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1、生物教研组Y YU UN NN NA AN N U UN NI IV VE ER RS SI IT TY Y S SE EC CO ON ND DA AR RY Y S S C C H H O O O O L L X X I I N N G G Y Y A A O O C C A A MM P P U U S S课题：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教师：李阳云 南 大 学 附 属 中 学 星 耀 校 区云 南 大 学 附 属 中 学 星 耀 校 区云 南 大 学 附 属 中 学 星 耀 校 区云 南 大 学 附 属 中 学 星 耀 校 区2017-20182017-2018学年下学期中青年教
2、师课堂教学竞赛学年下学期中青年教师课堂教学竞赛青青青青社社A地地B地地根据背景知识根据背景知识 提出假设提出假设尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细土壤中的细菌将尿素菌将尿素分解成氨分解成氨之后才能被植物利用之后才能被植物利用。提出假设？提出假设？设计实验方案？设计实验方案？CO(NHCO(NH2 2)2 2 2 2脲酶脲酶+CO+CO2 2NHNH3 3+H+H2 2OOA地土壤中尿素分解菌比地土壤中尿素分解菌比B地多地多分别分离出分别分离出A地和地和B地土壤地土壤中尿素分解菌，并进行计数比较中尿素分解菌，并进行计数比较课题课题2土壤中分解尿素的细菌土壤中分解尿素的
3、细菌的分离和计数的分离和计数一、筛选菌株一、筛选菌株利用尿素分解菌的什么特点将它们从土壤众多利用尿素分解菌的什么特点将它们从土壤众多的微生物中分离出来？培养基应该怎样配制？的微生物中分离出来？培养基应该怎样配制？选择培养基选择培养基 KHKHKHKH2 2 2 2POPOPOPO4 4 4 4NaNaNaNa2 2 2 2HPOHPOHPOHPO4 4 4 4MgSOMgSOMgSOMgSO44447H7H7H7H2 2 2 2O OO O葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖尿素尿素尿素尿素琼脂琼脂琼脂琼脂KHKHKHKH2 2 2 2POPOPOPO4 4 4 4NaNaNaNa2 2 2 2HPOHP
4、OHPOHPO4 4 4 4MgSOMgSOMgSOMgSO44447H7H7H7H2 2 2 2OOOO葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖牛肉膏牛肉膏牛肉膏牛肉膏琼脂琼脂琼脂琼脂KHKHKHKH2 2 2 2POPOPOPO4 4 4 4NaNaNaNa2 2 2 2HPOHPOHPOHPO4 4 4 4MgSOMgSOMgSOMgSO44447H7H7H7H2 2 2 2OOOO葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖 123请同学数出菌落数目请同学数出菌落数目二、统计菌落数目二、统计菌落数目二、统计菌落数目二、统计菌落数目采用什么接种方式？采用什么接种方式？稀释涂布平板法稀释涂布平板法平板划线法平板划线法 取取0
5、.1mL稀释后的土壤浸出液涂布平板，稀释后的土壤浸出液涂布平板，数出数出84个菌落，判断以下说法正确吗？个菌落，判断以下说法正确吗？1平板上有平板上有84个尿素分解菌个尿素分解菌20.1mL稀释液中有稀释液中有84个个尿素分解菌尿素分解菌30.1mL稀释液稀释液中可能略多于中可能略多于84个尿素分解菌个尿素分解菌活菌计数活菌计数法法（间接计数法间接计数法/稀释涂布平板法）稀释涂布平板法）统计菌落数目练习统计菌落数目练习1.（2014全国卷全国卷II）将将1mL水样稀释水样稀释100倍，在倍，在3个平个平板上用涂布法分别接入板上用涂布法分别接入0.1mL稀释稀释液液，经经适当培养后，适当培养后，
6、3个平板上的菌落数分别为个平板上的菌落数分别为39、38和和37，据此可得出，据此可得出每升水样中的活菌数为每升水样中的活菌数为 _总结计算公式总结计算公式：3.8107个个某稀释度平板平均某稀释度平板平均菌落菌落数数 所所用稀释液的用稀释液的体积体积 稀释稀释倍数倍数三、实验三、实验设计设计与小组成员讨论实验步骤与小组成员讨论实验步骤明确步骤后，讨论注意事项，每人至少列明确步骤后，讨论注意事项，每人至少列2条条土壤取样土壤取样和称量和称量梯度稀释梯度稀释制备培养基制备培养基涂布平板涂布平板培养培养 和计和计数数1土壤取样和称量土壤取样和称量背景背景知识：绝大多数细菌分布在距地表知识：绝大多数
7、细菌分布在距地表3-8cm土层土层分析实例分析实例，找出错误，找出错误还有哪些注意事项？还有哪些注意事项？1 1五点取样法五点取样法2 2铲去表层土铲去表层土3 3工具应该使用方便灭菌处理的小铁铲和信封工具应该使用方便灭菌处理的小铁铲和信封4火焰火焰旁称取土样，放入锥形瓶中，塞好棉塞旁称取土样，放入锥形瓶中，塞好棉塞2梯度稀释梯度稀释背景知识：土壤中不同微生物数量不同，测定细背景知识：土壤中不同微生物数量不同，测定细菌数量一般选用菌数量一般选用104、105、106倍倍的稀释液的稀释液分析实例：分析实例：104倍倍105倍倍106倍倍A地地难以数清以数清700550B地地1011521 1扩大
8、稀释范围扩大稀释范围103 107倍倍2 2选择菌落数在选择菌落数在30和和300之间之间3移液管、试管、移液管、试管、蒸馏水都应该蒸馏水都应该先灭菌先灭菌4移液管移液管移液后，移液后，应吹应吹吸三次，混匀吸三次，混匀3制备培养基和涂布平板制备培养基和涂布平板背景知识：背景知识：分析实例分析实例，找出，找出错误错误1 1先滴再涂先滴再涂2 2涂布器应该冷却涂布器应该冷却3 3涂布平板所有操作都应该在酒精灯火焰附近涂布平板所有操作都应该在酒精灯火焰附近4培养和计数培养和计数分析实例分析实例1实例实例2105倍倍24h48h72h平均平均值菌落数菌落数5410611090104倍倍1个平板个平板1
9、05倍倍1个平板个平板106倍倍1个平板个平板A地地403多种形多种形态菌落菌落281121 1平行重复原则平行重复原则2 2每隔每隔24h统计一次，选取菌落稳定时作为结果统计一次，选取菌落稳定时作为结果实例实例34培养和计数培养和计数1对照原则对照原则106倍倍平均菌落数平均菌落数小李小李38454743小小张267280250266小张小张小李小李小王小王小胡小胡小彭小彭杂菌污染？杂菌污染？预期实验结果和结论预期实验结果和结论预期实验结果预期实验结果预期实验结论预期实验结论帮青青社想办法？帮青青社想办法？A地地B地地A地土壤样品中分离得到的尿素地土壤样品中分离得到的尿素分解菌菌落数比分解菌
10、菌落数比B地多地多A地土壤中尿素分解菌比地土壤中尿素分解菌比B地多地多鉴定鉴定酚酞酚酞pH8.2-10.0，由，由无色至无色至红色红色酚红酚红pH范围范围6.8-8.0，由，由黄到红黄到红幽门幽门螺杆螺杆菌检测菌检测1414CO(NHCO(NH2 2)2 2脲酶脲酶+1414COCO2 2NHNH3 3+H+H2 2OOCO(NHCO(NH2 2)2 2脲酶脲酶+COCO2 2NHNH3 3+H+H2 2OO 一、筛选菌落一、筛选菌落 选择培养基选择培养基二、统计菌落数目二、统计菌落数目 稀释涂布平板法稀释涂布平板法三、实验设计三、实验设计 无菌操作无菌操作 对照对照 平行重平行重复原则复原则
11、 小结练习1.2008年加拿大媒体报道：年加拿大媒体报道：16岁的高中生丹尼尔岁的高中生丹尼尔伯德从土壤伯德从土壤中找到了一类假单胞杆菌，能将聚乙烯塑料的自然降解过程中找到了一类假单胞杆菌，能将聚乙烯塑料的自然降解过程缩短至缩短至3个月，而且分解产物只有水和二氧化碳。伯德也因个月，而且分解产物只有水和二氧化碳。伯德也因此被誉为此被誉为“塑料袋的克星塑料袋的克星”。以下是伯德寻找到聚乙烯降解菌。以下是伯德寻找到聚乙烯降解菌的大致过程，请回答：的大致过程，请回答：（l）根据你的生活经验推测，伯德这项研究的）根据你的生活经验推测，伯德这项研究的“土壤样品土壤样品”最最可能取自于可能取自于。垃圾场垃圾
12、场（2）图中）图中“”表示对土壤悬浮液进行一系列的表示对土壤悬浮液进行一系列的_，目目的的是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在在号培养基表面形成单个号培养基表面形成单个_。（3）I号培养基属于号培养基属于_培养基，其作用是使目的菌培养基，其作用是使目的菌能能“脱颖而出脱颖而出”。图中采用的接种方法为。图中采用的接种方法为_。（4）使用）使用号培养基的目的是使目的菌数目增多，培养基号培养基的目的是使目的菌数目增多，培养基中必须包含水、无机盐、中必须包含水、无机盐、_、_等基本营养成等基本营养成分，从物理性质来看，分，从物理性质来看，号培养基中
13、不能添加号培养基中不能添加_。练习梯度稀释梯度稀释菌落菌落选择选择稀释涂布平板法稀释涂布平板法碳源碳源氮氮源源琼脂琼脂2.反刍动物反刍动物瘤胃内栖息着许多以尿素为唯一氮源的瘤胃内栖息着许多以尿素为唯一氮源的微生物微生物。（1）这些微生物能分解尿素是因为它们能合成这些微生物能分解尿素是因为它们能合成 。从从瘤胃中分离这些微生物必须先制备以瘤胃中分离这些微生物必须先制备以 为唯一碳源为唯一碳源的培养基的培养基,采用采用 灭菌灭菌，采用，采用 法法接种接种。（2）在在适宜条件下培养一段时间后观察其中一个平板的菌适宜条件下培养一段时间后观察其中一个平板的菌落分布如图所示，推测该同学接种时可能的操作失误是落分布如图所示，推测该同学接种时可能的操作失误是 ，如果发现每个平板中菌落形态多样，其原因可，如果发现每个平板中菌落形态多样，其原因可能是能是 。练习脲酶脲酶尿素尿素高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌稀释涂布平板法稀释涂布平板法尿素分解菌的种类较多，或尿素分解菌的种类较多，或者操作过程污染了杂菌者操作过程污染了杂菌涂布不均匀涂布不均匀谢谢！