《GA∕T 1633-2019 法庭科学 血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检验 气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法(公共安全).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《GA∕T 1633-2019 法庭科学 血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检验 气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法(公共安全).pdf（11页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、 ICS 13.310 A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检验 气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法 Forensic sciencesExamination methods for ethyl glucuronide in blood and urine samplesGC-MS and LC-MS -发布-实施 中华人民共和国公安部中华人民共和国公安部 发布发布 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些
2、专利的责任。本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（SAC/TC179/SC1）提出并归口。本标准起草单位：司法鉴定科学研究院、公安部物证鉴定中心。本标准主要起草人：严慧、沈保华、沈敏、卓先义、刘伟、向平、于忠山、何毅、王芳琳。GA/T 1 法庭科学 血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检验 气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法 1 范围 本标准规定了法庭科学血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷（EtG）的气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定性定量检验方法。本标准适用于法庭科学血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷的定性分析和定量分析。其他可疑样品中乙基葡萄糖醛
3、酸苷的定性分析和定量分析可参照使用。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。4 原理 以空白样品和添加样品作为对照，按平行操作的要求，对血液、尿液进行提取（气相色谱-串联质谱分析前需衍生化）后，采用气相色谱-串联质谱法和液相色谱-串联质谱法定性定量，以保留时间、质谱特征离子和相对丰度比作为定性判断依据；以峰面积为
4、依据，采用内标法进行定量分析。5 试剂和材料 5.1 试剂 气相色谱-质谱实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的三级水，液相色谱-质谱实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯，试剂包括：a)甲醇（色谱纯）；b)乙腈（色谱纯）；c)BSTFA（双三甲基硅烷三氟乙酰胺）/TMCS（三甲基氯硅烷）混合溶液（体积比 99:1）；d)无水吡啶；e)50%甲酸溶液（色谱纯）；f)0.01%甲酸溶液：取适量水置于 1000mL 容量瓶，加入 50%的甲酸溶液 0.2mL，以水定容至刻 度；g)标准溶液：1）1.0mg/mL 标准物质溶液：采用市售
5、EtG 标准甲醇溶液，置于冰箱中冷藏保存；GA/T 2 2）10.0g/mL EtG 标准工作液：吸取 0.1mL1.0mg/mL EtG 标准物质溶液，用甲醇稀释定容至 10mL，混匀，配制成质量浓度为 10.0g/mL 的标准物质溶液，密封，置于冰箱中冷藏保存。有效期 3 个月；3）1.0mg/mL EtG-D5（内标）溶液：采用 EtG-D5市售内标溶液，置于冰箱中冷藏保存；4）10.0g/mL EtG-D5（内标）物质甲醇溶液：吸取 0.1mL 标准储备液置于 10mL 容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，混匀，配制成质量浓度为 10.0g/mL 的标准物质甲醇溶液，置于冰箱中冷藏保存。有
6、效期 3 个月。5.2 材料 材料包括：a)离心管；b)有机系微孔滤膜：0.22m。6 仪器和设备 仪器和设备包括：a)气相色谱-串联质谱仪：配有电子轰击离子源（EI）和三重四极杆质量分析器；b）液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）和三重四极杆质量分析器；c）离心机；d）振荡器；e）移液器；f）恒温水浴锅；g）干燥箱。7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 衍生化法（适用于气相色谱-串联质谱）移取血液或尿液 100 L 于 1.5mL 离心管中，加入 100ng 内标物 EtG-D5和 900 L 乙腈，涡旋，10000r/min 离心 5min，转移
7、上清液至试管，60C 水浴中空气流下吹干，残留物中加入 BSTFA/TMCS混合溶液 66L 和无水吡啶 33L，置于 90C 干燥箱中反应 30min，冷却后作为检材样品衍生液供GC-MS/MS 分析。7.1.1.2 沉淀蛋白法（适用于液相色谱-串联质谱）移取血液或尿液100 L于1.5mL离心管中，加入50ng内标物EtG-D5和900 L乙腈，涡旋，13000r/min离心 3min；取上清液用有机系微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液供 LC-MS/MS 分析。7.1.1.3 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品两份于离心管中，一份作为空白样品，另一份添加 EtG 标准物质作为添加样品（
8、添加样品的质量浓度为 0.1 g/mL），与检材平行操作，得到空白样品提取液（或衍生液）和添加样品提取液（或衍生液）供仪器分析。GA/T 3 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 气相色谱-串联质谱条件 以下条件作为参考，可根据不同仪器和不同样品等实际情况进行调整：a)色谱柱：HP-1MS柱（30m0.25mm0.1m）或等效色谱柱；注：HP-1MS 柱是 Agilent 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。b)柱温：初温100C保持1min，以8C/min程序升
9、温至205C，再以30C/min程序升温至280C保持3min；c)进样口温度：250C；d)载气：氦气；e)流速：1mL/min；f)进样量：1L；分流进样，分流比：10:1；g)离子源220C；h)接口温度：300C；i)碰撞气：氩气；j)扫描方式：多反应监测(MRM)；k)MS参考条件见表1。表 1 气相色谱-串联质谱参考条件 名 称 定量离子对 定性离子对 EtG 261143 261143 26173 EtG-D5 266143 266143 26673 7.1.2.1.2 液相色谱-串联质谱参考条件 以下条件作为参考，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：a)色谱柱：GL
10、 Science Inertsil ODS-3柱(3mm 100mm)或等效色谱柱；b)流动相：A:0.01%甲酸水溶液，B:乙腈；柱后添加乙腈：0.1mL/min；c)洗脱：梯度洗脱，梯度见表2；d)柱温：室温；e)流速：300 L/min；f)进样量：2 L；表2 梯度洗脱条件 时间 min A B 0 90%10%3 90%10%GA/T 4 12 10%90%13 10%90%15 90%10%20 90%10%g)离子源：电喷雾电离（ESI）；h)检测方式：负离子；i)离子喷雾电压：-4500V；j)离子源温度：450C；k)碰撞气、气帘气等气流值应优化至最优灵敏度；扫描模式：多反应
11、离子监测（MRM）；l)MS参考条件（定性、定量离子对和去簇电压、碰撞能量）见表3。表 3 液相色谱-串联质谱参考条件 名 称 定量离子对 定性离子对 去簇电压 V 碰撞能量 V EtG 22175 22175-40-18 22185-20 EtG-D5 22675 22675-40-20 22685-22 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液（或衍生液）及标准工作溶液（或衍生液）和内标工作溶液（或衍生液），按7.1.2.1的分析条件进样分析。7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 移取血液或尿液检材样品100 L两份，按7.1.1进行操作。内标-工作曲线法：另取等量相似基
12、质的空白样品六份，一份作为空白样品，另外五份添加不同浓度的标准物质（添加浓度应呈良好的线性关系，且检材样品中目标物的含量应在线性范围内）及内标物质（GC-MS/MS的添加量为100ng，LC-MS/MS为50ng），作为添加样品，与检材样品平行操作。内标-单点校正法：另取等量相似基质的空白样品两份，一份作为空白样品，另外一份添加标准物质（检材样品中目标物含量应为添加样品中目标物含量的50%）和内标物质（GC-MS/MS的添加量为100ng，LC-MS/MS为50ng），作为添加样品，与检材样品平行操作。7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按7.1.2.1规定的条件分析。7.2.2.
13、2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液（或衍生液）、内标溶液和标准溶液（或衍生液），按7.1.2.1的分析条件每个样品进样分析23次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于6次。7.2.3 计算 GA/T 5 7.2.3.1 计算含量 7.2.3.1.1 内标-工作曲线法 记录检材样品提取液和添加样品提取液中目标物和内标的保留时间和峰面积值，以添加样品提取液中目标物与内标的峰面积比的平均值为纵坐标、添加样品提取液中目标物的含量为横坐标进行线性回归，得到线性方程。根据检材样品提取液中目标物与内标的峰面积比，按公式(1)计算出检材样品中目标物的含量。.(1)式中：W检材样品中目标物的
14、含量，以质量浓度计，单位为微克每毫升（g/mL）；Y检材样品提取液中 EtG 与 EtG-D5的峰面积比的平均值；a线性方程的截距；b线性方程的斜率。7.2.3.1.2 内标-单点校正法 记录检材样品提取液和添加样品提取液中目标物和内标的保留时间和峰面积值，按公式(2)计算校正因子，按公式(3)计算含量：标内内标AMAMf=.(2)式中：f 校正因子；M标 添加样品中目标物添加量，单位为微克(g)；A内 添加样品中内标物峰面积平均值；M内 添加样品中内标物添加量，单位为微克(g)；A标 添加样品中目标物峰面积平均值。样内内样MAMAfW=.(3)式中：W检材样品中目标物的含量，单位为微克每毫升
15、（g/mL）；f 校正因子；A样 检材样品提取液中目标物峰面积平均值；M内 检材样品中内标物添加量，单位为微克(g)；A内 检材样品提取液中内标物峰面积平均值；M样 检材样品的取样量，单位为毫升(mL)。7.2.3.2 计算相对相差 记录两份平行操作的检材样品中目标物的含量，按公式（4）计算相对相差：.(4)式中：RD 相对相差，用百分比（%）表示；GA/T 6 W1、W2 两个检材样品平行定量测定的含量数值；两个检材样品平行定量测定含量的平均值。8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液（衍生物）一致（
16、GC-MS/MS保留时间相对误差在 1%之内，LC-MS/MS保留时间相对误差在 2.5%之内）、目标物的定性离子与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的标准溶液相比，相对偏差不超过表4规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。EtG的相关谱图参见附录A。表 4 离子丰度比的最大允许相对偏差范围 离子丰度比 50%2050 1020 10%最大允许相对偏差 20 25 30%50%8.1.2 阴性结果评价 阴性结果评价：检材样品未出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。方法检出限参见附录 B
17、。8.2 定量结果评价 如果目标物含量的 RD20%，定量数据可靠，其含量按两份检材的平均值计算。如果检材样品中目标物含量的 RD20%，定量数据不可靠。应按 7.2 重新提取检验。EtG 的代谢相关参考资料参见附录 B。GA/T 7 附 录 A（资料性附录）EtG 的相关谱图及检出限 A.1 检出限及定量限 本方法GC-MS/MS和LC-MS/MS的检出限均为0.05g/mL，血液和尿液中EtG的GC-MS/MS和LC-MS/MS的定量下限分别为0.40g/mL和0.10g/mL。A.2 EtG的相关谱图 EtG和EtG-D5的GC-MS/MS和LC-MS/MS多反应监测谱图见图A.1、图A
18、.2。图 A.1 EtG 和 EtG-D5 的 GC-MS/MS 多反应监测谱图 EtG EtG-D5 GA/T 8 图 A.2 EtG 和 EtG-D5 LC-MS/MS 的多反应监测谱图 EtG-D5 EtG GA/T 9 A A 附 录 B（资料性附录）EtG 相关参考资料 EtG 是乙醇的体内代谢物，在血中消除时间较乙醇更长（约 12h）。血液中 EtG 阳性结果对 12h 内是否饮酒的判断起着重要作用，尤其在体内已不再能测出乙醇时。此外，血液和尿液中乙基葡萄糖醛酸苷的测定，在判定乙醇来源、区分是否血液腐败产生乙醇有着重要的意义。GC-MS/MS 和 LC-MS/MS的检出限均为 0.05g/mL。B _