fL,37 oc孵育1h，倒L由自联板孔中溶液，用PBST洗涤46次。.2.4 加酶标抗体将附归i抗体按说明将稀释重1作浓度，加入到附联板的孔中，100L/孔，37oc孵自1h，倒去附联板孔中溶液，用PBST洗涤46次O.2.5 加底物将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mLC现配现用)，按100L/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育O.2.6 吸光值的测定阳性对照孔明显显色后，用酶
14、联仪于405nm处读OD直OB.3 结果判断在满足阴性对照孔的OD川值小于O.15、阳性对照孔的OD川值/阴性对照孔的OD105值大于510，孔的重复性基本一致的质量要求后，样品。D川值/阴性对照OD4115值明显大于2，判为阳性O样品。D40S值/阴性对照OD4川值在阔值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法加以验证O样品。D4115在/阴性对照OD4115ffi r川、日小于2，判为|男性O6 SN/T 3293-2012 附录C(规范性附录)RT-PCR检测方法C.1 试剂C.1.1 TrizoL裂解液OC.1.2 5XTBE缓冲浪:54.0 g Tris碱，27.5g棚酸(H3
15、B03),20 mL O.5 mol/L EDTA(pH8.0)补充蒸俯水苇1Lo用HJJrr蒸tm水稀籽罕0.5XTBE。C.1.3 6X加样缓冲液:0.25%澳盼蓝，40%(质量浓度)蔚糖水溶液OC.1.4 三氯甲烧。C.1.5 异丙醇OC.1.6 75%乙醇。C.1.7 元水乙醇。C.1.8 RT缓冲液OC.1.9 dNTPs:10 mmol/Lo C.1.10 M-MLVRT:200 U/L。C.1.11 RNasin inhibitor:40 U/Lo C.1.12 Taq DNA聚合酶。C.1.13 PCR缓冲液OC.1.14 MgC12:25 mmol/Lo C.1.15 引物:
16、RT-PCR引物见表C.1。表C.1RT-PCR的引物病毒名称引物序列水仙花叫病毒N肌1V-f:5-ACTCAGTCGCACCCGCT ATG-3 NMV-r,5-GTGCTTCAATGGCGT ACATGG-3 水仙潜隐病毒NL V-f:5-CGAACAAAGCAAGCGAACT-3 NL V-r:5-AAGATAGGGCCTCTGGTCAAC-3 水仙黄条病毒NYSV-f:5-GAAGCAAAGTGTCGCCAGTG-3 NYSV-r:5-CACGCCTAGAAGGTTGTGCAT-3 C.2 RT-PCR检测C.2.1 总RNAt是取目的条带大小退火温度1183 bp 55 c 829
17、bp 55 c 751 bp 55 c*0.1 g样品主11织胃f1iH钵rr r，加入1mL PBST缓冲液柑|磨，4oC,10 000 p;离心5min，以上洁液并将上清液迅速转移罕j(前的1.5日:lL离心忏rr r，JJrr人1mL TrizoL试剂，剧烈振荡后，空温市青5mi日;4 oC,12 000 p;离心10mi口，以上洁?夜才rr入二氧甲:民300IJJIMqk萌15s，室温静青5min,4 oC,12000,!,离心15min.ltl卜层水相;加|人等体积的异rJ，j畔，颠倒1日匀后卡汩F静置15mi口，4oC,12 000 g离-C.10 mi日，弃1沽液;加入1mL 7
18、5%的乙醇洗涤沉淀2次，何次4oC,7 500 g离心3min，弃1沽液;RNA沉淀干燥后，用20L40flL经DEPC(焦碳酸二乙酣)处理过的ddH20溶解，-20 oC保存备用ON-ON-gN的问军SN/T 3293-2012 cDNA合成在PCR管中加入2，ttL总RNA，l，ttL下游引物(表C.1中的NMV-r或NLV-r或NYSV-r),ddH20 5/lL,70 oc水浴10min，迅速冰浴5min，再加入下列试剂:5X RT缓冲液2.5/lL、dNTPs(10 mmol/U 1，IIL、M-MLVRTC200U/,IIL)0.5，IIL、RNasininhibitorC40 U
19、/IL)0.5/lL 42 oc水浴60 min,70 oc水浴10min，自然冷却至室温，-200C保存备用OC.2.2 PCR 1ft曾PCR反应体系见表C.2，每个反应设置2个市复O检测时以含有病存U标片段的质粒或含病毒材料作为阳性对照，以不含病毒的健康植物组织作为阴性对照，同时以水代替模板作为空白对照。PCR反应条件:94 oc预变性3mn，然后940C变性45日、550C退火50s、720C延伸60s，35个循环，最后一个循环结束后720C继续延伸10mi丑。C.2.3 PCR反应体系名称加样主IvLcDN八3.0 Taq DNA聚合国住(5U/,I1U 0.5 dNTPs(10 m
20、mol/U 0.5 10 X PCR缓冲液(MgI Free)2.5 25 mmol/L MgCl,2.0 上游引物(10vmol/L)1.0 卡拉子才|物(10mol/U1.0 ddH,O 14.5 总体积25.0 注:RT-PCR反山休系111各种以剂的且可根据其休情况进行适当刷整，也可采用Ihj收化的-ilJ或两JiJ法试卉u盒。表C.2琼脂糖;疑胶电泳制备1.5%的琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳，电压120V，缓冲液0.5XTBE。电泳结束后，在漠化乙链CEB，浓度为0.5/1g/mL)溶液染色10min后，再在凝胶成像系统中观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带，拍照并做记录。C.2.4 结果判断如果阴性对照和空白对照无特异性扩增，待j则样品出现与阳性对照一致的扩增条带，则判定为阳性O如果阳性对照、阴性对照和空白对照正常，待测样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，则判定为阴性。C.2.5 书号:155066 2-24691 定价:16.00元SN/T 3293-2012