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1、 高效液相色谱法1n高效液相色谱法（HPLC）是60年代末以经典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理论与实验方法，流动相用高压泵输送，采用高效固定相和在线检测等手段发展而成的分离分析方法。n与气相色谱法相比具有：适用范围广，样品预处理简单，分离效率高，流动相选择范围广，检测方法多为非破坏性的，流出组分可回收等优点。第一节 概述2HPLC液-固吸附液-液分配正相色谱反相色谱一般反相色谱离子对色谱离子抑制色谱离子交换色谱一般离子交换色谱离子色谱氨基酸分析空间排斥色谱凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱假相色谱胶束色谱环糊精色谱亲合色谱，手性色谱，毛细管电泳键合相色谱3n正相色谱正相色谱（normal phas
2、e）n流动相极性小于固定相极性的分配色谱法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:n氨基柱、氰基柱、硅胶柱。n常用流动相为极性小的有机溶剂。n反相色谱反相色谱（reversed phase）n流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法。常用的分析柱有：ODS(C18)，C8，C2。n常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。4n离子抑制色谱离子抑制色谱（ion suppression chromatography）调节流动相的pH值，抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的目的。n离子对色谱离子对色谱（ion pair chromatography）将反离子
3、加入流动相中，与呈解离状态的被测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物，从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度，改善分离效果，达到分离目的。n常用反离子有：季铵盐 用于酸类 烷基磺酸盐用于碱类5n离子色谱法离子色谱法（ion chromatography）n离子色谱是由经典的离子交换色谱发展起来的一种液相色谱技术，利用物质在离子交换柱上迁移的差异而达到分离，用于亲水性阴阳离子的测定。根据是否采用抑制柱，可分为抑制型离子色谱和非抑制型离子色谱。6n空间排斥色谱（空间排斥色谱（steric exclusion）n也称凝胶色谱，依据被分离组分分子尺寸与凝胶空径大小之间的相对关系而分离，类似于分子筛作
4、用。在一定分子线团尺寸内，分子越大，保留时间越短。n凝胶渗透以有机溶剂为流动相n凝胶过滤以水溶液为流动相n对于相同化学组成的高分子化合物，其分子尺寸大小与分子量成正比，因此凝胶色谱可以研究高分子化合物的分子量分布。7胶束色谱胶束色谱(micellar chromatography)n表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度）时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成胶束（胶粒）。n以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系，不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。n因胶束色谱法的流动相是多相分散体系，在整个色谱体系中又增加了一相，故也被称为假相色谱（pseudo phase
5、 chromatography）。8n手性色谱手性色谱(chiral chromatography)n用于分离手性药物对映体的一种有效技术，可分为直接法和间接法两类：n直接法n手性固定相法（chiral stationary phase;CSP)n手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA)n间接法手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)9第二节 高效液相色谱仪色谱柱进样阀流动相检测器高压泵脱气装置 10n输液泵输液泵n多用柱塞往复泵，柱塞向前运动，液体输出，流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸入缸体。如此往
6、复运动，将流动相 源源不断地输送到色谱柱中。n柱塞往复泵属于恒流泵，流量不受柱阻影响，泵压最高为400kg/cm2。n这种泵具有清洗容易，更换流动相方便等优点，但脉动性较大是其缺点。目前多采用双泵补偿法来克服这一问题。1112避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物，四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混合物，含强络合剂的溶液等。过滤用滤膜过滤或垂熔漏斗过滤脱气采用超声或过滤的方法注意注意流动相流动相使用前使用前冲洗冲洗使用含酸、碱、缓冲液的流动相后，必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！13141516进样阀进样阀171柱柱泵泵324定量圈定量圈进样孔进样孔6废液废液5废液废液Inje
7、ct6柱柱泵泵3214定量圈定量圈进样孔进样孔废液废液5废液废液Load18注意：使用后应清洗！19n进样注意点进样注意点n进样阀的废液出口端高度必须与进样针在同一水平位置，以免虹吸作用，使样品向针筒方向回流，或从废液口流出。n使用前后，要用流动相（不含酸碱等缓冲液）或甲醇或水冲洗针孔，用针孔清洗器）。20n进样方法进样方法n整个定量圈体积进样为获得好的精密度，进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于层流影响，需要有过量的样品液来取代管壁上的流动相（见下图）。Sample Mobile phase21n例20l定量圈，进样体积不能超过10 l。否则，部分样品将会从出口流失。这是因为由于层流的关
8、系，样品流经管中心的速度是平均速度的两倍。n进样前应用流动相冲洗进样孔，以除去前一针留下的样品。注射针必须清洗干净。n部分定量圈体积进样当样品量少时，采用部分体积进样，进样量由微量注射器手动控制，要求：n不得超过定量圈体积的1/2量22n检测器检测器n紫外检测器n可变波长检测器n光电二极管阵列检测器n荧光检测器n电化学检测器n蒸发光散射n示差检测器n质谱23色谱图minH光谱图nmAA-曲线(定性)A-t 曲线 (定量)24蒸发光散射检测器是通用检测器，适用于无紫外吸收的化合物。原理：组分先引入已通气体（N2,空气）的蒸发室，加热，使流动相蒸发而被除去，样品组分形成气溶胶而产生光散射，测定散射
9、光强度而获得组分的浓度信号。本法中流动相在检测前已蒸发，故梯度洗脱基线稳定。25组分的气溶胶喷雾蒸发检测N2光源溶剂泵色谱柱流出物注注意意：流动相必须是挥发性的，不能含缓冲盐，若调节pH可用氨水、醋酸。26质谱检测器27UV-VISDAD Flu Refra ElecConducotherMs 检测器使用统计28n色谱柱色谱柱n色谱柱有柱管和固定相组成，柱管用不锈钢制成，柱长1030cm，内径26mm，以4.6mm的内径最常用。n根据键合基团极性不同，化学键合相可分为非极性、中等极性和极性三类。n常用色谱柱有：nODS柱、氰基柱、氨基柱等29n非极性键合相n表面基团为非极性烃基，如C18、C8
10、等，主要用于RP色谱。C18是最常用的非极性键合相，将十八烷基氯硅烷与硅胶表面的硅醇基经多步反应而成。R1，R2=H，Cl，CH31（2，3）：130n根据R1、R2基团，含碳量可分为高碳、中碳、低碳型键合相：n高碳 R1=R2=CH3 载样量大，吸附性能大；n中碳 R1=H,SiO Si(H)C18H37n R2=Cl SiO n低碳 R1=R2=Cl SiO SiO SiOSiC18H3731n中等极性键合相中等极性键合相常见的有醚基键合相，这类键合相根据流动相的极性，可作为正相或反相色谱的固定相，应用较少。n极性键合相可作正相或反相色谱使用n氨基键合相：硅胶-氨丙硅烷基Si(CH2)3N
11、H2 氰基键合相：硅胶-氰乙硅烷基Si(CH2)2CN 键合相色谱pH控制在2-832ZORBAX SB-C18键合相 使用独特的键合方式，用特殊的二异丁基硅烷对硅氧烷键进行保护，防止了极端pH和高温条件下键合相的水解，这些大侧链阻止了键合相的流失，提高了重现性，延长了柱寿命。新型固定相注意：pH范围，最高操作温度90，缓冲液浓度M，避免使用磷酸盐与碳酸盐33nZORBAX Extend-C18色谱柱采用C-18二齿结构并用特有的步骤进行双基封端。n在pH高达11.5的条件下，用于分离碱性、酸性、中性化合物，峰形优良，柱寿命长。34n色谱柱使用注意点：npH范围2-11.5。使用有机缓冲液，浓
12、度以10-50mM为好。在中高pH下避免使用磷酸盐，碳酸盐缓冲液，n最高操作温度60，最佳温度 40。n分离碱性物质，所用流动相pH值应高于被测物pKa一个单位。35 柱 pH范围 最高温度 SB C18 90 C8 60 C3 60 苯基 60 腈基 60XDB 60Extend-C18 601 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12ZORBAX RP-HPLCZORBAX RP-HPLC系列柱的使用条件系列柱的使用条件36n色谱柱使用与保存n所有色谱柱使用缓冲液后必须用柱体积20-30倍的水冲洗色谱柱n 色谱柱 柱体积 冲洗体积n150 4.6mm 2.5ml 50mln200
13、4.6mm 3.3ml 65mln250 4.6mm 4.2ml 80ml37n保存色谱柱时用100%甲醇或乙腈，柱两端必须用接头密封。n停用数天后最使用时，应先用低流速甲醇冲洗1h左右，然后再换上流动相，否则直接用流动相，柱效会下降，峰形不好。n新柱使用前应用甲醇或乙腈冲洗（0.5ml/min）。38色谱柱失效症状n色谱柱压增高n峰变宽，拖尾，裂峰n塔板数下降，选择性下降，分离度降低n保留值减小或增大色谱柱失效的原因n进口滤片堵塞n吸附了样品杂质n柱填充不良，使用久，n机械及热冲击造成空洞n固定相遭化学侵蚀39n原因 压力 拖尾 塔板数 选择性 保留值n堵塞#n空洞#n吸附样品#n化学冲击#
14、n柱凹陷出现裂峰现象，填料与色谱柱顶端不齐平，可用相同填料填平凹陷处。n压力影响应避免突然的压力波动与任何的机械与热力冲击，如色谱柱掉在实验台上或骤然改变柱温等。进样过程中转动进样阀太慢引起压力波动，会使色谱峰产生裂隙。40n柱压升高原因柱压升高原因n强保留样品组分强吸附组分易聚集在柱进口填料上，严重缩短色谱柱寿命。尤其是生物样品提取物、含油成分等。当严重拖尾峰出现时往往是强保留污染物在柱口处聚集的信号。n解决办法n使用保护柱可延长分析柱寿命。n每天实验后应用强溶剂（例甲醇-水等，至少20-30倍柱体积的量）冲洗色谱柱。n并定期进行保养，以低流速的强溶剂较长时间冲洗色谱柱。41n样品纯度差有微
15、小的颗粒堵塞管路。n可用滤膜过滤样品后再进样。n样品浓度高连续进样，造成过载。n如果样品吸收度不是太低，使样品浓度在1mg/ml以下较适宜。n流动相中缓冲液浓度过高，有机相比例大在色谱过程中堵塞管路，析出的盐结晶还磨损泵、进样阀密封圈造成漏液。n缓冲液浓度一般控制在20mmol以下较适宜，测定完毕后必须及时用水充分冲洗。42注意！注意！一旦柱压升高，应停止测定，用水一旦柱压升高，应停止测定，用水冲洗数小时或更长时间，待压力下降后冲洗数小时或更长时间，待压力下降后再测定，如果不清楚堵在哪一段，则应再测定，如果不清楚堵在哪一段，则应逐级检查，换泵头上滤芯，保护柱等。逐级检查，换泵头上滤芯，保护柱等
16、。43n柱效低的原因柱效低的原因n频繁更换流动相组成加速柱效降低。n最好一根色谱柱使用的流动相成分和pH值相近，如始终在酸性条件下或碱性条件下工作。n色谱柱的选择不合适或使用时间久n更换色谱柱（厂家，型号）n进样操作不当n转动进样阀时应一次转到位，不能过慢或停顿，否则易造成裂峰。44n样品溶剂与流动相成分不匹配n样品溶剂与流动相成分不匹配，造成前沿峰或倒峰。如样品用纯甲醇作溶剂，而流动相中甲醇比例很低，这样易出现前沿峰，改变样品溶剂成分或比例，使醇-水比例接近于流动相。前沿峰倒峰45n结果不能重现结果不能重现 表现为同一样品溶液连续进样所得峰面积相差大，引起这种情况时，可从以下几方面来查找原因
17、：n泵、进样阀、管路漏液造成峰面积变化。n检测器灵敏度改变如果同一样品两次进样峰面积相差10倍或更大倍数，则最可能的原因是检测器的灵敏度被无意中改变，软件的灵敏度改变不会影响峰面积的积分数值。46n色谱软件积分方式是否一致尤其是对于色谱峰较复杂的，积分时基线稍有变化将造成峰面积大的变化，如果两峰不是基线分离，则峰切割方式对峰面积有很大影响，有时候采用峰高较峰面积误差小。垂直切割基线切割47n样品溶液的稳定性n 有些样品在流动相条件下不稳定，放置后会产生杂质峰，应注意。n例如有一样品在流动相溶液中不稳定，配制后于不同时间进样，发现在主峰后会产生一杂质峰，该杂峰随时间而迅速增大。n将流动相中缓冲液
18、换成水后，样品测定液放置15h后仍稳定。48nHPLC HPLC 法在药物分析中的应用法在药物分析中的应用n鉴别n采用标准品对照法n检查n中国药典规定了5种测定方法n含量测定n中国药典规定了2种定量方法n在进行HPLC测定时，中国药典规定要进行系统适用性试验49系统适用性试验柱效 n=5.54(tR/Wh/2)2分离度 R=拖尾因子 T=重复性 取对照品或样品溶液，连续进样5次，测得峰面积相对标准差RSD应小于2.0%2(tR2-tR1)W1+W2W0.05h2d1(R 1.5)(T=0.951.05)其中分离度和重复性是更具实际意义的参数(ChP.2005)50n定量分析方法定量分析方法n内
19、标法 内标物要求：n样品中不含有的组分。n保留时间与待测物相近，但分离度R1.5。（理化性质相近）n有足够的纯度。51外标法-标准对照法 C样=A样/A标 C标52日常维护和常见色谱故障n溶剂及样品的准备n 过滤溶剂的目的湿防止固体颗粒损伤仪器或柱头；未经过滤的溶剂或者溶剂瓶中生长微生物，都会降低溶剂入口过滤头的寿命，并影响泵的性能，一般要求两天过滤一次。n 注意：过滤水相或有机相应该选用不同的滤膜n聚四氟乙烯几乎可以过滤所有的溶剂、酸和碱n尼龙66可以和大多数的有机物、水相容，但是建议不要用于强酸、二氯甲烷和DMFn纤维素滤膜用于水相53n溶剂脱气的方法n氦气脱气n真空脱气n回流加热脱气n超
20、身脱气（最为常用）n避免使用的溶剂n卤化物碱金属溶液及相应的酸溶液n高浓度的无机酸如硝酸、硫酸n能形成自由基的试剂及其混合物n四氯化碳和异丙醇或THF混合液n含强络合剂的溶液 54色谱柱的平衡n为了确保分析结果的再现性，对于反相柱应使用510倍柱体积的流动相平衡色谱柱。n注意：新装到系统的色谱柱需要进行初始化。先断开柱子和检测器间的管路，用流动相将色谱柱中的原有流动相或气泡移出色谱柱，然后再将色谱柱和检测器间的管路接好。55保护色谱柱n过滤所有的溶剂和样品n使用保护柱n仪器使用完毕，要冲洗整个系统，移走系统中缓冲液n柱子不使用时，两端密封n注意柱子使用的pH范围n不要高压冲洗柱子，不要高温下过
21、长时间的使用硅胶键合相56常见色谱故障基线噪音n可能的原因n检测池脏n检测器灯能量下降n由泵引起的脉冲n检测器上的温度效应n检测池中有气泡通过57常见色谱故障基线漂移n可能原因n梯度洗脱引起n流动相脏n柱子没平衡n系统中污染物溢出nRID检测器温度不稳定58常见色谱故障鬼峰n鬼峰没有进样就有色谱峰出现n原因流动相脏，尤其是水相常见色谱故障双峰n柱头塌陷或柱床运动n泵头过滤芯部分堵塞n组分共流出59常见色谱故障压力过高n可能原因n柱子进口过滤芯被污染nPurge阀过滤芯被污染n色谱柱被污染n连接管路堵塞n进样器旋转密封阀被堵塞n进样针或者针座被堵塞n可用分段法来检查哪一段发生堵塞60常见色谱故障压力过低n溶剂进口过滤芯被堵n连接管路泄漏或其他备件泄漏n溶剂或流速的改变n主动阀失灵n四元比例阀失灵n单向出口阀失灵n柱子失效（固定相流失）61常见色谱故障压力波动n可能原因n溶剂进口过滤芯堵塞n溶剂未脱气n泵的密封圈老化n出口单向阀失效n主动阀失效n最常见的原因失泵内有七宝62