《SN∕T 5223-2019 蜂蜜中18种游离氨基酸的测定 高效液相色谱-荧光检测法(出入境检验检疫).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SN∕T 5223-2019 蜂蜜中18种游离氨基酸的测定 高效液相色谱-荧光检测法(出入境检验检疫).pdf（20页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 52232019蜂蜜中 18 种游离氨基酸的测定 高效液相色谱-荧光检测法Determination of 18 free amino acids in honey HPLC-FLD method2019-12-27 发布2020-07-01 实施ICS 67.050C 53中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准SN/T 52232019I前 言本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国海关总署
2、提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：陈辉、彭涛、代汉慧、胡雪艳、谢瑜杰、范春林。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 52232019蜂蜜中 18 种游离氨基酸的测定 高效液相色谱-荧光检测法1 范围本标准规定了蜂蜜中 18 种游离氨基酸的高效液相色谱-荧光检测方法。本标准适用于蜂蜜天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、谷氨酰胺（Gln）、组氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、精氨酸（Arg）、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tys）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、异亮氨酸（Il
3、eu）、亮氨酸（Leu）、赖氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。3 方法提要采用定量环衍生的方法对蜂蜜中氨基酸进行衍生化处理，再用高效液相色谱-荧光检测法进行测定，外标法定量。4 试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。4.1 磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）。4.2 氢氧化钠（NaOH）。4.3 硼酸（BH3O3）。4.
4、4 乙腈（色谱纯）。4.5 甲醇（色谱纯）。4.6 浓盐酸。4.7 邻苯二甲醛试剂（OPA）：10 mg/mL。4.8 9-芴甲基氯甲酸酯试剂（FMOC）：2.5mg/mL。4.9 氢氧化钠溶液（10mol/L）：称取 40 g 氢氧化钠（4.2），溶于 50 mL 水中，冷却至室温后，用水稀释至 100 mL，混匀。4.10 0.1 mol/L 盐酸溶液：取 0.90 mL 浓盐酸（4.6）至 100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。4.11 硼酸盐缓冲液：称取 2.47 g 硼酸（4.3）于 100 mL 水中，用氢氧化钠溶液（4.9）调节 pH 值至 10.2。4.12 磷酸二氢钠
5、缓冲溶液：称取 6.24 g 磷酸二氢钠（4.1），转移到 1 000 mL 玻璃烧杯中。加入 1 000 mL超纯水，搅拌，直到所有晶体完全溶解。用氢氧化钠溶液（4.9）调节溶液 pH 值至 7.80。4.13 18 种单个氨基酸标准品（具体名称参见附录 A）：固体，纯度不小于 98%。4.14 混合氨基酸标准储备溶液：准确称取一定量的各种氨基酸标准品，用0.1 mol/L盐酸溶液（4.10）以正式出版文本为准2SN/T 52232019溶解，混匀，使其浓度为 500 pmol/L。4.15 混合氨基酸标准工作溶液：准确量取混合氨基酸标准储备溶液（4.14），用0.1 mol/L盐酸溶液（4
6、.10）稀释，依次配制成浓度分别为 0.5 pmol/L、1 pmol/L、2.5 pmol/L、5 pmol/L、10 pmol/L、25 pmol/L 的标准溶液。4.16 微孔滤膜：孔径 0.22 m。5 仪器和设备5.1 液相色谱仪：配有荧光检测器。5.2 磁力搅拌器。5.3 分析天平：感量为 0.1 mg 和 0.001 g。5.4 pH 计。6 测定步骤6.1 样品准备称取 3.0 g（精确至 0.01 g）蜂蜜样品，用适量超纯水涡旋混匀至溶解，然后用超纯水定容至 25 mL，0.22 m 滤膜过滤，上机检测。6.2 测定6.2.1 液相色谱参考条件6.2.1.1 色谱柱：氨基酸分
7、析柱，150 mm4.6 mm（内径），3.5 m 或相当者；6.2.1.2 柱温：40；6.2.1.3 自动进样器：定量环规格为 100 L。6.2.1.4 进样器程序：参见附录 B。6.2.1.5 流动相 A 为磷酸二氢钠缓冲溶液（4.12）。流动相 B 为乙腈:甲醇:水=45:45:10（v/v/v）。流动相、流速及梯度洗脱条件见表 1。表 1 流动相、流速及梯度洗脱条件时间/min流动相 A/%流动相 B/%流速/ml/min0100021.91000218.14357218.60100222.30100223.2100022610002以正式出版文本为准3SN/T 522320196
8、.2.1.6 FLD 参数：0 min，激发波长=340 nm；发射波长=450 nm；PTM gain=10；15 min，激发波长=266 nm；发射波长=305 nm；PTM gain=9。6.3 定性依据氨基酸标准样品的保留时间，对待测样品中各氨基酸进行定性，定性色谱图参见附录 C。6.4 定量本方法采用外标法定量测定。样品中氨基酸响应值应在标准工作曲线线性范围内，如果超出，应稀释。计算时标准工作溶液中各氨基酸浓度由 pmol/L 换算为 mg/L，相对分子质量参见附录 A。7 结果计算和表述试样中游离氨基酸的含量按照式（1）计算：（1）式中：X试样中游离氨基酸的含量，单位为毫克每千克
9、（mg/kg）；A被测样品中游离氨基酸的峰面积；b标准曲线方程的截距；k标准曲线方程的斜率；D二次稀释倍数；V样品的定容体积，单位为毫升（mL）；m试样的质量，单位为克（g）。8 定量限除脯氨酸定量限为 1.0 mg/kg 外，其余游离氨基酸的定量限为 0.2 mg/kg。以正式出版文本为准4SN/T 52232019附 录 A（资料性附录）18 种氨基酸的分子式和相对分子量表 A.1 18 种氨基酸的分子式和相对分子量序号中文名称英文名称英文缩写分子式相对分子质量CAS 号1天冬氨酸aspartic acidAspC4H7NO4133.11783-96-62谷氨酸glutamic acidG
10、luC5H9NO4147.1356-86-03丝氨酸serineSerC3H7NO3105.0956-45-14谷氨酰胺glutamineGlnC5H10N2O3146.1456-85-95组氨酸histidineHisC6H9N3O2155.1571-00-16甘氨酸glycineGlyC2H5NO275.0756-40-67苏氨酸threonineThrC4H9NO3119.1272-19-58精氨酸arginineArgC6H14N4O2174.274-79-39丙氨酸alanineAlaC3H7NO289.0956-41-710酪氨酸tyrosineTyrC9H11O3N181.196
11、0-18-411缬氨酸valineValC5H11NO2117.1572-18-412蛋氨酸methionineMetC5H11NO2S149.2163-68-313色氨酸tryptophanTrpC11H2O2N2204.2373-22-314苯丙氨酸phenylalaninePheC9H11O2N165.19150-30-115异亮氨酸isoleucineIleuC6H13NO2131.1773-32-516亮氨酸leucineLeuC6H13NO2131.1761-90-517赖氨酸lysineLysC6H14N2O2146.1956-87-118脯氨酸prolineProC5H9NO2
12、115.13147-85-3以正式出版文本为准5SN/T 52232019附 录 B（资料性附录）自动进样器程序B.1 在不同进样小瓶中分别加入适量硼酸缓冲液（小瓶 1），蜂蜜样品（由进样序列设置），水（小瓶 2，不加瓶盖），OPA 试剂（小瓶 3），FMOC 试剂（小瓶 4），水（小瓶 5），其中 OPA 试剂和FMOC 试剂需要分装 100 L 到带有锥形内插管的进样小瓶中，分装后应立即封盖。按照表 B.1 设置自动进样器程序。表 B.1 自动进样器程序序号操作名称参数设置小瓶编号1抽取2.5 L小瓶 12抽取2.0 L（蜂蜜样品）由进样序列设置3混合3.0 L 空气，最大速度，2 次4等
13、待0.5 min5抽取0.0 L（洗针）小瓶 26抽取0.5 L小瓶 37混合3.0 L 空气，最大速度，6 次8抽取0.0 L（洗针）小瓶 29抽取0.5 L小瓶 410混合4.0 L 空气，最大速度，6 次11抽取32.0 L小瓶 512混合18.0 L 空气，最大速度，2 次13进样以正式出版文本为准6SN/T 52232019附 录 C（资料性附录）定性色谱图说明：1 天冬氨酸（Asp）；2 谷氨酸（Glu）；3 丝氨酸（Ser）；4 谷氨酰胺（Gln）；5 组氨酸（His）；6 甘氨酸（Gly）；7 苏氨酸（Thr）；8 精氨酸（Arg）；9 丙氨酸（Ala）；10 酪氨酸（Tys）
14、；11 缬氨酸（Val）；12 蛋氨酸（Met）；13 色氨酸（Trp）；14 苯丙氨酸（Phe）；15 异亮氨酸（Ileu）；16 亮氨酸（Leu）；17 赖氨酸（Lys）；18 脯氨酸（Pro）图 C.1 标准溶液中 18 种氨基酸色谱图以正式出版文本为准ISN/T 52232019ForwardThis standard was drafted in accordance with the requirements of GB/T 1.12009.Please note that this standard some material may be involved in patent,
15、this standard release mechanism does not assume the responsibility of identifying these patents.This standard was proposed by General Administration of Customs of the Peoples Republic of China.This standard was drafted by Chinese Academy of Inspection and Quarantine.This standard was mainly drafted
16、by:Chen Hui,Peng Tao,Dai Hanhui,Hu Xueyan,Xie Yujie,Fan Chunlin.以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 52232019Determination of 18 free amino acids in honey HPLC-FLD method1 ScopeThis standard specifies the testing method of 18 free amino acids in honey by high performance liquid chromatography-fluorescence detect
17、or with principle,reagents and materials,qpparatus and equipment,analysis steps,calculation and expression of the result,limit of determination.This standard is applicable to the determination of the content of Aspartic acid（Asp）,Glutamic acid（Glu）,Serine（Ser）,Glutamine（Gln）,Histidine（His）,Glycine（G
18、ly）,Threonine（Thr）,Arginine（Arg）,Alanine（Ala）,Tyrosine（Tyr）,Valine（Val）,Methionine（Met）,Tryptophan（Trp）,Phenylalanine（Phe）,Isoleucine（Ileu）,Leucine（Leu）,Lysine（Lys）,Proline（Pro）in honey.2 Normative referenceThe following normative documents contain provisions which,through reference in this text,con
19、stitute provisions of this standard.For dated references,subsequent amendments to,or revisions of any of these publications do not applied.However parties to agreements based on this standard are encouraged to investigate the possibility of applying the most recent editions of the normative document
20、s indicated below.For undated references,the latest edition of the normative document referred to applies.GB/T 6682 Water for analysis laboratory use Specification and test methods.3 PrincipleFollowing automated in-loop pre-column derivative,the free amino acid of honey was separated by high perform
21、ance liquid chromatography-fluorescence detector,and quantified by the external standard curve.4 Reagents and materialsUnless specifically mentioned,all reagent used should be analytical grade,“water”is the first grade water prescribed by GB/T 6682.4.1 Sodium dihydrogen phosphate（NaH2PO42H2O）.4.2 So
22、dium hydroxide（NaOH）.4.3 Boric acid（BH3O3）.4.4 Acetonitrile:HPLC grade.4.5 Methanol:HPLC grade.4.6 Hydrochloric acid（HCl）.4.7 O-phthalaldehyde（OPA）:10 mg/mL.4.8 9-fluorenylmethyloxycarbonyl（FMOC）:2.5mg/mL.4.9 Sodium hydroxide solution:weigh 40.0 g NaOH（4.2）,dissolve with ultrapure water and dilute t
23、o 100 mL.以正式出版文本为准2SN/T 522320194.10 0.1 mol/L HCl solution:transfer 0.90 mL hydrochloric acid（4.6）into 100 mL volumetric flask,dissolve with water and dilute to the scale reading.4.11 Borate buffer:weigh 2.47 g Boric acid（4.3）,dissolve with ultrapure water and dilute to 100 mL,and then adjust the p
24、H to 10.2 with sodium hydroxide solution（4.9）.4.12 Sodium dihydrogen phosphate buffer:weigh 6.24 g sodium dihydrogen phosphate（4.1）,dissolve with ultrapure water and dilute to 1 000 mL,and then adjust the pH to 7.8 with sodium hydroxide solution（4.9）.4.13 18 amino acid standards（see Annex A）:solid,p
25、urities are all 98%.4.14 Amino acid standard stock solution:accurately weigh a certain amount of amino acid standard,dissolve with 0.1mol/L hydrochloric acid（4.10）,mix adequately,the final concentration was 500 pmol/L.4.15 Mix standard working solution:accurately transfer an adequate amount of stand
26、ard stock solution（4.14）,dissolve with 0.1 mol/L hydrochloric acid（4.10）to prepare the solution concentration as 0.5 pmol/L,1 pmol/L,2.5 pmol/L,5 pmol/L,10 pmol/L and 25 pmol/L.4.16 Membrane filter:0.22 m.5 Apparatus and equipment5.1 Liquid chromatography with fluorescence detector.5.2 Magnetic mix.
27、5.3 Balance,sensitivity:0.001 g and 0.1 mg.5.4 pH meter.6 Analysis steps6.1 Sample preparationWeigh 3.0 g（accurate to 0.01 g）of honey sample,dissolve with a certain amount of ultrapure water,make them homogeneous by mixing,dilute to 25 mL with ultrapure water,and then filtered through 0.22 m membran
28、e.The filtrate is ready for HPLC-FLD determination.6.2 Determination6.2.1 LC operation reference conditions6.2.1.1 LC column:ZORBAX Eclipse-AAA,150 mm4.6 mm（i.d.）,3.5 m,（or other conformable column）.6.2.1.2 Column temperature:40.6.2.1.3 Automatic injector:the volume of loop was 100L.6.2.1.4 Autosamp
29、ler programming:see annex B.6.2.1.5 A is sodium dihydrogen phosphate buffer;B is acetonitrile:methanol:water=45:45:10（v/v/v）.Mobile phase,flow rate and elute condition:see Table 1.Table 1Elute conditionTime/minA/%B/%Flow rate/（ml/min）0100021.91000218.143572以正式出版文本为准3SN/T 52232019Time/minA/%B/%Flow r
30、ate/（ml/min）18.60100222.30100223.21000226100026.2.1.6 FLD parameters:0 min,excitation wavelength=340 nm;emission wavelength=450 nm;PTM gain=10;15 min,excitation wavelength=266 nm;emission wavelength=305 nm;PTM gain=9.6.3 QualificationUnder above determination condition,the amino acids in honey sampl
31、e were identified according to the retention time of amino acids in standard solution,the chromatogram of standards,see Annex C.6.4 QuantificationThe method quantified by the external standard curve.The responses of free amino acids in the sample solution should be in the linear range of the instrum
32、ental detection.The concentration of amino acids in the calibration curves should be converted from pmol/Ltomg/L,and the relative molecular mass see Annex A.7 Calculation and expression of the resultCalculate the free amino acids in the test sample according to the following formula（1）:（1）where：Xthe
33、 content of free amino acids in the test sample,mg/kg.Apeak area of free amino acids in sample solution.bintercept of calibration curve.kslope of calibration curve.Ddilution factor.Vthe volume of sample solution,mL.mmass of test sample,g.8 Limit of determinationDetermination of free amino acids unde
34、r above determination conditions,the limit of determination for proline was 1.0 mg/kg,and for other amino acids was 0.2 mg/kg.续表以正式出版文本为准4SN/T 52232019Annex A（informative）Amolecular formula and relative molecular mass of 18 free amino acidsTable A.1 Molecular formula and relative molecular mass of 1
35、8 free amino acidsNo.amino acidShorthandMolecular formulaRelative molecular massCAS No.1aspartic acidAspC4H7NO4133.11783-96-62glutamic acidGluC5H9NO4147.1356-86-03serineSerC3H7NO3105.0956-45-14glutamineGlnC5H10N2O3146.1456-85-95histidineHisC6H9N3O2155.1571-00-16glycineGlyC2H5NO275.0756-40-67threonin
36、eThrC4H9NO3119.1272-19-58arginineArgC6H14N4O2174.274-79-39alanineAlaC3H7NO289.0956-41-710tyrosineTyrC9H11O3N181.1960-18-411valineValC5H11NO2117.1572-18-412methionineMetC5H11NO2S149.2163-68-313tryptophanTrpC11H2O2N2204.2373-22-314phenylalaninePheC9H11O2N165.19150-30-115isoleucineIleuC6H13NO2131.1773-
37、32-516leucineLeuC6H13NO2131.1761-90-517lysineLysC6H14N2O2146.1956-87-118prolineProC5H9NO2115.13147-85-3以正式出版文本为准5SN/T 52232019Annex B（informative）Autoinjector programA certain volumn of borate buffer（Vial 1）,honey sample（by injection sequence）,ultrapure water（vial 2,without cap）,OPA（vial 3）,FMOC（via
38、l 4）,ultrapure water（vial 5）should be prepared.Among them,OPA and FMOC should be placed into the vial with tape change tube,and the cap should be covered immediately.The autoinjector program see Table B.1.Table B.1 Autoinjector programNo.OperationparametersVial No.1draw2.5 LVial 12draw2.0 L（sample）B
39、y injection sequence3mix3.0 L in air,max speed,2 times4wait0.5 min5draw0.0 L（needle wash）Vial 26draw0.5 LVial 37mix3.0 L in air,max speed,6 times8draw0.0 L（needle wash）Vial 29draw0.5 LVial 410mix4.0 L in air,max speed,6 times11draw32.0 LVial 512mix18.0 L in air,max speed,2 times13inject以正式出版文本为准6SN/
40、T 52232019Annex C（informative）Qualification chromatographyExplain:1 Aspartic acid（Asp）;2 Glutamic acid（Glu）;3 Serine（Ser）;4 Glutamine（Gln）;5 Histidine（His）;6 Glycine（Gly）;7 Threonine（Thr）;8 Arginine（Arg）;9 Alanine（Ala）;10 Tyrosine（Tys）;11 Valine（Val）;12 Methionine（Met）;13 Tryptophan（Trp）;14 Phenylal
41、anine（Phe）;15 Isoleucine（Ileu）;16 Leucine（Leu）;17 Lysine（Lys）;18 Proline（Pro）.Figure C.1 chromatogram of 18 free amino acids in standard solution以正式出版文本为准以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部：（010）65194242-7509中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 8801230 1/16 印张 1.25 字数 28 千字2019 年 月第一版 2019 年 月第一次印刷印数 1500书号：155175158 定价 21.00 元蜂蜜中18种游离氨基酸的测定高效液相色谱-荧光检测法行 业 标 准SN/T 52232019SN/T 52232019*网址 52232019