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1、第五节第五节 酶活力的测定酶活力的测定 一、酶活力、酶单位、比活力的概念一、酶活力、酶单位、比活力的概念酶活力酶活力（也称酶活性，enzyme activity）是指酶催化一定化学反应的能力1 1、酶活力与反应速度、酶活力与反应速度(reaction velocity/rate)(reaction velocity/rate)酶活力的大小是用在一定条件下，它所催化的酶活力的大小是用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的速度来表示的。某一化学反应的速度来表示的。酶催化的反应速度越快，酶的活力越高酶催化的反应速度越快，酶的活力越高2 2、酶活力的单位、酶活力的单位(U,activityU,acti
2、vity unit)unit)19611961年国际生化学会酶学委员会规定：年国际生化学会酶学委员会规定：在酶作用的最适条件下（最适底物、最在酶作用的最适条件下（最适底物、最适适pHpH、最适缓冲液的离子强度及最适缓冲液的离子强度及25 25）下，）下，每分钟每分钟内催化内催化1.01.0微摩尔微摩尔底物转化为产物底酶底物转化为产物底酶量为量为一个国际酶活力的单位。一个国际酶活力的单位。1 IU=1mol/min1972年国际生化协会酶学委员会推荐了一个新单位“katal”(简称kat)即 1 1个个katalkatal酶活力单位是指在特定的酶活力单位是指在特定的条件下，在条件下，在1 1秒钟
3、秒钟内能转化内能转化1mol1mol底物的酶量。底物的酶量。KatKat与与U U的换算关系如下的换算关系如下1 kat=6107 IU1 IU=16.67 nkat（n109)一般情况下，对于酶活力单位人们通常采一般情况下，对于酶活力单位人们通常采用习惯用法。用习惯用法。如如-淀粉酶的活力单位是指每小时催化淀粉酶的活力单位是指每小时催化1 1克可溶性淀粉液化所需的酶量来表示。克可溶性淀粉液化所需的酶量来表示。也可以用每小时催化也可以用每小时催化1ml 2%1ml 2%可溶性淀粉液可溶性淀粉液化所需的酶量为化所需的酶量为1 1个酶单位。个酶单位。再如再如蛋白酶的活力单位是每分钟分解酪蛋蛋白酶的
4、活力单位是每分钟分解酪蛋白产生白产生1g1g酪氨酸所需的酶量。酪氨酸所需的酶量。3 3、比活力、比活力(specific activity)(specific activity)比活力的大小也就是酶含量（纯度）的大小，即每即每mgmg蛋白质所具有的酶活力蛋白质所具有的酶活力，一般用一般用U/mgU/mg蛋蛋白来表示。白来表示。对于酶制剂来讲对于酶制剂来讲，有时也用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位来表示(即U/g或U/ml)。对同一种酶来说，比活力越高，表明酶越纯。对同一种酶来说，比活力越高，表明酶越纯。4 4、催化中心活性、催化中心活性 (转换数转换数 turnover number
5、turnover number)是指酶在底物饱和时，每秒钟催化中心所是指酶在底物饱和时，每秒钟催化中心所转换底物的分子数转换底物的分子数。cat：每秒钟每个酶分子转化底物的微摩每秒钟每个酶分子转化底物的微摩尔数，在数值上尔数，在数值上cat k3n 几种酶的最大转换数几种酶的最大转换数cat二、酶活力测定法二、酶活力测定法常规测定酶活力的操作程序为常规测定酶活力的操作程序为：11、样品酶液适当稀释。、样品酶液适当稀释。22、在最适条件下进行酶促反应，并通过化学分析或仪、在最适条件下进行酶促反应，并通过化学分析或仪器分析的方法测定反应物的消耗量或产物的生成量。器分析的方法测定反应物的消耗量或产物
6、的生成量。33、根据酶单位定义和实验数据计算出酶活力。、根据酶单位定义和实验数据计算出酶活力。1、关于酶液的稀释2、关于酶促反应条件及保证措施3、关于反应量的测定第六节第六节 酶的分离、纯化酶的分离、纯化目的：目的：1、为了研究酶的理化特性(包括结构与功能，生物学作用等）。2、作为生化试剂及用作药物的酶，常常也要有较高的纯度。胞内酶的分离提纯步骤：胞内酶的分离提纯步骤：1、选材 2、破碎细胞3、抽取4、分离及提纯在酶的纯化过程中应该注意在酶的纯化过程中应该注意 1、防止酶蛋白变性。防止酶蛋白变性。低温、快速、不能过低温、快速、不能过度搅拌度搅拌。全部操作需在低温下进行，一般在。全部操作需在低温
7、下进行，一般在 0 05 5，用有机溶剂沉淀时，在零下，用有机溶剂沉淀时，在零下15152020下进行。下进行。22、随时测定酶活力和蛋白质含量，以便计、随时测定酶活力和蛋白质含量，以便计算总活力和比活力。算总活力和比活力。33、酶制剂的纯度应与使用目的相适应。、酶制剂的纯度应与使用目的相适应。5 5、纯化、纯化 除去杂蛋白及非蛋白杂质，并提高酶浓度。常利用溶解性、电性、分子大小及某些条件下稳定性差异来纯化.盐析、分级盐析盐析、分级盐析.有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀.选择性选择性变性变性沉淀沉淀.色谱法（层析法）色谱法（层析法）吸附色谱包括 离子交换色谱 凝胶过滤色谱 6 6、纯度鉴定、纯度鉴定
8、方法主要有：电泳法电泳法 比活测定比活测定 7 7、保存、保存 最后需将酶制剂浓缩、结晶，以便于保存。酶制品一般应在-20下低温保存。注意条件注意条件：干燥、低温、避光、避氧干燥、低温、避光、避氧核酶核酶(ribozymeribozyme)1 1、概念概念l19821982年年CechCech等研究等研究rRNArRNA的基因转录问题时发现：转录的基因转录问题时发现：转录产物产物rRNArRNA的前体很不稳定，在鸟苷（或的前体很不稳定，在鸟苷（或5-GMP5-GMP）和）和MgMg2+2+存在下切除自身的内含子，使两个外显子拼接起存在下切除自身的内含子，使两个外显子拼接起来，变成成熟的来，变成
9、成熟的RNARNA分子。分子。l这个催化反应是在完全没有任何蛋白质的存在下发生这个催化反应是在完全没有任何蛋白质的存在下发生的，称之为的，称之为自我剪切自我剪切，证明了，证明了RNARNA具有催化功能。为具有催化功能。为了区别于传统的蛋白质催化剂，了区别于传统的蛋白质催化剂，CechCech给这种具有催化给这种具有催化活性的活性的RNARNA定名为定名为ribozymeribozyme（ribonucleic acid ribonucleic acid enzymeenzyme）抗体酶抗体酶(abzyme)2020世纪世纪8080年代后期才出现的一种具有催化活力的蛋白年代后期才出现的一种具有催
10、化活力的蛋白质，其本质上是免疫球蛋白，但在易变区赋予了酶的质，其本质上是免疫球蛋白，但在易变区赋予了酶的属性，所以又称为属性，所以又称为催化性抗体催化性抗体（catalytic catalytic antibodyantibody）。）。是将抗体的多样性和酶分子的巨大催化能力结合起来是将抗体的多样性和酶分子的巨大催化能力结合起来的一种蛋白质分子设计的新方法。的一种蛋白质分子设计的新方法。是利用抗体分子及是利用抗体分子及其其多样多样的结合的结合专一性专一性来产生新的酶。来产生新的酶。由于酶作用的实质是酶与底物专一性的结合形成过渡由于酶作用的实质是酶与底物专一性的结合形成过渡态，因此，用过渡态的类
11、似物作为半抗原免疫动物，态，因此，用过渡态的类似物作为半抗原免疫动物，将有可能将有可能产生具有催化活性的抗体抗体酶产生具有催化活性的抗体抗体酶免疫球蛋白与抗体免疫球蛋白与抗体免疫球蛋白（免疫球蛋白（Immunoglobulin,IgImmunoglobulin,Ig）：）：是指具有抗体活是指具有抗体活性，或化学结构与抗体相似的球蛋白。主要存在于血液性，或化学结构与抗体相似的球蛋白。主要存在于血液和其它分泌液中。和其它分泌液中。抗体（抗体（antibody.Abantibody.Ab)：是机体免疫细胞被抗原激活后，是机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的由分化成熟的B B细胞，即浆细胞所合成与分
12、泌的一类能细胞，即浆细胞所合成与分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。AbAb是是重要的免疫分子，主要存在于血液、体液和粘膜分泌液重要的免疫分子，主要存在于血液、体液和粘膜分泌液中，介导体液免疫效应。中，介导体液免疫效应。AbAb=Ig,IgAbIg,IgAb；AbAb是功能描述，是功能描述，IgIg是化学结构描述；是化学结构描述；第七节第七节 固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)一、固定化酶概况一、固定化酶概况用物理或化学方法，将酶分子束缚在栽体上，使其即保持酶的天然活性，又便于与反应液分离，可以重复使用的酶，
13、它是酶制剂中的一种新剂型。优点优点：1、极易将酶与底物，产物分开，简化了提纯工艺。2、酶可以反复使用，并能装柱连续反应，有利于实 现工艺连续化。3、在大多数情况下，可以提高酶的稳定性。4、酶反应过程容易进行严格控制。5、提高了酶的利用率，降低了成本。缺点缺点：只能用于水溶性底物，适用于小分子底物。二、固定化酶的制定方法二、固定化酶的制定方法1 1、载体结合法、载体结合法用共价键，离子键或物理吸附法把酶固定在纤维素、琼脂糖、甲壳素、多孔玻璃或离子交换树脂等水不容性载体上。2 2、交联法、交联法借助于双功能试剂的作用，使酶蛋白分子之间发生交联，结成网状结构而制成固定化酶。3 3、包埋法、包埋法将酶
14、包埋的凝胶的微细格子中或用半透性的聚合物将酶包埋的凝胶的微细格子中或用半透性的聚合物膜来包裹膜来包裹三、固定化酶在食品生产中的应用三、固定化酶在食品生产中的应用果葡糖浆果葡糖浆是用淀粉为原料是用淀粉为原料,经经淀粉酶液淀粉酶液化，再经脱色、过滤、精制后，经化，再经脱色、过滤、精制后，经固定化固定化异构酶异构酶异构化而制成的含果糖异构化而制成的含果糖4242以上的以上的淀粉糖品。淀粉糖品。食品工业中酶制剂的应用食品工业中酶制剂的应用 微生物酶法合成低聚糖微生物酶法合成低聚糖生物活性肽生物活性肽酪蛋白磷酸肽（酪蛋白磷酸肽（CPPsCPPs）的研究的研究在肉类加工中的应用在肉类加工中的应用在面包制造
15、业中的应用在面包制造业中的应用在制糖业中的应用在制糖业中的应用在果蔬加工业中的应用在果蔬加工业中的应用在食品保鲜方面的应用在食品保鲜方面的应用在乳品工业中的应用在乳品工业中的应用在蛋品加工中的应用在蛋品加工中的应用一、在肉类加工中的应用一、在肉类加工中的应用 主要用于肉类嫩化。主要用于肉类嫩化。l因肉类的嫩度主要取决于构成肌肉的蛋白质，一般植物蛋白酶(如菠萝蛋白菌、无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶)能使肉类的不溶性残渣大大减少，释放氨基酸、增加鲜度，使肌肉横纹消逝，并初步消化结缔组织，使肉的嫩度大大增加。l在鱼类加工业中，用蛋白酶进行去膜、去皮，以及鱼苗生产中用作发酵的助剂。另外，在制造肠衣过程中，也
16、可用于去除残渣等。二、在面包制造业中的应用二、在面包制造业中的应用在制作面包过程中，若加入-淀粉酶，把淀粉变成单糖、双糖，帮助面团醒发，可提高面包质量；若加入蛋白酶、降低粘度、增加面筋筋力，可使面团的可伸性提高、可塑性增强，提高产品风味；若加入乳清酶，可增加甜度，且可以把其中的乳糖变成葡萄糖和半乳糖，使制品显色。三、在制糖业中的应用三、在制糖业中的应用用-淀粉酶，以淀粉、山芋、玉米粉等为原料，控制不同的酶解条件可制造葡萄糖、果糖等。在制造新型人造甜味剂中，利用橙皮苷酶制作的糖精，甜度相当于蔗糖的100倍；利用植物蛋白酶制作的肽甜味精，甜度相当于蔗糖的2000倍。四、在果蔬加工业中的应用四、在果
17、蔬加工业中的应用果胶酶和半纤维素酶能去除罐头生产白色沉淀，这是因为该酶能把产生沉淀的鼠李糖切去。另外，花青素酶可用于水果脱色，它在95失活，不能渗透到果肉内部，仅作用于表面。五、在食品保鲜方面的应用五、在食品保鲜方面的应用 葡萄糖氧化酶（需氧脱氢酶）可直接加入到罐装果汁、果酒、水果罐头及色拉调料中，从而防止食品氧化变质。l如：防止白葡萄酒在多肽氧化酶的作用下变色、果汁中的Vc因氧化而破坏、多脂食品中脂类因氧化酸败等。葡萄糖氧化酶还可以有效地防止罐装容器内壁的氧化腐蚀。此外，溶菌酶在水产品、香肠、生面条等食品中也可起良好的保鲜作用。六、在乳品工业中的应用六、在乳品工业中的应用过氧化氢酶主要用于清
18、除乳品中多余的过氧化氢，从而利用H2O2杀死致病菌；超氧化物酶用于乳清脱色等；巯基氧化酶用于去除乳制品因超高温杀菌而产生的糊味；脂肪酶用于乳品增香。另外，利用凝乳酶可制作干酪；用乳糖酶处理乳汁品，防止乳糖结晶析出；真菌或酵母乳糖酶可用于全奶、奶酪和冰淇淋中，使乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，从而防止制品租脯、提高口感。七、酪蛋白改性的目的七、酪蛋白改性的目的首先酪蛋白的改性可以用来研究结构和功能的关系，更好地理解特定官能团对酪蛋白性质的影响，便于进行有目的的改性，扩大其用途。其次是提高其营养价值，牛乳中酪蛋白：乳清蛋白为78：15，而人乳中两者之比为40：60，在母乳化奶粉生产中需添加价格昂贵的乳清粉以降低牛乳中酪蛋白的相对含量，如将牛乳中酪蛋白改性，即可经济实惠地达到这一目的。另外，s酪蛋白不易被婴儿消化吸收，而改性的酷蛋白消化率显著提高，最后，可以扩大酷蛋白在食品中的应用范围，这是酷蛋白改性的主要目的。