《SN∕T 3064.4-2011 国境口岸蝇类、蜚蠊携带重要病原体检测方法 第4部分：致泻性大肠杆菌(出入境检验检疫).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SN∕T 3064.4-2011 国境口岸蝇类、蜚蠊携带重要病原体检测方法 第4部分：致泻性大肠杆菌(出入境检验检疫).pdf（14页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、书书书?中华人民共和国出入境检验检疫行业标准?国境口岸蝇类?蜚蠊携带重要病原体检测方法第?部分?致泻性大肠杆菌?发布?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前?言?国境口岸蝇类?蜚蠊携带重要病原体检测方法?分为?部分?第?部分?通用要求?第?部分?沙门氏菌?第?部分?志贺氏菌?第?部分?致泻性大肠杆菌?第?部分?普通变形杆菌和奇异变形杆菌?第?部分?霍乱弧菌?第?部分?副溶血性弧菌?第?部分?金黄色葡萄球菌?第?部分?蜡样芽孢杆菌?第?部分?甲型肝炎病毒?第?部分?寄生虫卵?包囊?本部分为?的第?部分?本部分按照?给出的规则起草?本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口?本
2、部分起草单位?中华人民共和国天津出入境检验检疫局?本部分主要起草人?刘培?曲鹏?苏毅?高旗利?关淳?张霞?张海滨?国境口岸蝇类?蜚蠊携带重要病原体检测方法第?部分?致泻性大肠杆菌?范围?的本部分规定了国境口岸输入性蝇类和蜚蠊携带致泻性大肠杆菌的检测方法?结果判断?结果报告?阳性结果处置及血清学分型?本部分适用于检验检疫机构对输入性蝇类和蜚蠊携带致泻性大肠杆菌的检测和报告?规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的?凡是注日期的引用文件?仅注日期的版本适用于本文件?凡是不注日期的引用文件?其最新版本?包括所有的修改单?适用于本文件?感染性腹泻诊断标准?细菌分析手册?第?章?致泻性大肠埃希
3、氏菌?术语?定义与缩略语?下列术语和定义适用于本文件?致泻性大肠埃希氏菌?可引起人类腹泻的大肠埃希氏菌?下列缩略语适用于本文件?肠出血性大肠埃希菌?肠毒素性大肠埃希菌?肠致病性大肠埃希菌?肠侵袭性大肠埃希菌?肠凝集性大肠埃希菌?包括靛基质试验?试验?甲基红试验?和柠檬酸试验?个试验?不耐热肠毒素?耐热肠毒素基因?基因?不耐热肠毒素基因?基因?耐热肠毒素基因?聚集性黏附?局部化黏附?黏附和脱落损伤?样本检测?设备和材料?滤器?细胞培养板?孔?仪?电泳仪?乳鼠?日龄?日龄?豚鼠?培养基和试剂需要的培养基和试剂为蛋白胨磷酸盐肉汤?伊红美蓝琼脂?麦康凯琼脂?平板计数琼脂?三糖铁琼脂?胰蛋白胨肉汤?糖发
4、酵管溴酚蓝肉汤?尿素肉汤?肉汤?靛基质试剂?柯塞尔氏柠檬酸盐肉汤?月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤?增菌肉汤?亚碲酸盐头孢克肟山梨醇麦康凯?琼脂?胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂?胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂?氏产毒肉汤?肉汤?培养?培养基?胰蛋白胨大豆肉汤?柯氏试剂?试剂?甲基红溶液?迈格吉?具体成分及制备方法见?细菌分析手册?第?章?致泻性大肠埃希氏菌?另外?还需?溶液?伊文思蓝溶液?质量浓度?甲醛?马血清和胎牛血清?庆大霉素?诊断血清?小鼠肾上腺皮质细胞?细胞?喉表皮样癌细胞?细胞?缓冲液?和?热启动聚合酶?引物和无?酶水?试剂除另有规定外?所用试剂均为分析纯?水为蒸馏水?检测程序致泻性大肠杆菌检测程序参见附录
5、?操作步骤?增菌和分离?不包括?分别取?样本处理液加入到?肉汤增菌液中?将?肉汤增菌液于?下?培养?培养结束后划线?平板和?平板?培养?典型乳糖发酵菌落在?平板上为黑色中心?扁平?有或没有金属光泽的菌落?在?平板上为砖红色菌落?乳糖非发酵菌落在两种培养基上分别为不产生颜色和淡粉红色菌落?应注意的是?不发酵乳糖?有些?菌株也不发酵乳糖?因此?不仅要挑选典型菌落?还要挑选乳糖非发酵菌落进行进一步鉴定?革兰氏染色与镜检选取革兰氏阴性?无芽孢短杆菌的培养物进行生化鉴定?生化鉴定?概述将选取的菌落接种?斜面?培养?用该纯培养物进行大肠埃希氏菌生化鉴定?也可采用?或?进行鉴定?靛基质试验接种?管胰蛋白胨肉
6、汤?培养?培养后加入?柯氏试剂?上层形成红色环为阳性反应?形成靛基质?黄色环为阴性反应?试验接种?肉汤?培养?取?加入试管?再加入?萘酚溶液和?氢氧化钾溶液后振荡?加入少许肌氨酸晶体?振荡后静置?加入?试剂?出现红粉色为阳性?试验取?肉汤培养物?加入试管?向管中加入?滴甲基红溶液?红色为阳性反应?黄色为阴性反应?柠檬酸试验缓慢地接种柯氏柠檬酸肉汤?避免出现可见混浊?培养?产生明显混浊为阳性?乳糖发酵接种?肉汤?培养?产气或轻轻摇动后出现气泡为阳性?结果为?生物?型?或?生物?型?为大肠埃希氏菌?对不产气?乳糖发酵迟缓或不发酵菌株应进行扩大生化试验进行确认?扩大生化试验将疑似菌株转种?琼脂?阿拉
7、伯糖肉汤?尿素酶肉汤和?培养基?培养?试验于?后观察?如未变黄?延长培养到?大肠埃希氏菌为?阴性?尿素酶阴性?发酵阿拉伯糖和?阳性?检测?概述可以用?细胞检测不耐热肠毒素?或用?方法检测不耐热肠毒素基因?用乳鼠灌胃试验检测耐热性肠毒素?或用?方法检测耐热肠毒素基因?细胞检测?可用?培养瓶?在补充了?马血清?胎牛血清和?庆大霉素的?培养液中培养?细胞?需要?形成细胞单层?从?斜面上挑取纯培养物?接种胰蛋白胨肉汤?过夜培养?取?培养物接种于?肉汤?摇菌过夜培养?然后?离心?取上清液用于检测?吸去细胞单层上的培养液?加入?细胞培养液和?上清的混合液于细胞单层上?培养?后?在倒置显微镜下观察细胞的形态
8、学变化?细胞变圆为阳性反应?用已知的阳性和阴性细菌做对照?具体操作见?细菌分析手册?第?章?致泻性大肠埃希氏菌?乳鼠灌胃试验检测?将被检菌株接种于?产毒肉汤内?于?培养?离心?取上清液经滤器过滤?加热?每毫升滤液内加入?伊文思蓝溶液?将此滤液用塑料小管注入?龄的乳鼠胃内?同时接种?只?只?禁食?后用三氯甲烷麻醉?取出全部肠管?称量肠管?包括积液?重量及剩余的体重?肠管重量与剩余体重之比大于?为阳性?具体操作见?细菌分析手册?第?章?致泻性大肠埃希氏菌?同时检测?基因和?基因引物对分别为?和?扩增片段分别为?和?序列如下?反应体积为?缓冲液?酶?模板?引物?和?各?引物?和?各?补足无?酶水至?
9、同时设阴性?阳性及空白对照?反应程序?预变性?变性?退火?延伸?共?个循环?最后一个循环?延伸?电泳及结果判断?产物在?琼脂糖上电泳?紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度 为?和?或?判 为?基 因 和?或?基 因 阳 性?鉴 定 为?具 体 操 作见?检测?概述如果分离物怀疑是?应用?试验检测分离物的侵袭力?也可用?方法检测侵袭基因?豚鼠角膜结膜炎试验?试验?向健康豚鼠眼结膜囊内接种待试菌悬液?滴?后观察结果?可产生典型的角膜结膜炎症状为?试验阳性?方法检测侵袭基因?检测?基因?引物对为?扩增片段长度为?序列如下?反应体积为?缓冲液?酶?模板?引物?和?各?补足无?酶水至?同时设
10、阴性?阳性及空白对照?反应程序?预变性?变性?退火?延伸?共?个循?环?最后一个循环?延伸?电泳及结果判断?产物在?琼脂糖上电泳?紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度为?判为阳性?鉴定为?具体操作见?检测?概述采用细胞黏附试验或?技术检测特异性基因?细胞粘附试验可用?孔细胞培养板?在补充了?胎牛血清?培养液中培养新鲜的?细胞?于?二氧化碳条件下?培养至细胞生长达?将大肠埃希氏菌接种到?肉汤?培养过夜?吸出?孔板中培养液?然后取?增菌液于细胞单层上?再加?细胞培养液?感作?单层细胞用?洗涤后?甲醛固定?再用迈格吉染色方法染色?参见附录?显微镜下观察?阳性结果可见到在?细胞表面呈?形式
11、黏附?检测特异基因?检测?基因?引物对为?扩增片段长度为?序列如下?反应体积为?缓冲液?酶?模板?引物?和?各?补足无?酶水至?同时设阴性?阳性及空白对照?反应程序?预变性?变性?退火?延伸?共?个循环?最后一个循环?延伸?电泳及结果判断?产物在?琼脂糖上电泳?紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度为?判为阳性?鉴定为?具体操作见?检测?概述采用细胞黏附试验或?技木检测特异性基因?细胞粘附试验?使细胞呈?和?病变?检测特异基因?检测?基因?引物对为?扩增片段长度为?序列如下?反应体积为?缓冲液?酶?模板?引物?和?各?补足无?酶水至?同时设阴性?阳性及空白对照?反应程序?预变性?变性
12、?退火?延伸?共?个循?环?最后一个循环?延伸?电泳及结果判断?产物在?琼脂糖上电泳?紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度为?判为?基因阳性?鉴定为?具体操作见?检测?增菌和分离取?样本处理液加入到?中?培养?挑取一接种环培养物划线接种?平板?培养过夜?典型菌落为直径?无色透明或者带有淡灰色中心?挑取?个典型菌落接种?平板?过夜纯培养?的筛选靛基质试验?呈现靛基质阳性?和?转种?和?平板?培养过夜?在?上典型菌落表现为有或无金属光泽黑色中心的菌落?在长波紫外灯下观察?平板?菌落无荧光?的确认将上面的疑似菌落进行以下试验?以确认分离株为大肠埃希氏菌?应用?抗血清检测是否存在?抗原?注
13、意?同时应用?血清检测?如果?阴性?运用下述?和?检测方法确认?应用?或?鉴定?上的分离株为大肠埃希氏菌?如果鉴定为?阳性?并为大肠埃希氏菌?可应用?方法检测?和?特异性基因的方法鉴定?引物序列见表?表?扩增的引物与目的基因引物名称引 物 序 列目的基因片段大小?检测特异基因?抗原特异性基因检测?反应体积为?缓冲液?酶?模板?引物各?补足无?酶水至?同时设阴性?阳性及空白对照?反应程序?预变性?变性?退火?延伸?共?个循环?最后一个循环?延伸?电泳及结果判断?产物在?琼脂糖上电泳?紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度为?判为?抗原特异性基因阳性?鞭毛抗原?特异基因检测?反应体积为?
14、缓冲液?酶?模板?引物各?补足无?酶水至?同时设阴性?阳性及空白对照?反应程序?预变性?变性?退火?延伸?共?个循环?最后一个循环?延伸?电泳及结果判断?产物在?琼脂糖上电泳?紫外透射仪或凝胶成像系统中观察到扩增目的片段长度为?判为鞭毛抗原?特异性基因阳性?结果报告综合生化试验?血清学试验?肠毒素试验?侵袭性试验?细胞黏附试验?基因方法等结果?依照如下做出相应报告?当在选择培养基上无生长?或者分离菌鉴定非大肠埃希氏菌时?报告未检出致泻性大肠埃希氏菌?否则?参照以下条款进行报告?当?和?或?为阳性?或?结果为?基因和?或?基因阳性?报告该批样本中检出?当?试验阳性或?检测侵袭基因结果为阳性时报告
15、该批样本中检出?当细胞黏附试验呈?或?检测特异性基因结果为阳性时报告该批样本中检出?当细胞黏附试验呈?和?病变?或?检测?基因为阳性时报告该批样本中检出?当大肠埃希氏菌?检测结果为阳性?报告该批样本中检出大肠埃希氏菌?根据需要?参见表?进行血清学分型?报告检出何种血清型的致泻性大肠埃希氏菌?阳性结果处置判断为阳性结果的分离株应由有资质的相关实验室确认?阳性结果确认后应及时上报主管部门?附?录?资料性附录?检测程序图图?致泻性大肠埃希氏菌检测程序图?15只20只蝇或小镰或3只5只大蝶为一组，用0.5%吐温80的生理盐水处理1 mL样品加入100mL TP 1 mL样品加入100mL EEB 革兰
16、氏染色APl或VITEK和PCR附?录?资料性附录?迈 格 吉 染 色 方 法?自然干燥的细胞涂片?预先滴加甲醇固定更好?水平置于染色架上?将溶液?蒸馏水?倍?倍稀释?滴盖涂片上?倒弃涂片上的溶液?自来水漂洗干净?立即滴上溶液?蒸馏水?倍?倍稀释?在涂片上染色?倒弃涂片上的溶液?液?自来水漂洗干净?趁湿加盖玻片或待干后镜检?染色结果?染色将细胞核染成紫红色?细胞质和核仁染成蓝紫色?附?录?资料性附录?致泻性大肠埃希氏菌所包括的?抗原群及相关?抗原表?致泻性大肠埃希氏菌所包括的?抗原群及相关?抗原类?别?血清群相关?抗原?表?续?类?别?血清群相关?抗原?传统方法不能对?抗原分型?书书书?中华人民共和国出入境检验检疫行?业?标?准国境口岸蝇类?蜚蠊携带重要病原体检测方法第?部分?致泻性大肠杆菌?中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街?号邮政编码?网址?电话?中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷?开本?印张?字数?千字?年?月第一版?年?月第一次印刷印数?书号?定价?元