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1、ICS 65.020.30 B 41:才叫中华人民共和国水产行业标准SC/T 7236一2020对虾黄头病诊断规程Code of diagnosis for infection with yellow head virus genotype 1 2020-08-26发布2021-01-01实施中华人民共和国农业农村部发布本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC15 6)归口。本标准起草单位，中国水产科学研究院黄海水产研究所。本标准主要起草人:杨冰、万晓援、蛮宣、黄僚、梁艳、张庆利、李晨、刘莉。SC/T 7236-2020 I SC/T 7236-2020 对虾黄头病诊断规程范围本标准给出
2、了对虾黄头病诊断CInfection with yellow head virus genotype 1)的术语和定义、缩略语、试剂和材料、器材和设备、临床症状，规定了采样、组织病理学检测、套式RT一PCR检测和综合判定。1)引起的对虾黄头病流行病2 凡是不注日GB/T SC/T SC/T 3 4 M-MLV莫洛尼鼠PCR聚合酶链式反应RNA，核糖核酸Cribonucleicacid)RT-PCR，逆转录聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerase chain reaction)SPF，无特定病原体Cspecificpathogen ree)Taq酶，7.1生
3、栖热菌DNA聚合酶CThermusaqllaticus DNA polymerase)5 试剂和材料5.1 除非另有说明，文件中使用的水为蒸馆水、去离子水或相当纯度的水。5.2 二甲苯:分析纯。5.3 中性树胶。5.4 DAFA固定液:见附录A中的Al。fixative)1 SC/T 7236-2020 5 5 苏木精染色液:凡A.205 6 1%伊红储存液见A.30 5.7 1%焰红储存液.见A.40 5.8伊红焰红染色液.见A.5。5 9 粘片剂:见A.6。5.10 95%乙醇分析纯。5.11 85%乙蹲见A.70 5.12 80%乙蹲:见A.805.13 75%乙醇.见A.9。5.14
4、70%乙醇.见A.10。5.15 50%乙晖.见A.ll。5.16 组织病理学检测阳性对照为受YHV1感染且显示明显病理变化的对虾头胸甲组织切片。5 17 组织病理学检测阴性对!照为未受YHV1感染的健康对虾头胸甲组织切片。5.18 DEPC 71见A.12的规定或商品化试剂。5.19 总RNA提取试剂或其他等效产品。5.20 RNA酶抑制剂(RNasin或RNaseInhibitor,40 U/fLU,-20C保存。5.21 M-MLV逆转录酶(200U/U，-200C保存。5.22 5XM-MLV逆转录酶缓冲液，一200C保存。5.23 dNTPs(各10mmol/U，含dATP、dTTP
5、、dGTP、dCTP各10mmol/L的混合物，200C保存，用于逆转录。5.24 dNTPs(各2.5 mmol/U，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5mmol/L的混合物，-200C保存，用于PCR。5.25 lOXPCR缓冲液，无Mg2+，-20C保存。5.26 MgCl,(25 mmol/L)，一200C保存。5.27 Taq酶(5U/fLU，-20C保存。5.28套式RT-PCR检测阳性对照为已知受YHV1感染且套式RT-PCR结果显示阳性的对虾组织RNA，一700C保存。5.29 套式RT-PCR检测阴性对照为SPF对虾组织RNA，-700C保存。5 30 套式RT一
6、PCR检测空白对照为DEPC水。5 31 50X电泳缓冲液:见A.13。5 32 1X电泳缓冲液.见A.14。5.33 6X载样缓冲液。5.34 琼脂糖。5.35 DNA分子量标准。5.36 琼脂糖凝胶电泳核酸染料及其他等效产品。6 器材和设备6.1 切片机。6.2 组织脱水机。6.3 包埋机。6.4 染色机。2 SC/T 7236-2020 6 5 展片水浴锅。6.6 平板烘片机。6.7 显微镜。6.8 PCR仪。6.9 电泳仪。6.10 水平电泳稽。6.11 紫外观察仪或凝胶成像仪。6.12 高速冷冻离心机。6.13 水浴锅或金属浴。6.14 微量移液器。7 临床症状濒死虾体表发臼，头胸甲
7、因肝腋腺变黄而呈黄色，与正常虾的褐色肝膜腺相比较软。参见附录B，B 采样8.1 采样对象斑节对虾CPenaeusmonodon)、凡纳滨对虾(Lito户ellaeusvannamei)、细角滨对虾(L.stylirostris)、短刀小长臂虾CPalaemonetes户ugio)和近缘新对虾(Met户enaeusaffinis)等易感品种，优先选择濒死虾或具有l临床症状的虾。参见附录B，8.2 采样数量、方i圭和保存运输应符合GB/T28630.4-2012中附录B的要求。8.3 样品采集组织病理学检测的样本，选取跑、淋巴器官、胃、触角腺、性腺、神经管和神经节及肠道。快速浸入DAFA固定液中固
8、定.24h后换人70%乙醇中长期保存。套式RT-PCR检测的样本，优先选取淋巴器官和跑，也可选取血淋巴、触角腺、性腺、神经管和神经节及肠道。亲虾的非致死检测取鲍和血淋巴。所取样品立即进行RNA提取或暂时保存于20C以下。采样时，稍大的虾取个体检测，仔虾或未达到0.5g的样品可合并样本。9 组织病理学检测9.1 操作方式使用6.16.6中设备或手动操作完成。9.2 修块样品切片前的取材修整，应符合GB/T28630.4-2012中附录B的要求，保证病灶部位能被有效地切片。9.3 脱水75%乙酶(1h 45 min)85%乙酶(1h 45 min)85%乙醇(1h 45 min)95%乙醇(45m
9、in)95%乙醇(45min)无水乙醇(45min)元水乙醇(45min)。9 4 透明无水乙醇:二甲苯(1:1)(25 min)二甲苯(20min)二甲苯(20min)。9.5 浸蜡纯石蜡(1h 20 min)纯石蜡(1h 20 min)。9 6 包埋9.7 切片3 SC/T 7236-2020 厚度5m。对每个石蜡包埋块至少切取2片不连续的切片。9 8展片宜400C展片，用涂有一层粘片剂的载玻片捞出，置于平板烘片机上于45l:烘片2ho 9 9 染色二甲苯(5min)二甲苯(5min)无水乙醇(2min)无水乙醇(2min)95%乙醇(2min)95%乙蹲(2min)80%乙醇(2min)
10、80%乙晖(2min)50%乙醇(2min)蒸馆水(2min)蒸馆水(2 min)蒸饱水(2min)苏木精染色液(5min)缓慢流动的自来水(6min)伊红-焰红染色液(2 min)95%乙醇(1min 20 5)-95%乙醇(2min)元水乙蹲(2min)无水乙蹲(2min)二甲苯(2 min 30 5)二甲苯(2min 305)9.10 封片滴加2商中性树胶封9.11 观察显微镜下观察。DEPC水4.3 和空白对照。O.5L、RNa5eInhi 1人700C15 min后，10.22第步PCR按照表l中引物序列，。分别加入cDNA模板。25Lmm。L)L5L、dNTP5(各2.5 mmo!
11、/L)0.5L、引物GYIC50mo!/L)O.j5L71切GY4(50moL)0.35L、Taq酶(5U/L)O.1L、灭菌双蒸7J18.7L和10.2.1的逆转录产物lL。将上述PCR管置于PCR仪中，按以下反应程序进行扩增950C3 min;950C 305、660C30 5、720C45 5，35个循环;720C延伸7min;40C保温。表1套式RT-PCR检测引物引物名称引物序列(5-3)产物片段大小GY5 GAG-CTG-GAA-TTC-AGT一GAG-AGA-ACA/GY GAC-ATC-ACT-CCA-GAC-AAC-ATC-TG 794 bp GY4 GTG-AAG-TCC-
12、ATG-TGT-GTG-AGA-CG GY2 CAT-CTG一TCC-AGA-AGG-CGT-CTA-TGAY3 ACG-CTC-TGT-GAC-AAG-CAT-GAA-GTT YHV,277 bp G6 GTA-GTA-GAG-ACG-AGT-GAC-ACC-TAT GAV,406 bp 4 SC/T 7236-2020 1023 第二步PCR按照表l中引物序列，配制第二步PCR反应体系，分装到PCR管中。25LPCR反应体系，包括10XPCR缓冲液(元Mg计)2.5fiL、MgCl，(25 mmol/L)1.5L、dNTPs(各2.5 mmol/L)o.5L、引物GY2(50mol/L)0
13、.35L、引物Y3(50mol/L)0.35L、引物G6(50mol/L)0.35L、五q酶(5U/fiL)O.1 fiL、灭菌双蒸水18.35L，模板DNA(第一步PCR反应产物)1L，将上述PCR管置于PCR仪中，按10.2.2反应程序进行扩增。10.24 可以使用同等逆转录或一步法RT-PCR效果的商品化试剂盒进行操作囚10.3 琼脂糖凝胶电泳及测序10.3 1 配制1.5%的琼脂糖凝胶，按比例加入电泳核酸染料。10 32 将5LPCR反应产物与lL6X载样缓冲液(宜含电泳核酸染料)混匀后加入到jJ日样孔中。同时，设立DNA分子量标准对照。10.33 在1V/cm-5 V/cm的电压下电
14、泳，使DNA由负极向正极移动。当载样缓冲液中澳盼蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的1/2-2/3处时停止电泳，将凝胶宣于紫外观察仪或凝胶成像仪下观察或拍照。10.34 如果观察到预期大小条带，对PCR扩增产物进行测序。10.4 结果判定10.4.1 阳性对照第一步PCR后在794bp和/或第二步PCR后在277bp处有特定条带;阴性对照在794 bp和277bp处均无条带且空白对照不出现任何条带，实验有效。10.42 检测样品第一步PCR后在794I平和/或第二步PCR后在277bp/406 bp处有特定条带，且PCR产物测序结果符合参考序列(参见附录白，分别判为YHVl/GAV套式RT-PCR
15、结果阳性。检测样品第一步PCR后在794bp处无条带，当第二步PCR后在277bp处无条带，判为YHV1套式RT-PCR结果阴性，当第二步PCR后在406bp处元条带，判为GAV套式RT-PCR结果阴性。11 综合判定111 疑似病例的判定符合以下一条以上，判定为疑似病例a)易感对虾在发病条件下出现临床症状;b)具有典型的病理学特征，c)YHV 1套式RT-PCR结果阳性。112 确诊病例的判定具有临床症状和病理学特征且YHV1套式RT-PCR检测结果阳性，判定为确诊病例。5 SC/T 7236-2020 A.l DAFA固定渡95%乙醇甲I!1iC37%)冰醋酸过滤海水混匀，室温密封储存。A
16、.2 苏木精染色液温水C500C-600C)苏木素E典酸纳饵明矶拧核酸水合三氯乙应附录A(规范性附录)试剂配方按上述顺序混合，溶解后即可使用，室温储存。A3 1%伊红储存液伊红YC水溶性)水溶解后置于棕色瓶中，室温储存。A.4 1%焰红储存液焰红BC水溶性)水溶解后置于棕色瓶中，室温储存。A.5 伊红-焰红染色液1%伊红储存液1%焰红储存液95%乙蹲冰醋酸?昆匀后即可使用，室温储存。A6 粘片剂明胶热水溶解后，加入6 330 mL 220 mL 115 mL 335 mL 1000 mL 1 g 0.2 g 90 g 1 g 50 g 5 g 500 mL 1 g 100 mL 100 mL
17、10 mL 780 mL 4 mL 1 g 100 mL 苯盼甘泊?昆匀，在棕色瓶中室温储存。A.7 85%Z.醇95%乙酶加水定容至混匀，室温储存。A.8 80%乙醇95%乙醇加水定容至i昆匀，室温储存。A.9 75%Z.醇AlO A 11 A.12 DEPC 71nL中巾&巩nnn户lUv户l UnU巾I&户lUv U户tRn比比户lUv户lUv 甲4巾A户lU户iUCT 户U户b户U卢U巾I牟.巾户tL户IU TG 巾户tU 巾合【iLU 巾I牟.巾CL户CU 凹凹户U户U户U户U巾I4矗巾4户tU户tM 执n巩n比忆UU户iU户iUv 阻M户UnU户lU户IUU TT AA 45 16
18、 QJQJ 句J竹J1414 口vv饥nuu户UV&GAV 12974 GCAAACATGACAATTCATCAATACAAGGAAGCATTCAACCTTTACACTAATGAACTTGCA YHV 13025 GAAGACATGACAATTCATCAGTACAAAGAAGCATTCGCACTCTACACTACAGAATTGAAC GAV 13034 ACAGAGGTCACACTCAAACACCAGCCAACATTCGACTCCTATCTCTCATTTATGCTCACA YHV 13085且CAGAAGTCACTCTCAAACACCAACCTACTTTCGACTCCTATCTCAACTTCA
19、TGCTTGTC Y3 GAV 13094 AAGGAACGCCATAACATCAACATCGACATTGGTACAGGCGCAAACACTTTCTACACCTCC YHV 13145 ACAGAGCGTCACAACATCAACATTGACATCGGCACAGGAGCAGACACCTTCTACACTTCC GAV 13154 TTCGACACAATCAACTCTGCTCCATGCACAGACGAACGTTACGAAGAAGTCATGATAGGT YHV 13205 TTCGACAACATCACATCAGCTCCGTGTACAGAAGAACGATAC阻CGMGTCATGG旦旦GAV 13214
20、GTCACTCGTCTCTACTACGCCTATCAGTATGATCGCGGTGACTTCCCTTGTAAATACACA YHV 13265 GTTACTCGCTTATATTATGCCTACCAGTATGATAGAGGTGATTTTCCTTGCAAATACACA G6 GAV 13274 GTCAC卫CAAACACACATCAAATACCCAGTAATCGGCGATGTTGCTGTTGAGCCTGAAGAGYHV 13325 GTCACTCAAACTCACGTCAAATACCCTGTAATTGGCGATGTTGCTGTGGAACCTGAAGAA GAV 13334 TGTTCTTATCCCAC
21、ATGTAACGGTTATCCGCCAGTTTACAGTGCCCTCGTTTCCATCCAG YHV 13385 TGCAAAAATCCGATCTGCAACAGTTACCCACCAGTCTACAGTGCTCTGATCTCCATCCAG GAV 13394 AAATTCACAACTTGGGCACGTCTCATGGGATATAACGTTCTCAAGCGCGTCTTCAATCAC YHV 13445 AAATTCAGCACCTGGGCTCGTCTCATGTGTCATGATATTCTCAAGCGAGTCTTCAATCAC GAV 13454 TGTCGCAACTGTGAACATCTCAACTGTAAG
22、ATCTCACGGCAGCTAGCGCGATTCAAGAAT YHV 13505 TGTCGTGACTGTGACCATCTTAACTGCAAGATCTCACGGCAACTCATGCGCTTCAAGAAT GAV 13514 CCACTCTCCAACATCCAACCAGTCGCTTACACTAAACTACACGAAGACCGTCACCTCATT YHV 13565 CCACTTTCCAACATTCAGCCAGTCGCATACACTAAACTACACGAAGATCGTCACCTAATC GAV 13574 CGTGATCGTCTCACACACATGGACTTCACATCAGGACAGGAATTCT
23、ATGCCGCTGAATTC YHV 13625 CGTGACCGTCTCACACACATGGACTTCACCTCAGGTCAAGAGTTCTACGCTACTGAATTC GY4 GAV 13634 ATAAAAGAGTTTAACGACATCGAGTTCACTACAACACACGGCGACAAGCTACACTTCAAT YHV 13685 ATCAATGAGTTCAATGACGTCGAATTCAAGACACTGAACGGTGATACCATTCACTTCAAC GAV 13694 CTCACACATCCTTATGACGCTCTCCTTGAACCTCTACTCCCTTCTAACACACTTGTCG
24、GA YHV 13745 CTCACGCATCCCTATGACGCTCTCCTCGAACCTCTACTTCCTCCTAACACTCTCGTCGGA 11 SC;T 7236-2020 12 GAV 13754 AATTCAGTAGCAGCATCAGGGGTCATCAGTGATCTAGATGATAACTTCAAGAACTATGAC YHV 13805 AATTCAGTGGCAGCATCAGGCGTTATTAGTGATCTTGACGCTAATTTCAAAAACTACGAC GAV 13814 CGAAACACCGGCATATCCTGTTCTCTCACTG高ATTCCAGCTCTCTCTCTCGYHV 13865 AGAAACACCGGCATGTCCTGTTCTCTCACTG在ATTCCAGCTCTCTCTCTCTGY5 注目箭头为套式PCR引物序列。ONON-的Nh同U5C/T 7236-2020 中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码100125 网址)化学工业出版社印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销长是*9号印张1.25 字数25千字2020年12月北京第1次印刷专开本880mmX1230mm 1/16 2020年12月第1版书号16109 8359 定价32.00元4陪版权专有侵权必究举报电话(010)59194261 SC/T