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1、lCS 65.020.01 CCS B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3859-2021 果品中交链子包霉菌鉴定技术规程Technical code of practice for identification of Alternaria Nees in fruits 2021-05-07发布2021-11-01实施片中华人民共和国农业农村部发布NY/T 3859-2021 本文件rll农业农村;11利中111.1飞 Ii!Jt!lIHo本文件111仑l lU，f;1fI化技术委以会的/C/TC510)们门。本立:i+l,;0:，y位，北京农业1页-l:tfJ叫l与检测技术I
2、iIf)Io(;、叶，11科t院fj物研究所。本文刊主:l:i人，11冬柿、李IIM川、冯l出jC、T法、T.5(11!.末、羽11出车、啊，、l.果品中交链子包霉菌鉴定技术规程1 范围斗牛水飞立;立文:1才l件1牛|一占肌见lU川i川i豆二7了，鲜食J贝4札4LlA川l)彤巴态，于法(耳衍1一t法击守)。本文1HtiJl1T鲜食织品I交链仙似的的鉴定。2 规范性引用文件下列文件巾的1);)仅该日期MJ.业的版本Jli川立:11。3 3.1 CB 4789.16 C/丁6682C 19489 GB/T 2740:DNA聚介IjJJ;UJi.合成ft(I DNA J:-段以J3.2 GcnUan
3、k敖据美同|叫朱IJ?iJ技夕rJ数据库。4 防污染措施4.1 鉴定过f，l1 1约污染.NV施饺c4.2 鉴定i二tf，lI(19-:trU废弃物rrr!i?121 5 原理第一法分子生物学法NY/T 3859-2021 J-tI.ri二川JYJil1I川文fI.有的f，虫111):ii川于本迢ri的斗E似有il:rj斗的月、止时采用*;IW链式反应(PlR)扩W1tlMl中具I:;j核椭f*慕|刘1)，转录间隔1KA叶的A.2)。6.4 PCl级lliU(l!.lH，Jt八1(I(J八3),6.5 dNTPs,2.5 mmo/1.。6.6 上样级l液(见lf.f，JtA 1(I(J I飞的
4、。6.7 1、AE级 l液(!AI.附A rlr的A.5),6.8 I)NA分子lI柄而i，n以11J1tJ.lx分100-1 000 hp的I)Jn段。6.9 Tal DNA绞1l/1fi,6.10 J)拟;01附H附#粉俯I)f咆泳主6.1门1浓!J;I刽起l。6 12 元水乙醉。注除科妹nljl.本WJ!liJfI试用l均为分析纯!l化试剂，JKJ.JG I.I(T 6682规定的级点.7 设备和材料除分子生物学实A防空常规灭l油及精养设备外其他，j二要设备和材料如下a)I:j Jili冷冻肉心机.品大转速10000,./min;b)冰衍-20C.2 C-4 C,c)己|感主110.0J
5、gj d)灭的倒挝人11，)为0.2:15MPa,11;)111控范lililUJ为105 C-J 35 C,c)旋涡混匀r.，M;转i韭为2800 r/min,f)PCR扩用仪1/，1.豆范1l14C-99 C.控混有H立 士0.25C,g)ll!.J仪:韩trlfJuJ在5V-600 V，输IIf流2mA-200 mA,h)串，fj快成像仪，302nm紫外透!照仪、自llyt臼光光源、l二l光转换板、uv千涉泌光il、机梳头像捕捉软jl、佟|你分析软斗，。不锈钢小)TIJ(lI日科手术小);j)做tr(ifi州移rU?，2.51.、101.、2011.、1001.、200，1.、IIII
6、L;k)rl心管O.2 ml.(PCR，)、1.5 ml.,2 ml.,B 鉴定步骤8 1 样品采集与处理ffl不锈钢小刀土&lIfi科手术小刀切l仅*.111.病症组织约0.3g，JIj元jf泌纸l吸干水分.JII iU级研院.罕1世J二状。8.2 基因组DNA的提取8.2.1将|向吁仰俯f!脐轩后的!巾V怦扩样f.r，川IA山川川l叫圳.lll刊l0111川11刊】11门川n、-60 m刊t川n、,12 000 r/min.t 心10 mno 8.2.2 111.u，j液转入新的1.5 ml.尚心竹1，川l人呼f;t;f)(的式;，l(I jI如:外J儿自;(ilt干干甘HIIJ.足10m
7、in.12 000 r/min离心10min.可(丝一次。8.2.3 111.I.i，j液转入:TMI1.5 m 1.Ik心，1，JII入2衍体在HI(J);7K乙iWi屁匀，-20C下放且不少r1 h,1 0(.12 000 r/min;t心10mino 8 2.4 N I.i，液岭70%乙IW说:谅。NA沉淀2次.8.2.5，然千;除后院!二50Vl.北j:ii水或IrisEDT八级冲向UI;I1U快板DN八，一20C冰箱XJF备川。注却l叫封1DNA也Ilf f1!川商品化的DNA捉JI;，.(iiIP.:挺Jr.JH材架内参照试剂众说Iljl.8.3 PCR反应2 8.3.1 引物序列
8、正1句11物门51，5TCCG-I八GGTG八ACCTGCCG:l;反In71物l丁S4，STCCTC;CTIA门、(;ATATGl:iI。8.3.2 反应体系NY/1 3859-2021 在PCRWI分别1m人以下试ifiJ)币进行PCR反应，2/1.(约200ng)fI板DNA.511.PCR mli主-4 11.dNTPs.1 11.寻|物门51(10 111101/L).1 11.寻|物l丁S4(1011101/U平n1.25 U丁叫DNA聚合同1.尤i泪水平|、j丘吉巨5011.0;在:阳、11反附体系的配制也可使川附tlh化的PCJ反向试巾L.JHii!竹参!(!试Jll众说rvJ
9、.8 3.3 反应程序94 c变itmin.94 oC变nO s、550C退火30s;f11 72 oc延伸Imin.共35个循环.1，i盯72oC延115 min。8.3.4 产物检测用TAI三级IijJiJ衍1.5%JklH吁栅凝胶(55oC 60 o C 11.J)m入核能i染料)0 11)(5 11.PCI扩用产物.与1 11.上样缓冲i!M刊号合.ill行l，样.I,;J 11.1 HJ DN A分子盐标lfI做参照。v/cm5 V/cm 啊Jrr包泳，也泳20 min.1O l1lin。将抱Jj.tj(脂粉凝胶ivf于凝胶成像仪观苦!i-1/币，根据DNA分子-fTt标IfNicl
10、旷t罚条，m;小JH白iH且.(.见|￥11 0 t，J;)I/i号说91750 500 M 一一-口N八分于t，U;j，Ifr，-1刑ft样tillp飞、阳怕;(.tJ!nN四IttM!.hp 图1PCR产物检测结果电泳图如果1ln对!ff;f;:1:JAl扩i曾片段.衍检样:1，11现与问|们对!ff;fll阿大小的扩Jl:):段.对待检杆川巾的JrmJI段ill行j-f:1ll!lJ-E，将测Fr-获得的JY如l与GenHa nk数据!啦1的相应序列进行比对分析。8.4 PCR反应体系对照的设置进行PCR检视rJ11-.反应体系础设lY阴性别!自和阴性对照。问1l1对!自川交链于4j;菌
11、阳性样品挺似的l】NA作为校根.1归tl，x.j!(IjI用无W，iA作为秘极。8.5 ITS序列比对IT51/ITS1扩增仰豆rJ大小约1-15701峭的片段，测!于纣织与Cenl如n k数据j平1AII的川riaspp.IW树;相应序列比;10.2 70%乙廓。10.3 1%次iAn左侧溶液。注除将殊lYJ州中川11 仪器设备除微叶卡物实二1日日)b)c)d)c)f)g)12 12 1 12 1.1 12 1.2 12 1.3 72h 12 1.4 法拔利12.1.5 122 制片及镜检按(;II 4789.16中的利I12.3 交链抱霉菌形态特征1 i 1 ff;养约1l摘部形成后.fl
12、依此下踹养5d7 do 凶生土纠H王.分|剧。分.1.j包子缸，通常比1f:i丝祖1T(lj包隙，直直lyl1或I&Jiti大多小分枝，较短。分I二袍子里链.1:或Jyl生.谈褐包至深汹色.)此不一.典型J.Jj刘书V、卵)、但l梨形、椭圆形TIX近因中U.有纵拙l隔膜，liml饨网，顶揣延-:1戊l歇状，袍子形态及大小平斗异(见|咐求已)。12.4 结果判定贞的形态中i=111与12.:l相同1.百TIJ定样，11111存在交能拖得f.ii0 12.5 样品保存与处理斗在定确定别斗1;链柿子包得l的样品应仇l存于4oc冰箱1.以备复核，保存WJi芮废弃前1，:jJk灭:W处理。4 NY/1
13、3859-2021 A 1 DNA提取溶液附录A(规范性)主要试剂和PDA的配制2%1六炕拱-.1基以化做(CTAI:l).J.4 mmol/L;.(化例(NaCIJ.100 mmol/L:=:渔叩A氨基叩炕盐商量(Tris-HCI),20 mmol/L乙二版凶乙酸二俐(EDTA-Na，),pl-l 8.0，侦川前)JII入0.1%(休lH浓度)(1甘-:r;tl基乙醉。A.2 Tris-EDTA缓冲液10 mmol/I.Tris-I-ICI.l mmol/L乙二版li!I乙酸(EDTA),pH 8.0。A.3 PCR缓冲液(10 x)100 mmol/L丁ris-HCI(pH8.3),500
14、 mmoI/L;Jl化书I(It稀粹50flio A.6(DA JI 200 g马怜薯，洗净去&切碎，)111900 mL水，煮沸10min-20 mn，纱布过iJB.f句)11120 g 11ii萄秘币l20 g J);OJ片，m热融化至充分惰fWU0分装人:=:.ifJ肌，121C灭r.f，j20 min,4 C或室11，til1备用。将j占用的:=:frJ!阪装PDAJO热融化，摇生J);气经无l:f，j操作将陆养J;导入兀W，j!古养IIII.I(J!，I皮约2mm).itt!lI f f(ij上冷却JUfl成PI)八平板。为防LUIII的污染，可在培养基内)111人链:;:if，;(40Vg/mL).p d NY/1 3859-2021 附录H(资料性)交链抱霉菌镜检下的形态特征图交链包1:jIf锐检下的形态牛Hl!A.1每IB.I 0 f)10阳图11.1交链抱霉菌镜检下的形态特征图(引自GB4789.16)FNON-白的凹回汩Z 持印怅o.75 千敛15千千2021年10月It J;那11j.、IIlWj*2021句，10月如1J:!i I,J.;.,16109,8716 民将开本880mmX1230mll1 1/16 定价24.00元版权专有侵权必究举报电话(010)59194261 NY/T 3859