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1、关于分子生物学基本技术定稿第一张，PPT共六十二页，创作于2022年6月第一节第一节 分子杂交分子杂交Section 1 Molecular Hybridization第二张，PPT共六十二页，创作于2022年6月一、核酸分子杂交一、核酸分子杂交 1.核酸分子杂交基本原理核酸分子杂交基本原理核酸变性与复性核酸变性与复性 核酸变性核酸变性(denaturation)：由于外界因素影响，使核酸分：由于外界因素影响，使核酸分子的空间结构改变，并引起核酸理化性质和生物学功能发子的空间结构改变，并引起核酸理化性质和生物学功能发生改变的现象。其本质是维持核酸空间结构的氢键和生改变的现象。其本质是维持核酸空
2、间结构的氢键和/或或碱基堆积力受到破坏。碱基堆积力受到破坏。核酸复性核酸复性(renaturation)：变性核酸在适当条件下根据碱：变性核酸在适当条件下根据碱基配对原则重新恢复空间结构的过程。复性可使核酸的基配对原则重新恢复空间结构的过程。复性可使核酸的理化性质得到恢复。理化性质得到恢复。第三张，PPT共六十二页，创作于2022年6月变性变性复性复性DNA的变性与复性的变性与复性第四张，PPT共六十二页，创作于2022年6月 核酸变性因素：核酸变性因素：加热加热 pH 有机溶剂有机溶剂(如乙醇、尿素、甲酰胺、丙酰胺等如乙醇、尿素、甲酰胺、丙酰胺等)等等 核酸复性因素：核酸复性因素：核酸序列复
3、杂程度：越简单复性越快核酸序列复杂程度：越简单复性越快 核酸片段的大小：越小复性越快核酸片段的大小：越小复性越快 核酸浓度：浓度越高复性越快核酸浓度：浓度越高复性越快 离子强度：强度越高复性越快离子强度：强度越高复性越快第五张，PPT共六十二页，创作于2022年6月 增色效应增色效应(hyperchromic effect)：核酸变性时，由于碱基外露：核酸变性时，由于碱基外露使使260nm处的紫外吸收值增加，这种现象称为增色效应。反之，处的紫外吸收值增加，这种现象称为增色效应。反之，称为称为减色效应减色效应(hypochromic effect)。不同来源不同来源DNA热变性时的增色效应热变性
4、时的增色效应7080901001.01.21.4A260nm温度()肺炎球菌肺炎球菌(38%G+C)大肠杆菌大肠杆菌(52%G+C)粘质沙雷菌粘质沙雷菌(58%G+C)草分枝杆菌草分枝杆菌(66%G+C)第六张，PPT共六十二页，创作于2022年6月 熔解温度熔解温度(melting temperature，Tm)：指：指50 DNA双链变双链变性时的温度，也称解链温度或变性温度。此时溶液的紫外吸性时的温度，也称解链温度或变性温度。此时溶液的紫外吸收值达到最大值的一半。收值达到最大值的一半。DNA的热变性的热变性变变性性比比率率()501000758085温度温度()TmTm第七张，PPT共六
5、十二页，创作于2022年6月 影响影响Tm值的因素：值的因素：DNA的均一性的均一性 均一均一DNA解链温度范围较不均一解链温度范围较不均一DNA窄窄 DNA中的中的G+C含量含量 Tm69.30.41x(G+C)x(G+C)为为(G+C)的摩尔分数的摩尔分数 溶剂的性质溶剂的性质 离子强度低，离子强度低，Tm较低，且溶解温度范围窄较低，且溶解温度范围窄第八张，PPT共六十二页，创作于2022年6月 核酸分子杂交核酸分子杂交(hybridization)：两个不同来源、具有互补碱：两个不同来源、具有互补碱基序列的单链核酸分子形成双链核酸分子的过程。基序列的单链核酸分子形成双链核酸分子的过程。混
6、合后复性混合后复性核酸杂交核酸杂交杂合双链杂合双链第九张，PPT共六十二页，创作于2022年6月 退火退火(annealing)：DNA在热变性后，经缓慢冷却，并将在热变性后，经缓慢冷却，并将温度维持在一定范围温度维持在一定范围(一般比一般比Tm低低2530左右左右)时，单时，单链链DNA可重新恢复双链结构。可重新恢复双链结构。2.核酸分子杂交中的探针核酸分子杂交中的探针(probe)(1)核酸探针核酸探针的概念的概念 能与特定的靶分子能与特定的靶分子(DNA或或RNA)发生特异性结合的发生特异性结合的核酸分子。核酸分子。第十张，PPT共六十二页，创作于2022年6月(2)核酸探针的种类与应用
7、核酸探针的种类与应用 据探针的来源和性质：基因组据探针的来源和性质：基因组DNA探针、探针、cDNA探针、探针、RNA探针及寡核苷酸探针。探针及寡核苷酸探针。探针应用原则：探针与被检测的目的核酸之间在核苷探针应用原则：探针与被检测的目的核酸之间在核苷酸序列上要具有高度的特异性。酸序列上要具有高度的特异性。基因组基因组DNA探针探针 根据实验目的选择基因组中的一段根据实验目的选择基因组中的一段DNA序列，并将此序列，并将此DNA序序列克隆至工程菌经扩增后可获得大量探针。列克隆至工程菌经扩增后可获得大量探针。第十一张，PPT共六十二页，创作于2022年6月 cDNA探针探针 cDNA(comple
8、mentary DNA)：以：以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录产生的能与模板互补的录产生的能与模板互补的DNA链。链。cDNA 探针无内含子，尤适用于基因表达的检测。探针无内含子，尤适用于基因表达的检测。RNA探针探针 通常利用体外转录体系，以通常利用体外转录体系，以cDNA为模板制备。为模板制备。优点是探针为单链，具有很高的杂交效率。优点是探针为单链，具有很高的杂交效率。缺点是缺点是RNA易于降解，标记方法复杂。易于降解，标记方法复杂。第十二张，PPT共六十二页，创作于2022年6月 寡核苷酸探针寡核苷酸探针 在体外经人工合成的单链在体外经人工合成的单链DNA分子，可与靶分子中的一分
9、子，可与靶分子中的一段序列互补。段序列互补。(3)核酸探针的标记核酸探针的标记 标记物标记物 同位素标记物：同位素标记物：32P、3H、35S、14C、125I、131I。非放射性标记物：地高辛、生物素和荧光素。非放射性标记物：地高辛、生物素和荧光素。第十三张，PPT共六十二页，创作于2022年6月32P及及35S标记的标记的NTP结构图结构图4LidUTP连接臂连接臂敏感性酯键敏感性酯键地高地高辛甾辛甾醇半醇半抗原抗原Dig-dUTP第十四张，PPT共六十二页，创作于2022年6月 .用用T4多核苷酸激酶进行末端标记多核苷酸激酶进行末端标记 .切口平移法切口平移法 .随机引物法随机引物法 .
10、粘性末端法粘性末端法 .聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)法法 标记方法标记方法(4)标记探针的检测标记探针的检测 放射自显影技术放射自显影技术 免疫法检测免疫法检测第十五张，PPT共六十二页，创作于2022年6月3.核酸杂交常用方法核酸杂交常用方法(1)Southern 杂交杂交(Southern blotting)也称也称Southern印迹，由印迹，由E.M.Southern发明，本质发明，本质 为为DNA-DNA杂交，基本过程为：杂交，基本过程为：限制酶限制酶消化消化电泳电泳强碱强碱变性变性转膜转膜杂交杂交洗膜洗膜曝光或曝光或显色显色第十六张，PPT共六十二页，创作于2022年6月重物
11、重物吸水纸吸水纸膜膜凝胶凝胶塑料膜塑料膜滤纸滤纸缓冲液缓冲液固相支持物固相支持物杂交杂交洗膜洗膜曝光曝光Southern杂交图解杂交图解限制酶消化限制酶消化凝胶电泳凝胶电泳第十七张，PPT共六十二页，创作于2022年6月植植物物限限制制酶酶消消化化图图谱谱DNA第十八张，PPT共六十二页，创作于2022年6月Dig标记探针的杂交结果标记探针的杂交结果第十九张，PPT共六十二页，创作于2022年6月放放射射自自显显影影照照片片第二十张，PPT共六十二页，创作于2022年6月(2)Northern杂交杂交(Northern blotting)也称为也称为Northern印迹，本质为利用印迹，本质为
12、利用DNA探针分析探针分析RNA样品，基本过程为：样品，基本过程为：分离纯分离纯化化RNA电泳电泳转膜转膜杂交杂交洗膜洗膜曝光或曝光或显色显色变性变性第二十一张，PPT共六十二页，创作于2022年6月在在生生物物芯芯片片(biochip)中中采采用用光光导导原原位位合合成成或或微微量量点点样样等等方方法法，将将大大量量生生物物大大分分子子有有序序地地固固化化于于支支持持物物表表面面，组组成成密密集集二二维维分分子子排排列列，然然后后与与已已标标记记的的待待测测生生物物样样品品中中靶靶分分子子杂杂交交，通通过过特特定定的的仪仪器器对对杂杂交交信信号号的的强强度度进进行行快快速速、并并行行、高高效
13、效地地检检测测分分析析，从从而而判判断断样样品品中中靶靶分分子子的的数数量量。此类技术又被统称为微阵列。此类技术又被统称为微阵列。(3)微阵列微阵列(microarray)第二十二张，PPT共六十二页，创作于2022年6月DNA微阵列实验流程图：微阵列实验流程图：阵列的制作阵列的制作(将确认后的序列自动将确认后的序列自动印制在载玻片或膜上印制在载玻片或膜上)靶标的制备靶标的制备(样品的提取与标记样品的提取与标记)杂交杂交扫描扫描检测检测结果结果分析分析DNA微微阵阵列列(芯芯片片)的的应应用用：新新基基因因发发现现、基基因因诊诊断、药物筛选、个性化给药断、药物筛选、个性化给药第二十三张，PPT
14、共六十二页，创作于2022年6月酵母酵母在孢在孢子形子形成期成期基因基因表达表达分析分析第二十四张，PPT共六十二页，创作于2022年6月(4)原位杂交原位杂交(in situ hybridization)在细胞和组织内的原始位置进行杂交检测，靶序列无需分离在细胞和组织内的原始位置进行杂交检测，靶序列无需分离或纯化。或纯化。包括染色体原位杂交和组织原位杂交两类。包括染色体原位杂交和组织原位杂交两类。通常用于定位胞浆内通常用于定位胞浆内mRNA，分析基因表达。，分析基因表达。基本步骤：基本步骤：组织切片组织切片杂交杂交洗涤洗涤显微观察显微观察第二十五张，PPT共六十二页，创作于2022年6月 染
15、色体原位杂交是在染色体上定位基因或DNA序列：染色体显染色体显微片微片(干燥干燥)除除RNA和蛋白质和蛋白质变性变性DNA洗涤洗涤观察分析观察分析杂交杂交第二十六张，PPT共六十二页，创作于2022年6月4.核酸分子杂交的应用：核酸分子杂交的应用：核酸杂交遵循碱基配对原则，决定了核酸杂交的特异性；此外核酸杂交遵循碱基配对原则，决定了核酸杂交的特异性；此外核酸杂交可以在核酸杂交可以在DNA与与DNA、DNA与与RNA及及RNA与与RNA之之间进行，间进行，(1)基因表达检测基因表达检测 (2)从基因组文库或从基因组文库或cDNA文库中筛选特定克隆文库中筛选特定克隆 (3)基因在染色体中的定位基因
16、在染色体中的定位 (4)疾病诊断等疾病诊断等第二十七张，PPT共六十二页，创作于2022年6月二、其它分子杂交技术二、其它分子杂交技术 1.蛋白质印迹蛋白质印迹(Western blotting)又称免疫印迹又称免疫印迹(immunoblotting)，其原理是抗原抗体的，其原理是抗原抗体的特异性结合。特异性结合。基本步骤：基本步骤：电泳分离电泳分离蛋白样品蛋白样品电转膜电转膜与一抗反应与一抗反应与二抗反应与二抗反应显色反应显色反应第二十八张，PPT共六十二页，创作于2022年6月 二抗可用酶、生物素或荧光物质进行标记。二抗可用酶、生物素或荧光物质进行标记。ELISA(Enzyme-Linke
17、d Immunosorbnent Assay)：是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种高度特与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种高度特异性试验分析技术。异性试验分析技术。第二十九张，PPT共六十二页，创作于2022年6月2.凝胶滞留法凝胶滞留法(gel retardation assay)又叫迁移率改变法又叫迁移率改变法(mobility shift assay)，是检测，是检测 DNA结结合蛋白的一种简单灵敏的方法。合蛋白的一种简单灵敏的方法。基本原理：蛋白质可与基本原理：蛋白质可与DNA形成复
18、合物，在进行形成复合物，在进行PAGE电电泳检测时，这些复合物比游离的泳检测时，这些复合物比游离的DNA慢很多形成一个滞后慢很多形成一个滞后带。带。第三十张，PPT共六十二页，创作于2022年6月第第 二二 节节 聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)Section 2 Polymerase Chain Reaction第三十一张，PPT共六十二页，创作于2022年6月一、一、PCR基本原理基本原理 是在热稳定是在热稳定DNA聚合酶催化下的体外聚合酶催化下的体外DNA合成的循环反合成的循环反应。应。PCR反应体系：反应体系：DNA模板、热稳定性模板、热稳定性DNA聚合酶、引物、聚合酶、引物、四种四
19、种dNTP和和Mg2。PCR反应三个基本过程：反应三个基本过程：(1)变性：利用高温变性：利用高温(95)使双链解开。使双链解开。(2)退火：在低温退火：在低温(2565)下使引物与模板配对。下使引物与模板配对。(3)延伸：在延伸：在72利用热稳定利用热稳定DNA聚合酶催化聚合酶催化DNA合成。合成。第三十二张，PPT共六十二页，创作于2022年6月模板模板DNA引物引物dNTPTaq DNA Pol变性变性退火退火延伸延伸PCR循环循环第三十三张，PPT共六十二页，创作于2022年6月 PCR反应三个基本过程可以不断循环，从而使体系内反应三个基本过程可以不断循环，从而使体系内DNA的量呈指数
20、增长。的量呈指数增长。变性变性退火退火延伸延伸变性变性退火退火延伸延伸循循环环1循循环环2经过多经过多轮轮PCR第三十四张，PPT共六十二页，创作于2022年6月二、二、PCR反应试剂反应试剂1.模板模板 (1)模板模板DNA用量少，一般使用用量少，一般使用102105拷贝拷贝 (2)有一定的纯度要求有一定的纯度要求 (3)对模板的序列有一定了解对模板的序列有一定了解2.引物引物 引物为一段寡核苷酸序列。引物为一段寡核苷酸序列。每条引物的典型浓度约每条引物的典型浓度约0.10.5mol/L第三十五张，PPT共六十二页，创作于2022年6月 引物设计一般原则：引物设计一般原则：(1)为待扩增序列
21、两端的已知序列为待扩增序列两端的已知序列 (2)长度一般为长度一般为18-30个寡核苷酸个寡核苷酸 (3)G+C含量合理：含量合理：4060%，Tm4(G+C)2(A+T)(4)在在3末端避免富含末端避免富含G或或C (5)避免引物二聚体的形成避免引物二聚体的形成 (6)避免引物形成发夹结构避免引物形成发夹结构 (7)在在5端可引入限制位点端可引入限制位点第三十六张，PPT共六十二页，创作于2022年6月3.DNA聚合酶聚合酶 热稳定性热稳定性DNA聚合酶，从嗜热菌可获得。聚合酶，从嗜热菌可获得。聚合酶的选择以实验目的为依据聚合酶的选择以实验目的为依据常用热稳定性常用热稳定性DNA聚合酶聚合酶
22、酶酶最佳温度最佳温度()外切酶活性外切酶活性保真度保真度Taq758053低低Tfl70低低Pfu727835 高高Deep Vent708035 高高Pwo606535高高 聚合酶的浓度通常为聚合酶的浓度通常为22.5U/100l。第三十七张，PPT共六十二页，创作于2022年6月4.dNTP 高浓度的高浓度的dNTP对扩增反应具有抑制作用，甚至引起对扩增反应具有抑制作用，甚至引起 聚合酶的错配，一般将浓度控制在聚合酶的错配，一般将浓度控制在200mol/L左右。左右。5.Mg2 Mg2浓度高会引起非特异性产物增加，浓度高会引起非特异性产物增加，Mg2浓度低，浓度低，会使聚合酶活性降低，一般
23、控制在会使聚合酶活性降低，一般控制在0.52.5mmol/L第三十八张，PPT共六十二页，创作于2022年6月6.pH缓冲体系缓冲体系 标准标准PCR体系常使用体系常使用10mmol/L的的Tris-HCl(pH8.3-8.8)缓冲体系，反应时由于温度升高体系的缓冲体系，反应时由于温度升高体系的pH值可回落值可回落 至至7.2左右。左右。7.一价阳离子一价阳离子 标准标准PCR体系常使用体系常使用50mM的的KCl，对于扩增，对于扩增500bp 以上的片段有利，调整至以上的片段有利，调整至70100mmol/L时，对扩增时，对扩增 较短片段有利。较短片段有利。第三十九张，PPT共六十二页，创作
24、于2022年6月三、三、PCR循环循环1.标准标准PCR循环循环 包括变性、退火和延伸三步：包括变性、退火和延伸三步：变性：变性：94-96退火：退火：55-65延伸：延伸：72重复重复2535次次第四十张，PPT共六十二页，创作于2022年6月2.PCR循环效率循环效率 与聚合酶活力直接相关：与聚合酶活力直接相关：Nf N0(1+Y)n Nf为为n次循环后的扩增序列拷贝数次循环后的扩增序列拷贝数 N0为靶序列的起始拷贝数为靶序列的起始拷贝数 Y为扩增效率，为扩增效率，n为循环数为循环数 若若Y100，则：，则：Nf N0 2n 当靶序列拷贝数达当靶序列拷贝数达1012时，聚合酶成为扩增限制时
25、，聚合酶成为扩增限制 性因素性因素第四十一张，PPT共六十二页，创作于2022年6月1.目的基因的克隆目的基因的克隆2.基因的体外突变基因的体外突变3.DNA和和RNA的微量分析的微量分析4.DNA序列测定序列测定5.基因突变分析基因突变分析四、四、PCR的主要应用的主要应用第四十二张，PPT共六十二页，创作于2022年6月五、反转录五、反转录PCR (Reverse transcription PCR，RT-PCR)1.RT-PCR过程过程以以RNA为模板，经逆转录产生为模板，经逆转录产生cDNA链，并用以进行常规链，并用以进行常规PCR。RNA cDNA dsDNA PCR第四十三张，PP
26、T共六十二页，创作于2022年6月正义引物正义引物更多更多PCR循环循环RNARNARNADNADNADNADNA反义引物反义引物第四十四张，PPT共六十二页，创作于2022年6月2.RT-PCR的应用的应用(1)定量分析定量分析mRNA，测定基因表达强度，测定基因表达强度(2)构建大容量的构建大容量的cDNA文库文库(3)鉴定已转录序列是否已经发生突变鉴定已转录序列是否已经发生突变第四十五张，PPT共六十二页，创作于2022年6月六、六、实时定量实时定量PCR(real time PCR)使用荧光试剂标记使用荧光试剂标记PCR产物，可对模板量产物，可对模板量(基因拷贝数基因拷贝数)和和PCR
27、产物进行定量分析，具有很好的可靠性。产物进行定量分析，具有很好的可靠性。实时定量实时定量PCR包括两种：包括两种：(1)通过插入荧光染料进行定量，如通过插入荧光染料进行定量，如SYBR Green (2)利用荧光标记的寡核苷酸探针进行定量，如利用荧光标记的寡核苷酸探针进行定量，如 TaqMan探针探针第四十六张，PPT共六十二页，创作于2022年6月SYBR与与 dsDNA 结合，在受到激发结合，在受到激发时，可发出绿色荧时，可发出绿色荧光。光。第四十七张，PPT共六十二页，创作于2022年6月第四十八张，PPT共六十二页，创作于2022年6月第四十九张，PPT共六十二页，创作于2022年6月
28、第五十张，PPT共六十二页，创作于2022年6月第三节第三节 DNA测序测序Section 3 DNA Sequencing第五十一张，PPT共六十二页，创作于2022年6月一、双脱氧链终止法一、双脱氧链终止法 (Dideoxy Chain Termination Method)双脱氧链终止法由双脱氧链终止法由Fred Sanger(1977)所发明。所发明。原理：在原理：在DNA聚合反应体系中加入聚合反应体系中加入ddNTP，使，使DNA的聚合的聚合进程随机终止，通过进程随机终止，通过PAGE分析，直接读出分析，直接读出DNA序列。序列。双脱氧链终止法反应体系组成：双脱氧链终止法反应体系组成
29、：DNA模板模板(即待测序即待测序DNA)、DNA聚合酶、测序引物和聚合酶、测序引物和dNTP(ddNTP和标记和标记dNTP)。双双脱脱氧氧链链末末端端终终止止法法(F.Sanger，1977)和和化化学学裂裂解解法法(Maxam和和Gilbert，1977)。第五十二张，PPT共六十二页，创作于2022年6月ddNTPdNTPdNTP与与ddNTP的结构的结构第五十三张，PPT共六十二页，创作于2022年6月ATGCDNADNA PoldNTP(dNTP*)测序引物测序引物*ddATPddTTPddGTPddCTP3GATTCGATTCCGACCTAGTCCGACCTAGTC5 5CTAA
30、GCTAAGCTAAGCTAAGGCTGGGCTGGA ACTAAGCTAAGGCTGGATCGCTGGATCA A CTAAGCTAAGGCTGGATCAGGCTGGATCAGCTAAGCTAAGGCGCT TCTAAGCTAAGGCTGGAGCTGGAT T CTAAGCTAAGGCTGGATCAGGCTGGATCAGCTAAGCTAAGG GCTAAGCTAAGGCTGCTG GCTAAGCTAAGGCTGGCTGG GCTAAGCTAAGGCTGGATCAGGCTGGATCAG(G G)CTAAGCTAAGG GC CCTAAGCTAAGGCTGGATGCTGGATC CCTAAGCT
31、AAGGCTGGATCAGGCTGGATCAG第五十四张，PPT共六十二页，创作于2022年6月CTAAGCTAAGGCTGGATCGCTGGATCA ACTAAGCTAAGGCTGGATGCTGGATC CCTAAGCTAAGGCTGGAGCTGGAT TCTAAGCTAAGGCTGGGCTGGA ACTAAGCTAAGGCTGGCTGG GCTAAGCTAAGGCTGCTG GCTAAGCTAAGGCGCT TCTAAGCTAAGG GC CCTAAGCTAAGG G双脱氧链终止法测序流程双脱氧链终止法测序流程3 3GATTCGATTCCGACCTAGTCCGACCTAGTC5 5CTAA
32、GCTAAGGCTGGATCAGGCTGGATCAG第五十五张，PPT共六十二页，创作于2022年6月二、自动测序二、自动测序(Automated DNA Sequencing)四种不同颜色的荧光染料分别标记的四种不同的四种不同颜色的荧光染料分别标记的四种不同的ddNTPs。PE公司的公司的BigDye测序反应试剂盒。测序反应试剂盒。模板模板DNA(待测序列待测序列)测序引物测序引物第五十六张，PPT共六十二页，创作于2022年6月DNA聚合酶聚合酶4种种dNTP4种种ddNTP*A：绿色：绿色；G：黄色：黄色；C：蓝色：蓝色；T：红色：红色第五十七张，PPT共六十二页，创作于2022年6月变性变性电泳电泳毛细管电泳毛细管电泳第五十八张，PPT共六十二页，创作于2022年6月第五十九张，PPT共六十二页，创作于2022年6月A：绿色：绿色；G：黄色：黄色；C：蓝色：蓝色；T：红色：红色第六十张，PPT共六十二页，创作于2022年6月第六十一张，PPT共六十二页，创作于2022年6月感感谢谢大大家家观观看看9/18/2022第六十二张，PPT共六十二页，创作于2022年6月