《SN∕T 3311-2012 国境口岸甲型H1N1(2009)流感病毒的荧光定量PCR检测方法(出入境检验检疫).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SN∕T 3311-2012 国境口岸甲型H1N1(2009)流感病毒的荧光定量PCR检测方法(出入境检验检疫).pdf（8页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、书书书?中华人民共和国出入境检验检疫行业标准?国境口岸甲型?流感病毒的荧光定量?检测方法?发布?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书?中华人民共和国出入境检验检疫行?业?标?准国境口岸甲型?流感病毒的荧光定量?检测方法?中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲?号?北京市西城区三里河北街?号?总编室?网址?中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷?开本?印张?字数?千字?年?月第一版?年?月第一次印刷印数?书号?定价?元书书书前?言?本标准按照?给出的规则起草?本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口?本标准起草单位?中国检验检疫科学研究院?本标准主要起草人?胡孔
2、新?杨鹏飞?孙肖红?燕清丽?姚李四?杨宇?张丽萍?国境口岸甲型?流感病毒的荧光定量?检测方法?范围本标准规定了国境口岸发现的具有发热或上呼吸道感染等疑似感染症状人员中甲型?流感病毒检测的生物安全要求?样品采集?运输和保存?样品处理?核酸提取及快速检测方法?本标准适用于对国境口岸疑似感染人员携带甲型?流感病毒的检测?规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的?凡是注日期的引用文件?仅注日期的版本适用于本文件?凡是不注日期的引用文件?其最新版本?包括所有的修改单?适用于本文件?实验室?生物安全通用要求?微生物和生物医学实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌?毒?种或样本运输
3、管理规定?中华人民共和国卫生部令第?号?术语和定义下列术语和定义适用于本文件?甲型?流感病毒?一种于?年?月从墨西哥和美国病人体内分离得到新型病毒?该病毒属于正粘病毒科?流感病毒属?型流感病毒?从基因组成来看?该病毒的基因组分来源于北美猪流感病毒?北美禽流感病毒?人类甲型流感?亚型病毒和常见于亚洲欧洲的猪流感病毒?对于命名各国说法不一?该病毒爆发初期?常被称作猪流感?另还有猪源流感?人类猪?型?流感?墨西哥流感?北美流感?新型流感?新流感?以及?年?流感?年?月?日世界卫生组织将该病毒改称为甲型?流感病毒?本标准中将该病毒称为甲型?流感病毒?检测对象国境口岸发现的具有发热或上呼吸道感染等疑似感
4、染症状人员?实验室生物安全要求?检测工作中的个人防护参照?实验室应遵循?和?对生物安全?级?实验室的生物安全要求?使用过的实验用品应遵照?对废弃物的处理要求进行无害化处理?仪器设备与试剂?仪器设备需要以下仪器设备?超净工作台?二级生物安全柜?微型混合器?涡旋振荡器?超低温冰箱?高速台式冷冻离心机?可调式微量加样器?荧光?检测仪?如?型等?试剂拭子病毒保存液?的?液或?平衡盐溶液?并含?牛血清白蛋白?万古霉素?阿 米 卡 星?和 制 霉 菌 素?商 品 化 系 统 如?样品采集?保存与转运?样品采集将灭菌棉棒插入鼻腔中?摩擦鼻甲数次?采集粘膜表皮获得鼻拭子?将灭菌棉从口腔完全插入咽喉中?以咽后壁
5、?上颚扁桃体的发红部位为中心?摩擦数次?采集粘膜表皮获得咽拭子?采集时?要注意不要触碰到唾液?将棉棒头部浸入?采集液中?折断尾部弃去?对采集的样本进行编号登记?样品的保存采集的新鲜的鼻?咽?拭子标本应保存在?条件下?内运送至实验室?未能?内送至实验室的?应置?或以下保存?样品转运疑似人感染甲型?流感病毒感染材料的包装及转运应符合?可感染人类的高致病性病原微生物菌?毒?种或样本运输管理规定?国境口岸甲型?流感病毒的荧光定量?检测方法?甲型?流感病毒的核酸提取?核酸的提取采用天根生化科技有限公司?病毒?提取试剂盒?进行或其他等效核酸提取方法?以下给出所提供试剂盒具体操作步骤案例?实际操作时按说明书
6、进行?由指定单位提供?给出这一信息是为了方便本标准的使用者?并不表示对该产品的认可?如果其他等效产品具有相同的效果?则可使用这些等效产品?将采集的样本平衡至室温?用移液器吸取?无核酸酶的水加入到?的?中?使?彻底溶解?得到终浓度为?的?水溶液?根据样本的数量?先吸取裂解液?再吸取?水溶液?将两者进行充分混匀?每管分装?剩余?水溶液应及时分装到无核酸酶的离心管中?保存?避免反复冻融?向每管?裂解缓冲液中加入?的含咽拭子的采集液?混匀后旋振荡?在室温下静置?后?短暂离心?加入?的无水乙醇?并涡旋振荡?短暂离心后?吸取离心管中的?混合液?包括?裂解缓冲液?含咽拭子的采集液及无水乙醇?转移到带有离心管
7、的吸附柱内?以?离心?弃掉废液?将吸附柱放回收集管?将剩余的?混合液转移至带有离心管的吸附柱内?以?离心?弃掉废液?将吸附柱放回收集管并向吸附柱内加入缓冲液?使用前检查是否已加入无水乙醇?盖上盖子?离心?弃掉废液?将吸附柱放回收集管并向吸附柱内加入漂洗液?使用前检查是否已加入无水乙醇?离心?弃掉废液?将吸附柱放回收集管?离心?弃掉废液?将吸附柱放置在一支无核酸酶的离心管上?并向离心柱内加入?的无核酸酶的水?室温静置?以?离心?弃掉吸附柱?离心管内的液体即为病毒的核酸水溶液?做好标记?保存待用?甲型?流感病毒的荧光?检测?待?试剂盒?的各组分充分融化后?请先将各试剂进行离心?然后开始实验?对于等
8、效的试剂盒中一步法或两步法进行的荧光定量?时?应根据实际情况进行适当的体系优化后再进行检测?荧光?反应体系配制按表?中的顺序?依次加入?表?甲型?流感病毒核酸实时荧光?检测反应体系名称体积?缓冲液?甲型?流感病毒上游引物?由指定单位提供?给出这一信息是为了方便本标准的使用者?并不表示对该产品的认可?如果其他等效产品具有相同的效果?则可使用这些等效产品?表?续?名称体积甲型?流感病毒下游引物?甲型?流感病毒探针?总体系?注?探针引物以甲型?流感病毒的血凝素基因基础设计的?上游引物?下游引物?探针?上述分装好的?反应管中分别加入?模板?首先加入阴性对照?然后分别加标本?最后加入阳性对照?构建的甲型
9、?流感病毒重组质粒的转录?荧光?反应?将加好样的?反应管分别转移到荧光定量?检测仪上进行扩增反应?程序设置为以?型全自动荧光定量?检测仪为例说明?将荧光信号设置为?对于其他型号的荧光定量?仪应按实际机型进行反应程序设置?没有?荧光通道的荧光定量?仪?不进行?的设置?荧光?扩增程序按照表?中的程序进行设置?反应总体积为?表?甲型?流感病毒核酸实时荧光?的反应程序步骤反应温度时间是否采集荧光信号循环数逆转录变性预扩增扩增及荧光收集?否是?结果判定?阴性对照?值应显示?阳性对照?值?并有明显的扩增曲线?否则此次检测结果无效?需重做?在阴性对照和阳性对照都成立的情况下?检测样品的?值?具有明显的扩增曲线?结果有效?可直接报告甲型?流感病毒核酸检测阳性?检测样品?值?需进行一次重复实验?若?值仍介于?和?之间?且曲线有明显的指数增长特性?可报告甲型?流感病毒核酸检测阳性?否则报告甲型?流感病毒核酸检测阴性?