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1、课题背景课题背景1 1、关于尿素、关于尿素 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。但是它但是它不能直不能直接接被农作物被农作物吸收。吸收。只有当土壤中的细菌将尿素只有当土壤中的细菌将尿素分分解成氨解成氨之后才能被植物利用。之后才能被植物利用。2 2、细菌分解尿素的原因、细菌分解尿素的原因脲酶脲酶土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2)2 2脲酶脲酶+CO+CO2 2NHNH3 3+H2O第1页/共29页 课题目的：课题目的：一、从土壤中分离出能够分解尿素的细菌一、从土壤中分离出能够分解尿素的细菌二、统计每克土壤样
2、品中究竟含有多少这样的细二、统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌菌第2页/共29页一、如何从土壤中分离出能够分解尿素的一、如何从土壤中分离出能够分解尿素的细菌？细菌？土壤有“微生物的天然培养基”之称。同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。尤其是在富含有机质的土壤中，有更多的微生物。而这些微生物中只有一小部分能够分解尿素。那么如何能从众多的微生物中筛选出能够分解尿素的细菌呢？第3页/共29页资料一：资料一：思考：思考：思考：思考：1 1 1 1、科学家为什么能从热泉中筛选出耐高温的、科学家为什么能从热泉中筛选出耐高温的、科学家为什么能从热泉中筛选出耐高温的、科学家为什么能从
3、热泉中筛选出耐高温的TaqTaqTaqTaq细菌？细菌？细菌？细菌？DNADNADNADNA多聚酶链式反应（多聚酶链式反应（PCRPCRPCRPCR）是）是一种在体外将少量一种在体外将少量DNADNADNADNA大量复制的技大量复制的技术，而此项技术的实施必须使用耐术，而此项技术的实施必须使用耐高温（高温（939393930 0 0 0C C C C）的）的DNADNADNADNA聚合酶。聚合酶。美国微生物学家托马斯美国微生物学家托马斯 布鲁克于布鲁克于19661966年在美国黄石年在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了水生耐热细菌国家公园的一个热泉中发现了水生耐热细菌TaqTaq，并从，并从它
4、体内分离出了耐高温的它体内分离出了耐高温的TaqDNATaqDNA聚合酶。聚合酶。因为热泉温度为因为热泉温度为70707070808080800 0 0 0C C C C，淘汰了绝大多数微生物只，淘汰了绝大多数微生物只有有TaqTaqTaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。第4页/共29页启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。2、从上述资料中你能得到什么启示？第5页/共29页 实验室中微生物的筛选，也是应用同样的原理：即人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pHpH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。也就是利用选择培养基筛选出你想要的目的菌株。比
5、如：比如：不加氮源的培养基不加氮源的培养基固氮菌固氮菌 不加碳源的培养基不加碳源的培养基自养微生物自养微生物 加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 允许特定种类的微生物生 长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。第6页/共29页以以尿素为唯一氮源尿素为唯一氮源的培养基的培养基能够分离尿素的能够分离尿素的细菌细菌 只有能分解尿素的细菌才能分解尿素，以尿素作为氮只有能分解尿素的细菌才能分解尿素，以尿素作为氮只有能分解尿素的细菌才能分解尿素，以尿素作为氮只有能分解尿素的细菌才能分解尿素，以尿素作为氮源。而不能分解尿素的微生物由于不能分解尿素，缺乏源。而不能分
6、解尿素的微生物由于不能分解尿素，缺乏源。而不能分解尿素的微生物由于不能分解尿素，缺乏源。而不能分解尿素的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而无法生长繁殖，所以用此培养基就能够选择出能氮源而无法生长繁殖，所以用此培养基就能够选择出能氮源而无法生长繁殖，所以用此培养基就能够选择出能氮源而无法生长繁殖，所以用此培养基就能够选择出能够分解尿素的细菌。够分解尿素的细菌。够分解尿素的细菌。够分解尿素的细菌。思考：思考：什么样的培养基能选择培养出能够分离尿素的细什么样的培养基能选择培养出能够分离尿素的细菌呢？菌呢？第7页/共29页思考：思考：思考：思考：1 1、该培养基中有哪些成分？它们分别为微生物生长提供该
7、培养基中有哪些成分？它们分别为微生物生长提供了什么营养？了什么营养？2 2 2 2、从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上看、从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上看、从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上看、从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上看属于哪属于哪类？类？第8页/共29页1 1、显微镜直接计数法显微镜直接计数法全部全部细菌数细菌数 利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。里样品中微生物的数量。统计菌落数目的方法：二、如何统计每克土壤样品中究竟含有多少二、如何统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌？这样的细菌？2 2、稀释
8、涂布平板法活菌数（最常用）3 3、滤膜法第9页/共29页计算方法：每克样品中的菌落数(CV)M(CV)M 其中，其中，C C C C某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V V V V涂布平板时所用的稀释液的体积涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)(ml)(ml)(ml)，M M M M稀释倍数。稀释倍数。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。原理：稀释涂布平板法：第10页/共29页注意事项：为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板进行计数。
9、设置重复组：为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的培养皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。设置对照组：将不加土样的培养基置于相同条件下进行培养，作为空白对照。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。第11页/共29页讨论题1 1：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为10106 6的培养基中，得到以下两种统计结果。1 1、第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230230。2 2、第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统计的菌落数分别为2121、212212、256256，该同学以这三个
10、平板上菌落数的平均值163163作为统计结果。分析：你认为哪位同学的结果更接近真实值？你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？甲只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。乙有一个平板与另外两个平板相差很大，说明操作过程可能有误，必须重做实验。1、实验时必须设置重复组，至少要涂布3个平板。2、分析结果时，一定要考虑所设置的重复组结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重做实验。第12页/共29页讨论题2 2：在做本课题的实验时，A A 同学从对应10106 6倍稀释的培养基中筛选出大约150150个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选择出大约5050个菌落。
11、其他同学认为A A同学的结果有问题。他们分析可能是A A同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。但是，A A同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学的结果之所以不相同，是因为自己所选用的土壤样品不同。但是，A A同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿了不出令人信服的证据。分析：你能通过设置对照，帮助A A同学学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？第13页/共29页 通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A A同学相同土样进行实验 方案二：将A A同学配制的培养基在不
12、加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。如果结果与A A同学一致，则证明A A无误；如果结果不同，则证明A A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰第14页/共29页三.实验的具体操作 （一）（一）.土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。（二）（二）.制备培养基制备培养基 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基和牛肉膏蛋白胨固体培养基。筛选出能够分解尿素
13、的细菌与选择培养基作对照，检测选择培养基是否具有选择作用第15页/共29页应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行 分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度 一般分离土壤中细菌，选用一般分离土壤中细菌，选用10104 4、10105 5、10106 6倍的稀释度 分离土壤中放线菌，选用分离土壤中放线菌，选用10103 3、10104 4、10105 5倍的稀释度 分离土壤中真菌，选用分离土壤中真菌，选用10102 2、10103 3、10104 4倍的稀释度
14、 第一次实验可将稀释度放宽一点，选择10103 310107 7（三）样品的稀释（三）样品的稀释第16页/共29页思考：思考：为为什什么么分分离离不不同同的的微微生生物物要要采采用用不不同同的的稀稀释释度度？测测定定土土壤壤中中细细菌菌的的总总量量和和测测定定土土壤壤中中能能分分解解尿尿素素的的细细菌菌的的数量，选用的稀释范围相同吗？数量，选用的稀释范围相同吗？原因：不同微生物在土壤中的含量不同。目的：保证能从中选择出菌落数在30300间的平板进行计数。第17页/共29页（四）（四）.取样涂布取样涂布实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。如果得到了如果得到了2
15、2 2 2个或个或2 2 2 2个以上个以上菌落数目在菌落数目在30300303003030030300的平板，的平板，则则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验操作有误，需要重新实验。验操作有误，需要重新实验。第18页/共29页（五）（五）.微生物的培养与观察微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防
16、止因培养以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。时间不足而导致遗漏菌落的数目。不同的微生物会表现出不同的菌落特征，包括菌落的形不同的微生物会表现出不同的菌落特征，包括菌落的形状、大小、颜色和隆起程度等等。状、大小、颜色和隆起程度等等。这也是区别不同微生物这也是区别不同微生物的关键。的关键。培养不同微生物往往需要不同培养温度和时间。培养不同微生物往往需要不同培养温度和时间。细菌：细菌：3030303037373737培养培养1 1 1 12d2d2d2d 放线菌：放线菌：2525252528282828培养培养5 5 5 57d7d7d7d 霉菌：霉菌：2525252528282828培养培养
17、3 3 3 34d4d4d4d。第19页/共29页第20页/共29页四、结果分析与评价1.1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落：对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。2.2.样品的稀释操作是否成功：如果得到了2 2个或2 2个以上菌落数目在3030300300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。3.3.重复组的结果是否一致：如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，则可能操作有误，需要重做试验。第21页/共29页五、操作提示
18、五、操作提示 无菌操作无菌操作 做好标记做好标记 规划时间规划时间 第22页/共29页六.课外延伸菌种的进一步鉴定：细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pHpH升高。那么我们就可以在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂变红，说明该细菌能够分解尿素。加入酚红指示剂的培养基从功能上划分属于什么培养基？第23页/共29页滤膜法：滤膜法：测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红美蓝培的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红美蓝培养基上培养，大肠杆菌养基上培养，大
19、肠杆菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记数得，通过记数得出水样中大肠杆菌的数量。出水样中大肠杆菌的数量。大肠杆菌呈大肠杆菌呈大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心黑色中心黑色中心 ,有或无金属光泽有或无金属光泽有或无金属光泽有或无金属光泽伊红美蓝培养基从功能上划分属于什么培养基？第24页/共29页练习1 1、需要在火焰旁操作的有（）土壤取样称取土壤稀释土壤溶液涂布平板 微生物的培养 A A B B C C D D2 2、在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是（）A.A.筛选出能分解尿素的细菌 B B培养基中缺乏酚红指示剂作细菌的营养 C C对分离的菌种作进一步的鉴定 D D如指示剂变
20、蓝就能准确认定该菌能分解尿素3 3、测定土壤中细菌数量一般选用10104 4、10105 5和10106 6倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用10102 2、10103 3和10104 4倍稀释，其原因是()A A细菌个体小，真菌个体大 B B细菌易稀释，真菌不易稀释C C细菌在土壤中数量比真菌多 D D随机的，没有原因4 4、分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是()加尿素不加尿素加琼脂不加琼脂加葡萄糖不加葡萄糖加硝酸盐不加硝酸盐A A B B C C D D第25页/共29页5 5.下列说法不正确的是（）A.A.科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的TaqDNAT
21、aqDNA聚合酶 B.B.统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以M3M3作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。6 6、实验测定链霉素对3 3种细菌的抗生素效应，用3 3种细菌在事先准备好的琼脂平板上画3 3条等长的平行线(3(3条线均与图中的链霉素带接触)，将平板置于37 37 条件下恒温培养3 3天，结果如图所示。从实验结果分析，以下叙述不正确的是()A A链霉素能阻止结核菌的生长 B B链霉素
22、对结核菌比对霍乱菌更有效C C链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效 D链霉素可以用于治疗伤寒病人第26页/共29页7 7、用来判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置的对照是()A A未接种的选择培养基B B未接种的牛肉膏蛋白胨培养基C C接种了的牛肉膏蛋白胨培养基D D接种了的选择培养基8 8、下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述中，错误的是()A A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B B取10104 4、10105 5、10106 6倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL0.1 mL，分别涂布于各组平板上C C将实验组和对照组平板倒置，37 37 恒温培养242
23、448h48hD D确定对照组无菌后，选择菌落数在300300以上的实验组平板进行计数9 9、某同学从稀释度为10103 3倍的稀释液中各取了0.1mL0.1mL土壤菌液涂布到三个平板上得到菌落数分别为200200、215215、210210。求每克土壤样品中的菌落数为_。第27页/共29页1010、人和哺乳动物的尿中含有尿素，大量尿素的存在会对环境造成污染土壤中有些细菌含有脲酶，可通过降解尿素作为其生长的氮源现对土壤中的这类细菌进行分离实验，请回答下列问题：（1 1）分离培养细菌时必须进行无菌操作，包括培养基和各种器皿都必须是无菌的，常用的灭菌方法有、和（2 2）将样液进行一系列的梯度稀释，然后接种培养在稀释土壤溶液的过程中每一步都要在旁进行操作接种后的培养皿_于3737的中培养（3 3）用含有酚红指示剂的培养基筛选能分泌脲酶的细菌，从功能上划分该培养基属于培养基若培养基中存在有分解尿素的细菌，其菌落周围会出现红色环带，这是由于尿素被分解产生的使pHpH升高，酚红指示剂产生的颜色变化，从而证明这一菌株可以以尿素为氮源变色区域越大，表明该菌株利用尿素的能力（4 4）与全营养培养基中的菌落相比，以尿素为氮源的培养基中菌落数A A多 B B少 C C相等 D D几乎为零第28页/共29页感谢您的观看！第29页/共29页