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1、书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 进出口口腔清洁类产品中洋葱伯克霍尔德菌检验方法犕犲 狋 犺 狅 犱犳 狅 狉犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犅狌 狉 犽 犺 狅 犾 犱 犲 狉 犻 犪犮 犲 狆犪 犮 犻 犪犻 狀狅 狉 犪 犾狊 犪 狀 犻 狋 犪 狉 狔犪 狆 狆 犾 犻 犪 狀 犮 犲 狊犳 狅 狉犻 犿狆 狅 狉 狋犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提
2、出并归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。本标准主要起草人：韩伟、刘夏、谢小珏、黄菁菁。犛犖犜 进出口口腔清洁类产品中洋葱伯克霍尔德菌检验方法范围本标准规定了进出境口腔清洁类产品中洋葱伯克霍尔德菌的检验方法。本标准适用于漱口水、牙膏、牙粉和口气清新剂等口腔清洁类产品中洋葱伯克霍尔德菌的检验，其他伯克霍尔德菌的检验可参考使用。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。实验室生物安全通用要求设备和材料除微生物实验
3、室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：）天平：感量。）锥形瓶或烧瓶。）玻璃珠。）膜过滤系统。）无菌滤膜，孔径 。）无齿镊子。）吸管：及，分刻度。）灭菌平皿：直径。）培养箱：。）接种环：直径及。）计或比色管或精密试纸。）显微镜：。）全自动微生物鉴定系统。培养基和试剂 液体培养基：见。改良氏肉汤：见。洋葱伯克霍尔德菌琼脂：见。营养琼脂：见。过氧化氢溶液：临用前配制。试验管：见。犛犖犜 无菌液体石蜡。赖氨酸脱羧酶试验培养基：见。精氨酸双水解酶培养基：见。碳源利用培养基：见。西蒙氏柠檬酸盐培养基：见。半固体琼脂培养基：见 。非发酵菌生化鉴定试剂盒。检验程序洋葱伯克霍尔德菌检验程序见图。图洋葱伯克
4、霍尔德菌的检验程序操作步骤 样品制备 固体样品牙膏或牙粉等固体样品，称取，加到装有玻璃珠及 的液体培养基的三角瓶中，充分振荡混匀，静置 ，作为 的稀释液。犛犖犜 固体样品(牙膏牙粉)10g+90 mL稀释液液体样品(漱口水、口气清新喷雾)10 mL十90皿稀释液0.45m滤膜过滤10 mL稀释液加入90mL改良LETHEEN氏肉汤滤膜投入50mL改良LETHEEN氏肉汤35 c i:1 C 48 h士2h洋葱伯克霍尔德菌琼脂35Ci:10C.48h i:2h 染色镜检，过氧化氢酶阳性，氧化分解葡萄糖，赖氨酸脱竣酶阳性 液体样品漱口水或口气清新喷雾等液体样品，吸取，加到含 的液体培养基的三角瓶中
5、，充分混匀作为 的稀释液；用灭菌无齿镊子夹取孔径为 的无菌滤膜边缘，贴放在已灭菌的滤器上，固定，将稀释液倒入滤杯，打开抽滤阀门，负压抽滤；稀释液抽滤完后，关上抽滤阀门，将 液体培养基倒入滤杯，再次抽滤作为漂洗，重复操作次。增菌培养用无菌吸管移取固体样品 样品稀释液，加到 改良氏肉汤中，培养。用灭菌无齿镊子夹取液体样品抽滤漂洗后的滤膜边缘，放入 改良氏肉汤中，培养。分离用接种环挑取培养物，划线接种在洋葱伯克霍尔德菌琼脂，培养，观察菌落形态，洋葱伯克霍尔德菌落呈光滑圆形，鼠尾草绿色，周围培养基呈亮粉色。若菌落较小可再培养 后进行观察。筛选试验 纯化：自洋葱伯克霍尔德菌琼脂平板上挑取个以上典型或可疑
6、菌落，接种到营养琼脂斜面上，培养。染色镜检：洋葱伯克霍尔德菌为革兰氏阴性杆菌，直或微弯。大小为 。过氧化氢酶试验：用接种环挑取纯培养物在洁净载玻片上，滴加滴滴过氧化氢溶液，立即观察，在半分钟内出现小气泡则为过氧化氢酶阳性。葡萄糖氧化发酵（犗犉）试验：用接种环挑取少量纯培养物，同时穿刺接种于支试验管中，其中支滴加无菌液体石蜡覆盖培养基表面 以隔绝空气，作为封闭管，另取支空白的试验管，滴加无菌液体石蜡作为对照管，培养，观察。仅开放管变黄产酸的为氧化反应，开放管和封闭管均变黄产酸的为发酵反应，对照管应为阴性。赖氨酸脱羧酶试验：挑取少量纯培养物，接种到赖氨酸脱羧酶试验培养基中，培养，观察。黄色为阴性，
7、紫色为阳性。鉴定试验 生化试验：对符合革兰氏阴性杆菌、过氧化氢酶阳性、试验仅为氧化反应、赖氨酸脱羧酶阳性的纯培养物继续进行鉴定。洋葱伯克霍尔德菌及同属主要细菌的生化特性见表。表洋葱伯克霍尔德菌的生化特征与其他主要伯克霍尔德菌的区别生化反应洋葱伯克霍尔德菌鼻疽伯克霍尔德菌类鼻疽伯克霍尔德菌石竹伯克霍尔德菌唐菖蒲伯克霍尔德菌皮氏伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌精氨酸双水解酶鼠李糖犛犖犜 表（续）生化反应洋葱伯克霍尔德菌鼻疽伯克霍尔德菌类鼻疽伯克霍尔德菌石竹伯克霍尔德菌唐菖蒲伯克霍尔德菌皮氏伯克霍尔德菌越南伯克霍尔德菌麦芽糖，丁二醇 丙氨酸亮氨酸柠檬酸盐动力注：“”表示阳性；“”表示阴性；“”表示反应不
8、定。如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统，可根据筛选试验的判断结果，用 中已培养的营养琼脂斜面上生长的纯菌，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统进行鉴定。结果报告综合以上试验结果，报告 样品中检出或未检出洋葱伯克霍尔德菌。废弃物处理检测过程中的废弃物按照 的相关要求进行处理。犛犖犜 附录犃（规范性附录）培养基和试剂犃 犛犆犇犔犘液体培养基犃 成分酪蛋白胨 大豆蛋白胨氯化钠磷酸氢二钾（）葡萄糖 卵磷脂吐温 水 犃 制法先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其他成分混合，加热溶解在 水中，调节，分装适宜容器，高压灭菌 。犃 改良犔犈犜犎犈犈犖氏肉汤犃 成分蛋白胨 酪蛋白胰酶消化物 牛肉
9、膏 酵母膏 卵磷脂 吐温 氯化钠 亚硫酸氢钠 水 犃 制法将吐温 和卵磷脂先后在少量蒸馏水中加温，直至完全溶解。经加热、搅拌加入其他成分进行溶解，调节值，分装适宜容器，高压灭菌 。犛犖犜 犃 洋葱伯克霍尔德菌琼脂犃 基础培养基犃 成分蛋白胨 酵母提取物 丙酮酸钠 磷酸二氢钾（）磷酸氢二钠（）胆盐 硫酸铵 硫酸镁 硫酸亚铁铵 酚红 结晶紫 琼脂 水 犃 制法除琼脂外，将基础培养基其余成分溶解于水中，调节值，加入琼脂，分装适宜容器，高压灭菌 。犃 抗生素添加剂犃 成分多粘菌素 庆大霉素 替卡西林 犃 制法将上述成分溶解在无菌水中，摇匀，备用。犃 使用方法将基础培养基冷却至 左右，加入抗生素添加剂，
10、混合均匀，倾注无菌平皿。犃 营养琼脂斜面犃 成分蛋白胨 牛肉膏 氯化钠 犛犖犜 琼脂 水 犃 制法将除琼脂以外的各成分溶解于水中，调节值，加入琼脂，分装合适的试管，高压灭菌 。灭菌后摆成斜面备用。犃 犗犉试验管犃 成分蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钾（）葡萄糖 琼脂 溴麝香草酚蓝水溶液水 犃 制法溴麝香草酚蓝先用少量 乙醇溶解后，加水配成溶液。将除琼脂以外的各成分溶解于水中，调节值，加入琼脂，分装合适的试管，高压灭菌 。犃 赖氨酸脱羧酶试验培养基培养基犃 成分蛋白胨 酵母浸膏 葡萄糖 溴甲酚紫乙醇溶液 赖氨酸或 赖氨酸 或 水 犃 制法除赖氨酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶 ，分别加入赖氨酸（赖氨酸
11、按 加入，赖氨酸按加入），调节值。对照培养基不加赖氨酸。分装于无菌的小试管内，每管，上面滴加一层液体石蜡，高压灭菌 。犃 精氨酸双水解酶培养基犃 成分酵母粉 犛犖犜 葡萄糖 氯化钠 精氨酸 溴甲酚紫 水 犃 制法除溴甲酚紫外的成分加热溶解后，调节值，加入溴甲酚紫，混匀，分装适宜的试管，高压灭菌 。犃 试验方法挑取 中的纯培养物，接种到精氨酸双水解酶培养基中，培养，培养基变红为阳性，不变为阴性。犃 碳源利用培养基犃 基础培养基硫酸铵（）硫酸镁（）磷酸二氢钠（）氯化钙（）磷酸氢二钾（）水 犃 底物鼠李糖：麦芽糖；，丁二醇；丙氨酸；亮氨酸。犃 制法将基础培养基各成分溶解后，高压灭菌 。底物溶液过滤除
12、菌，添加鼠李糖、麦芽糖、，丁二醇终浓度为；丙氨酸、亮氨酸终浓度 。分装适宜的灭菌试管。犃 试验方法将 中的纯培养物制成菌悬液，滴加到碳源利用培养基中，培养，连续三代移种，生长者为阳性。犃 西蒙氏柠檬酸盐培养基犃 成分氯化钠 硫酸镁（）磷酸二氢铵（）磷酸氢二钾（）柠檬酸钠 犛犖犜 琼脂 溴麝香草酚蓝溶液 水 犃 制法将盐类溶于水中，调节值，加入琼脂，加入溶化，然后加入溴麝香草酚蓝溶液，混合均匀后分装适宜的试管，高压灭菌 ，摆放成斜面备用。犃 试验方法取少量 中的纯培养物接种，培养，每天观察，斜面上有菌落生长，培养基从绿色变为蓝色的为阳性。犃 半固体琼脂培养基犃 成分酪胨 酵母提取物 琼脂 水 犃 制法将除琼脂以外的各成分溶解于水中，调节值，加入琼脂，高压灭菌 。倾注灭菌平板，每皿，待凝结后应缓慢地移动平板，防止培养基破裂。犃 试验方法将 中的纯培养物制成菌悬液，用接种环挑取一环点种在半固体培养基中央，合盖后室温放置，若没有扩散生长，则从菌斑边缘挑取一环进行重复试验，仍未扩散生长者为阴性。犛犖犜