《SN∕T 5334.4-2020 转基因植物产品的数字PCR检测方法 第4部分：转基因油菜(出入境检验检疫).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SN∕T 5334.4-2020 转基因植物产品的数字PCR检测方法 第4部分：转基因油菜(出入境检验检疫).pdf（10页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5334.42020转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 4 部分：转基因油菜Protocol of digital PCR for quantitatively detecting genetically modified plants and their derived productsPart 4:Genetically modified canola2020-12-30 发布2021-07-01 实施ICS 65.020.01CCS B 16中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准SN/T 5
2、334.42020前 言SN/T 53342020转基因植物产品的数字 PCR 检测方法分为 8 个部分：第 1 部分：通用要求及定义；第 2 部分：转基因大豆；第 3 部分：转基因玉米；第 4 部分：转基因油菜；第 5 部分：转基因棉花；第 6 部分：转基因马铃薯；第 7 部分：转基因苜蓿；第 8 部分：转基因甜菜。本文件为 SN/T 53342020 的第 4 部分。本文件按照 GB/T1.12020 给出的规则起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳海
3、关食品检验检疫技术中心、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国拱北海关检验检疫技术中心。本文件主要起草人：潘广、李想、姚丽锋，蔡教英，凌杏园，王小玉，游淑珠。I以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 5334.42020转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 4 部分：转基因油菜1 范围本文件规定了油菜中转基因品系数字 PCR 定量检测方法。本文件适用于油菜种子、叶片中 11 种转基因品系定量检测。本文件检测限参见附录 A。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其
4、最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T 5334.1 转基因产品定量检测数字 PCR 方法 第 1 部分：通用要求及定义3 术语和定义SN/T 5334.1 界定的术语与定义适用于本文件。4 原理见 SN/T 5334.1。5 设备及试剂5.1 内源基因和外源基因：内标准基因为油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因（PEP）；外源序列为品系 73496、T45、MON88302 和 OXY235 外源基因插入位点 5 端跨边界序列，以及品系 Topas19/2、MS1、MS8、Rf1、Rf2、Rf3 和 RT73 外源序列插入位点 3 端跨边界序列。引物及探针序列参见附录 A。5.2 其他
5、设备及试剂要求见 SN/T 5334.1 的规定。6 方法操作步骤6.1 一般性操作步骤一般性操作步骤见 SN/T 5334.1 的规定。6.2 数字 PCR 反应体系6.2.1 双通道数字 PCR 反应体系双通道数字 PCR 反应体系配制见表 1。以正式出版文本为准2SN/T 5334.42020表 1 双通道数字 PCR 反应体系试剂终浓度2dPCR Super Mix1内参基因上游引物参见附录 A内参基因下游引物参见附录 A内参基因探针参见附录 A品系上游引物参见附录 A品系下游引物参见附录 A品系探针参见附录 ADNA 模板60 ng水补足至反应体系 注：推荐使用市面上现售的数字 PC
6、R 平台进行实验。6.2.2 单通道数字 PCR 反应体系单通道数字 PCR 反应体系配制见表 2。表 2 双通道数字 PCR 反应体系试剂a终浓度2dPCR Super Mix1上游引物(10mol/L)参见附录 A下游引物(10mol/L)参见附录 A探针(10mol/L)参见附录 ADNA 模板60 ng水补足至反应体系 a：推荐使用市面上现售的数字 PCR 平台进行实验。6.3 数字 PCR 反应程序数字 PCR 反应程序见表 3。表 3 数字 PCR 反应程序反应温度反应时间循环数热启动a50 2 min195 5 min热变性95 15 s40退火b参见附录 A60 s a：根据不
7、同数字 PCR 平台的要求，可以对反应程序中热启动步骤进行修改，但是不得修改热循环（扩增）步骤。b：根据不同数字 PCR 平台的要求，有可能要在热循环（扩增）步骤结束后进行后处理，可按照不同平台要求进行。以正式出版文本为准3SN/T 5334.42020 结果判定与表述结果计算见 SN/T 5334.1。结果表述如下：检测结果中内标准基因与外源基因均符合阴性以及空白的质量控制要求，说明未检出油菜内源基因 PEP，表述为“未检出油菜成分”；检测结果中，内标准基因结果为阳性，但是外源基因符合阴性以及空白的质量控制要求，说明检出油菜内源基因 PEP，但未检出 品系特异性序列，表述为“未检出油菜 转基
8、因品系”；检测结果中，内标准基因与外源基因组均符合试样数字 PCR 检测的质量控制要求，说明该转基因品系 检测为阳性且满足定量要求，表述为“检出油菜 转基因品系，含量为%。8 防污染措施防污染措施见 SN/T 5334.1 的规定。9 样品保存样品保存见 SN/T 5334.1 的规定。以正式出版文本为准4SN/T 5334.42020附 录 A（资料性附录）引物探针序列、反应程序以及检测限表 A.1 引物探针序列、反应程序以及检测限基因/品系名称序列（5-3，品系探针除 73496 外，均用 5FAM、3BHQ-1 标记）终浓度/nM退火温度/Tm）定性检测限定量检测限PEP上游引物CCCT
9、TGTGAAGCTCGACATC30056 下游引物CTTGTCCTCTGACCATTCTTTGT300探针HEX-CCGACCGTCACACCGATGTTTTAGA-BHQ-118073496上游引物GTTCTTCTCTTCATAGCTCATTACAGTTTT30056 127下游引物CAAACCTCCATAGAGTTCAACATCTTAA300探针TTAGTTAGATCAGGATATTCTTG1180Rf1上游引物GGTGACTACACGCGACTCAT1 00060 3.718下游引物AGACCTCAATTGCGAGCTTTCTAAT1 000探针CATCCTCACCCAGTCAGCAT
10、CATCAC250Rf2上游引物ATCGACGTATATATAGCTGTGCCAG1 00060 3.718下游引物CTGTGGTCTCAAGATGGATCATTAA1 000探针CTCACCGGCCAAATTCGCTCTTAGCCG250Topas 19/2上游引物GTTGCGGTTCTGTCAGTTCC30056 24下游引物CGACCGGCGCTGATATATGA300探针TCCCGCGTCATCGGCGG180T45上游引物TGCATATGGAATACAGTTGTAAATGAATT30056 27下游引物TCGTAAGAGACTCTGTATGAACTGTT300探针CCAGTCTTTA
11、CGGCGAGTTCTGTTAGGTCCTC180MON88302上游引物TCCTTGAACCTTATTTTATAGTGCACA30056 26下游引物TCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCA300探针TAGTCATCATGTTGTACCACTTCAAACACT180OXY235上游引物ATTGACCATCATACTCATTGCTGA30056 26下游引物AGAGAATCGTGAAATTATCTCTACCG300探针CCATGTAGATTTCCCGGACATGAAGCC180MS82上游引物CCTTGAGGACGCTTTGATCATATT90059 2.311.5下游引物CCTTTT
12、CTTATCGACCATGTACTC900探针CCGAGTTCGACGGCCGAGTACTG250Rf32上游引物GGAATTAACATCTACAAATTGCCTTT90059 4.623下游引物TTGTAATTAGAAACCCTGAAATTTGT900探针TCGCGAGATGAAAAAGGCATTTACC250以正式出版文本为准5SN/T 5334.42020基因/品系名称序列（5-3，品系探针除 73496 外，均用 5FAM、3BHQ-1 标记）终浓度/nM退火温度/Tm）定性检测限定量检测限RT72上游引物CCATATTGACCATCATACTCATTGCT90059 4.623下游引
13、物GCTTATACGAAGGCAAGAAAAGGA900探针TTCCCGGACATGAAGATCATCCTCCTT250Ms1上游引物CGAGCTTTCTAATTTCAAACTATTCGG30056 47下游引物ATCTCTGGTTAAACATTCCATCTTTG300探针TGGATAGGTTCTTCAGCATCATCACACC180 注：73496 探针 5FAM、3MGBNFQ 标记；注 2：MS8、Rf3 和 RT73 为单通道数字 PCR。表 A.1（续）以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部：（010）65194242-7509中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 16 千字2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷印数 1000书号：000000 定价 16.00 元转基因植物产品的数字PCR检测方法第4部分：转基因油菜行 业 标 准SN/T 5334.42020*网址 5334.42020