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1、质粒的提取质粒的提取(碱法碱法)分子生物学基本技术（一）分子生物学基本技术（一）三峡大学生物化学教研室三峡大学生物化学教研室实验目的w了解碱法提取质粒的原理；了解碱法提取质粒的原理；w掌握碱法提取质粒的方法。掌握碱法提取质粒的方法。一实验背景一实验背景w质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。w大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。w其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。质粒特点w质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。w质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到
2、雌性体，是细菌有性繁殖的性因子.w年由Lederburg正式命名为质粒。结构的三大要素：结构的三大要素：多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ）独立的复制单位种类：种类：质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC）反转录病毒载体 表达载体等质粒类型w质粒按复制方式分为两种类型：质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒松弛型质粒 和和 严紧型质粒严紧型质粒w1.松弛型质粒松弛型质粒 松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。质合成受抑制，质粒
3、的复制依然进行。w严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。2.严紧型质粒严紧型质粒质粒的应用w大多数基因工程使用松弛型质粒。w严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。w质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。质粒提取的思路质粒提取的思路w质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNADNAw要去除的物质：要去除的物质：蛋白蛋白基因组基
4、因组DNADNA脂类及小分子杂质脂类及小分子杂质RNA RNA 分离质粒DNA方法w从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的w碱变性法；w煮沸法；wSDS法；w 羟基磷灰石层析法等w各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。碱变性法基本原理w在碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。w将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通
5、过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。原理示意原理示意图 返回目录 返回原理三个基本步三个基本步骤：细菌的生菌的生长和和质粒的粒的扩增增菌体的收集裂解及菌体的收集裂解及质粒粒DNA的分离的分离质粒粒DNA的的纯化化实验试剂实验试剂w培养基：培养基：胰化蛋白胨胰化蛋白胨 10g酵母提取物酵母提取物 5g 定容定容 1000ml pH 7.5NaCl 10gw：0.1M NaCl10mM Tris HCl(pH8.0)1mM EDTAw 50mg/mlw溶菌酶溶菌酶 10mg/ml(用用10mM TrisHCl pH8.
6、0新鲜配制）新鲜配制）试剂w溶液溶液：50mM 葡萄糖葡萄糖25mM TrisHCl（pH8.0）10mM EDTAw溶液溶液：（新鲜配制）：（新鲜配制）0.2N NaOH1%SDSw溶液溶液：5M KAC 10ml冰醋酸冰醋酸 11.5ml水水 28.5mlw酚，氯仿，乙醇酚，氯仿，乙醇 RNase 琼脂糖琼脂糖w：10mM Tris-HCl(pH8.0)1mM EDTA实验仪器（一）（一）仪器仪器 1.恒温摇床 2.超净工作台 3.高压灭菌锅 4.高速台式离心机 5.微量取液器 InsertEcoR1Xho11.9kb三实验方法三实验方法w挑取琼脂培养板上的单菌落至挑取琼脂培养板上的单菌落
7、至5ml LB培养液中（含培养液中（含AmP 50g/ml），），强烈摇荡过度。强烈摇荡过度。w取取1.5ml培养液至培养液至Eppendorf管中，管中，12000g离心离心30秒，秒，弃上清，用弃上清，用ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀。一次，弃上清，取沉淀。w将细菌沉淀悬浮于将细菌沉淀悬浮于100l预冷溶液预冷溶液中，振荡混匀，冰中，振荡混匀，冰上放置上放置5分钟。分钟。w加入加入200l溶液溶液，盖严管盖轻柔颠倒次以混匀内容，盖严管盖轻柔颠倒次以混匀内容物，冰上放置物，冰上放置5分钟。分钟。w加入加入150l溶液溶液，温和
8、振荡数次，冰上放置分钟。，温和振荡数次，冰上放置分钟。w12000g 4 离心分钟，取上清移到个新的离心分钟，取上清移到个新的Eppendorf管中。管中。w(加入等体积酚加入等体积酚/氯仿（：），振荡混匀，氯仿（：），振荡混匀，12000g 4 离心分钟。取上清移至另个离心分钟。取上清移至另个Eppendorf管中。管中。)w加入倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置加入倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。分钟。w g,4 离心分钟。离心分钟。w弃上清，加入弃上清，加入ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，倒数次，000g 于于4 离心分钟。离心分钟。w弃上清，抽干乙醇，室温干燥（弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。分钟）。w加入加入50l TE（含（含20g/ml RNA 酶，不含酶，不含DNA酶）酶）溶解溶解DNA。四结果分析四结果分析w质粒DNA OD260,OD280的值，由此计算质粒DNA得率和纯度。w记录电泳结果并说明结果内容。问题与讨论：w简要叙述溶液、溶液和溶液的作用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因。w简要叙述酚氯仿抽提体系后出现的现象及其成因。w3.沉淀时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行？