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1、书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德菌检验方法犇犲 狋 犲 狉犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犅狌 狉 犽 犺 狅 犾 犱 犲 狉 犻 犪犮 犲 狆 犪 犮 犻 犪犻 狀犮 狅 狊犿犲 狋 犻 犮 狊犳 狅 狉犻 犿狆 狅 狉 狋犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、完美（中国
2、）有限公司。本标准主要起草人：赵晗、崔淑华、孙军、郝莹、田国宁、吴兴海、高业成、贾俊涛、段效辉、李建军。犛犖犜 进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德菌检验方法范围本标准规定了进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德菌的检测方法。本标准适用于进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德菌的定性检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。化妆品微生物标准检验方法总则 实验室生物安全通用要求设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。恒温培养箱：、。均质器。振荡器。光学显微镜。天平：
3、感量。无菌移液管：，（具 刻度）或微量移液器及吸头。无菌培养皿：直径（或其他商业用一次性无菌平皿）。接种环：直径。均质袋或均质瓶。全自动微生物生化鉴定系统。培养基和试剂 含多粘菌素的增菌液：见。含庆大霉素的增菌液：见。含多粘菌素、庆大霉素的琼脂：见。含多粘菌素、庆大霉素的麦康凯琼脂（不含结晶紫）：见。革兰氏染液：见。氧化酶试验试剂：见。葡萄糖氧化发酵管：见。蔗糖氧化培养基：见。西蒙氏枸橼酸盐培养基：见。犛犖犜 七叶苷培养基：见 。生化鉴定试剂盒。检验程序洋葱伯克霍尔德菌检验程序见图。图洋葱伯克霍尔德菌检验程序操作步骤 增菌培养按照 方法制备 化妆品稀释液，取稀释液 加到 含多粘菌素的增菌液中，
4、于 培养，移取，转种于 含庆大霉素的增菌液内，于 培养 。分离培养分别用接种环取增菌液一环，划线接种于琼脂（含多粘菌素、庆大霉素）平板和麦康犛犖犜 检样10 g(mL)样品+90mL稀释液10 mL+90 mL SCDLP增菌液(含多粘菌素B)36 c土1C.24h 1 mL+10 mL BCSA增菌液(含庆大霉素)BCSA琼脂(含多粘菌素B、庆大霉素)36.C:!:l.C.24 h 32 C:!:1.C.48 h 挑取5个以上可疑菌落生化试验或选用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统麦康凯琼脂(含多粘菌素B、庆大霉素凯琼脂（含多粘菌素、庆大霉素）平板，于 培养，观察各个平板上生长的菌落。
5、典型菌落在琼脂平板上为红色圆形菌落，表面光滑，周围培养基变红；典型菌落在麦康凯琼脂平板上为浅黄褐色圆形菌落，表面光滑，周围培养基不变色。鉴定 初筛自选择性琼脂平板上分别挑取个以上典型或可疑菌落，同一菌株接种于支葡萄糖氧化发酵管，其中一支加灭菌液体石蜡封口，另一支不封口，于 培养，二者均变黄为葡萄糖发酵型，未加石蜡管变黄而加石蜡管不变色为葡萄糖氧化型。同时在营养琼脂平板上划线纯化，于 培养。选择葡萄糖氧化型（加石蜡管不变黄，不加石蜡管变黄）的纯培养物继续进行鉴定。革兰氏染色挑取可疑菌落涂片，进行革兰氏染色。显微镜下观察，洋葱伯克霍尔德菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌。氧化酶试验用玻璃棒或一次性接种针挑取
6、单个特征性菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。洋葱伯克霍尔德菌为迟缓型氧化酶阳性（紫红色、紫色或深蓝色），反应时间约为 。注：实验中切勿使用镍铬材料。过氧化氢酶试验用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落，置于洁净试管内，滴加过氧化氢溶液（临用时配制），观察气泡产生情况。洋葱伯克霍尔德菌为迟缓产气，后缓慢出现气泡。蔗糖氧化挑取可疑菌落接种于蔗糖氧化培养基，培养，培养基变黄色为阳性，蓝色为阴性。洋葱伯克霍尔德菌为阳性反应。枸橼酸盐利用挑取可疑菌落接种于西蒙氏枸橼酸盐培养基，培养，培养基变蓝色为阳性，浅绿色为阴性。洋葱伯克霍尔德菌为阳性反应。七叶苷利用挑取可疑菌落接种于七叶苷培养基，培养，培养
7、基变黑色为阳性，不变色为阴性。洋葱伯克霍尔德菌为阳性反应。替代试验可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，根据 的初步判断结果，对可疑菌落进行鉴定。结果报告综合以上试验结果，报告（）样品中检出或未检出洋葱伯克霍尔德菌。犛犖犜 废弃物处理检测过程中的废弃物按照 的相关要求进行处理。犛犖犜 附录犃（规范性附录）培养基和试剂犃 含多粘菌素犅的犛犆犇犔犘增菌液犃 成分酪蛋白胨 大豆蛋白胨氯化钠磷酸氢二钾 葡萄糖 卵磷脂吐温 蒸馏水 犃 制法将上述成分混合后，加热溶解，调为 分装，高压灭菌 ，备用。使用前，用过滤除菌方法加入多粘菌素，使其终浓度为 。犃 含庆大霉素的犅犆犛犃增菌液犃 成分酪蛋白胨
8、 酵母提取物 氯化钠蔗糖 乳糖 酚红 结晶紫 蒸馏水 犃 制法将上述成分混合后，加热溶解，调为 分装，高压灭菌 ，备用。使用前，用过滤除菌方法加入庆大霉素，使其终浓度为。犃 含多粘菌素犅、庆大霉素的犅犆犛犃琼脂犃 成分酪蛋白胨 犛犖犜 酵母提取物 氯化钠蔗糖 乳糖 酚红 结晶紫 琼脂 蒸馏水 犃 制法将上述成分混合后，加热溶解，调为 分装，高压灭菌 ，备用。使用前，用过滤除菌方法加入多粘菌素和庆大霉素，使其终浓度分别为 、，培养基混匀后倾注平皿。犃 含多粘菌素犅、庆大霉素的麦康凯琼脂犃 成分蛋白胨 乳糖 牛胆盐氯化钠中性红 琼脂 蒸馏水 犃 制法将上述成分混合后，加热溶解，调为 分装，高压灭菌
9、 ，备用。使用前，用过滤除菌方法加入多粘菌素和庆大霉素，使其终浓度分别为 、，培养基混匀后倾注平皿。犃 革兰氏染液犃 结晶紫染色液犃 成分结晶紫 乙醇 草酸铵水溶液 犃 制法将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。犛犖犜 犃 革兰氏碘液犃 成分碘 碘化钾 蒸馏水 犃 制法将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至 。犃 沙黄复染液犃 成分沙黄 乙醇 蒸馏水 犃 制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。犃 染色法操作步骤如下：）涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染，水洗。）滴加革兰氏碘液，作用，水洗。）滴加 乙醇脱色约 ，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水
10、洗。）滴加复染液，复染，水洗、待干、镜检。犃 氧化酶试验试剂犃 成分盐酸四甲基对苯二胺蒸馏水 犃 制法将盐酸四甲基对苯二胺溶于蒸馏水即可。应使用新鲜配制的试剂，如放置于冷藏冰箱，应在配制后内使用。犃 葡萄糖氧化发酵管犃 成分蛋白胨牛肉膏 犛犖犜 氯化钠 溴甲酚紫 蒸馏水 犃 制法将除指示剂外的各成分加热溶解，冷却后调为 ，加入溴甲酚紫，充分溶解，加入 葡萄糖，混匀分装小试管，高压灭菌 。犃 蔗糖氧化培养基犃 成分蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钾 溴百里香酚蓝溶液 蒸馏水 犃 制法将除指示剂外的各成分加热溶解，冷却后调为 ，加入溴百里香酚蓝溶液，高压灭菌 ，使用前，用过滤除菌方法加入蔗糖溶液，使其终浓度为，无菌操作分装小试管。犃 西蒙氏枸橼酸盐培养基犃 成分柠檬酸钠 氯化钠 磷酸氢二钾 磷酸二氢铵 硫酸镁（）溴百里香酚蓝溶液 蒸馏水 犃 制法将除指示剂外的各成分加热溶解，冷却后调为 ，加入溴百里香酚蓝溶液，混匀分装小试管，高压灭菌 。犃 七叶苷培养基犃 成分胰蛋白胨 牛肉膏 七叶苷 犛犖犜 柠檬酸铁铵 蒸馏水 犃 制法将上述各成分加热溶解，冷却后调为 ，分装小试管，高压灭菌 。犛犖犜