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1、第五章第五章细细 胞胞 工工 程程及其在食品工业中的应用及其在食品工业中的应用 细胞工程细胞工程(cell engineering)(cell engineering)是以细胞生物是以细胞生物学和分子生物学为基础理论，采用原生质体、细学和分子生物学为基础理论，采用原生质体、细胞或组织培养等试验方法或技术，在细胞水平上胞或组织培养等试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性，以获得具有新的性状的研究改造生物遗传特性，以获得具有新的性状的细胞系或生物体以及生物的次生代谢产物，并发细胞系或生物体以及生物的次生代谢产物，并发展有关理论和技术方法的学科。展有关理论和技术方法的学科。细胞工程的核心技
2、术：细胞培养与繁殖细胞工程的核心技术：细胞培养与繁殖 目的：获得新性状、新个体、新物质目的：获得新性状、新个体、新物质一一 细胞工程的定义细胞工程的定义第一节、细胞工程的概念与研究范畴第一节、细胞工程的概念与研究范畴 二二 细胞工程的研究范畴细胞工程的研究范畴细胞融合细胞融合细胞拆分细胞拆分动物细胞与组织培养动物细胞与组织培养植物细胞与组织培养植物细胞与组织培养细胞核移植细胞核移植染色体工程染色体工程胚胎工程胚胎工程干细胞与组织工程干细胞与组织工程三、细胞工程的发展三、细胞工程的发展1 动物细胞工程的发展动物细胞工程的发展2 植物细胞工程的发展植物细胞工程的发展细胞学说的建立胚胎学的发展分子生
3、物学的发展四、细胞工程的理论基础四、细胞工程的理论基础五、细胞工程的基本技术五、细胞工程的基本技术 植物细胞工程植物细胞工程植物细胞工程的基本技术和理论基础植物细胞工程的基本技术和理论基础植物细胞工程的理论基础是：植物细胞工程的理论基础是：植物细胞的全能性植物细胞的全能性植物细胞工程常用的技术是植物细胞工程常用的技术是 植物组织培养植物组织培养植物体细胞杂交植物体细胞杂交概念：概念：细胞的全能性是指生物体的细胞具有细胞的全能性是指生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能。使后代细胞形成完整个体的潜能。原因：原因：是生物体的每一个细胞都含有该物种是生物体的每一个细胞都含有该物种所特有的全套遗
4、传物质及发育为完整所特有的全套遗传物质及发育为完整个体所必需的全部基因。个体所必需的全部基因。细胞的全能性细胞的全能性 当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织而处当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织而处于离体状态时，在一定的营养物质、激素和其他外界条件于离体状态时，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。在生物的个体发育中，由于基因在特定时间和空间在生物的个体发育中，由于基因在特定时间和空间下选择性地表达而形成不同器官，因此，要实现细胞的下选择性地表达而形成不同器官，因此，要实现细胞的全能性，
5、首先必须使生物体的细胞处于离体状态。全能性，首先必须使生物体的细胞处于离体状态。受精卵的全能性最高；受精卵的全能性最高；其次是生殖细胞（尤其是卵细胞）；其次是生殖细胞（尤其是卵细胞）；体细胞的全能性比生殖细胞低得多。体细胞的全能性比生殖细胞低得多。从健康植株的特定部位或组织，如根、茎、叶、从健康植株的特定部位或组织，如根、茎、叶、花、果实、胚珠、花药和花粉等，选择用于组织花、果实、胚珠、花药和花粉等，选择用于组织培养的起始材料，称之为外植体。培养的起始材料，称之为外植体。用一定的化学药剂，最常用的有次氯酸钠，升用一定的化学药剂，最常用的有次氯酸钠，升汞和酒精等对外植体表面消毒，建立无菌培养体汞
6、和酒精等对外植体表面消毒，建立无菌培养体系。严格控制无菌条件，这是获得培养成功的重系。严格控制无菌条件，这是获得培养成功的重要一步。要一步。外植体块在培养基上形成疏松的愈伤组织，由外植体块在培养基上形成疏松的愈伤组织，由愈伤组织分化出芽并可诱导形成根的小植株。愈伤组织分化出芽并可诱导形成根的小植株。1 1）植物细胞和组织培养技术）植物细胞和组织培养技术植物组织培养的过程离体的植物器官、组织或细胞离体的植物器官、组织或细胞脱分化（又叫去分化）脱分化（又叫去分化）愈伤组织愈伤组织（排列疏松而无规则，高度液泡（排列疏松而无规则，高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞）化的呈无定形状态的薄壁细胞）再分化再
7、分化根或芽等器官根或芽等器官植物体植物体植物组织培养的条件：植物组织培养的条件：适宜的养料和激素，适宜的适宜的养料和激素，适宜的温度和无菌条件温度和无菌条件离体的植物离体的植物器官、组织器官、组织或细胞或细胞愈愈伤伤组组织织根根芽芽植植物物体体脱分化脱分化再分化再分化脱分化脱分化脱分化脱分化 由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化。伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化。再分化再分化再分化再分化脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重新分化成根或芽等器官，这一过程称为植物细新分化成根或芽
8、等器官，这一过程称为植物细胞的再分化。胞的再分化。二、植物组织培养2.植物组织培养过程相关问题1 1、在植物组培过程中，为、在植物组培过程中，为什么要进行一系列的消什么要进行一系列的消毒，灭菌，并且要求无毒，灭菌，并且要求无菌操作？菌操作？2 2、为什么切取胡萝卜根的、为什么切取胡萝卜根的形成层，其他部分也能形成层，其他部分也能培养成小植株吗？培养成小植株吗？植物体细胞杂交的概念植物体细胞杂交的概念 将不同种植物的体细胞，在一将不同种植物的体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。种细胞培育成新的植物体的技术。（不同种生物之间存在着生
9、殖隔离，（不同种生物之间存在着生殖隔离，所以用传统的有性杂交方法是不可所以用传统的有性杂交方法是不可能做到这一点的）能做到这一点的）相关问题（1）要想让两个来自不同植物的体细胞融合在）要想让两个来自不同植物的体细胞融合在一起，遇到的第一个障碍是什么？一起，遇到的第一个障碍是什么？（2）有没有一种温和的去细胞壁的方法？）有没有一种温和的去细胞壁的方法？（3）为什么两个原生质体能发生融合，这与细）为什么两个原生质体能发生融合，这与细胞膜的什么特性有关？胞膜的什么特性有关？（4）如果两个来源不同的原生质体发生融合形）如果两个来源不同的原生质体发生融合形成了杂种细胞，下一步该对此细胞做何种成了杂种细胞
10、，下一步该对此细胞做何种处理？处理？（5）如何将杂种细胞培育成杂种植株？）如何将杂种细胞培育成杂种植株？植物体细胞杂交过程植物体细胞杂交过程植物细胞植物细胞A植物细胞植物细胞B去掉细胞壁去掉细胞壁去掉细胞壁去掉细胞壁原生质体原生质体A原生质体原生质体B原生质体融合原生质体融合杂合的原生质体杂合的原生质体再生出细胞壁再生出细胞壁杂种细胞杂种细胞细胞分裂细胞分裂分化发育分化发育愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株植物体细胞杂交过程原生质体制备（酶解法去细胞壁）原生质体制备（酶解法去细胞壁）原生质体融合（人工诱导）原生质体融合（人工诱导）杂种细胞的筛选和培养（形成愈伤组织）杂种细胞的筛选和培养（形成愈伤
11、组织）杂种植株的再生与鉴定杂种植株的再生与鉴定物理法：物理法：离心、振动、电刺激等离心、振动、电刺激等化学法：化学法：聚乙二醇等试剂聚乙二醇等试剂纤维素酶、果胶酶等纤维素酶、果胶酶等问题v为什么为什么“番茄番茄马铃薯马铃薯”超级杂种植株没有如科超级杂种植株没有如科学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马铃学家所想像的那样，地上长番茄、地下结马铃薯？薯？v主要原因是：生物基因的表达不是孤立的，它主要原因是：生物基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以马铃薯们之间是相互调控、相互影响的，所以马铃薯番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的番茄杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，
12、但这些遗传物质的表达受到相互干遗传物质，但这些遗传物质的表达受到相互干扰，不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质扰，不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂交植株不能地上长番茄、地一样有序表达，杂交植株不能地上长番茄、地下结马铃薯就是很自然的了。下结马铃薯就是很自然的了。问题v自然界中有一种含有叶绿体的原生动物自然界中有一种含有叶绿体的原生动物眼虫，说眼虫，说明植物的细胞器同样可以在某些动物细胞中存活，请明植物的细胞器同样可以在某些动物细胞中存活，请探讨：动物细胞与植物细胞之间可以实现杂交吗？如探讨：动物细胞与植物细胞之间可以实现杂交吗？如果理论上可行，请设计出具体实验方案。果理论上
13、可行，请设计出具体实验方案。异想天开植物细胞工程的实际应用v繁殖植物的新途径繁殖植物的新途径微型育种微型育种作物脱毒作物脱毒人工种子人工种子v育种新方法育种新方法单倍体育种单倍体育种诱导突变体诱导突变体v细胞产物的工厂化生产细胞产物的工厂化生产概念：概念：应用组织培养技术，快速繁殖植物（也叫应用组织培养技术，快速繁殖植物（也叫快速繁殖技术）快速繁殖技术）原理：原理：植物细胞的全能性植物细胞的全能性优点：优点：繁殖率高，可大批量生产繁殖率高，可大批量生产 取材少取材少 培养周期短培养周期短 保持优良性状保持优良性状微型繁殖作物脱毒v病毒在作物体内逐年积累，会导致作物产病毒在作物体内逐年积累，会导
14、致作物产量降低，品质变差量降低，品质变差v分生区附近（茎尖、根尖）的病毒极少，分生区附近（茎尖、根尖）的病毒极少，甚至没有甚至没有v采用茎尖进行组织培养采用茎尖进行组织培养人工种子人工种子v结构：结构：人工薄膜人工薄膜+胚状体（不定芽、顶芽、腋芽）胚状体（不定芽、顶芽、腋芽）v优点：优点：不受气候、季节、地域的限制不受气候、季节、地域的限制保留优良性状保留优良性状时间短，占地少时间短，占地少v技术：技术：组织培养组织培养v原理：原理：细胞全能性细胞全能性v养分、无机盐、有机碳源、农药、抗生素、有益菌养分、无机盐、有机碳源、农药、抗生素、有益菌v生长调节剂生长调节剂单倍体育种v方法：方法：花药离
15、体培养花药离体培养 v技术：技术：组织培养获得单倍体组织培养获得单倍体秋水素处理单倍体的幼苗，使染色体加倍秋水素处理单倍体的幼苗，使染色体加倍v优点：优点：明显缩短了育种年限明显缩短了育种年限后代稳定遗传后代稳定遗传突变体的利用v利用组织培养时，分裂状态的细胞易受培利用组织培养时，分裂状态的细胞易受培养条件和外界压力（如射线，化学物质等）养条件和外界压力（如射线，化学物质等）的影响而产生突变的原理，诱导并筛选出的影响而产生突变的原理，诱导并筛选出对人类有用的突变体。对人类有用的突变体。细胞产物的工厂化生产细胞产物的工厂化生产红豆杉与紫杉醇红豆杉与紫杉醇人参皂甘的生产人参皂甘的生产 植植物物细细
16、胞胞培培养养是是指指在在离离体体条条件件下下将将愈愈伤伤组组织织或或其其他他易易分分散散的的组组织织置置于于液液体体培培养养基基中中，将将组组织织振振荡荡分分散散成成游游离离的的悬悬浮浮细细胞胞，通通过过继继代代培培养使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法。养使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法。植物细胞和组织培养技术植物细胞和组织培养技术(PCTC)目目前前，植植物物细细胞胞培培养养技技术术已已在在农农业业、医医药药、食食品品、化化妆妆品品、香香料料等等领领域域广广泛泛用用于于大大规规模模生生产产有有价价值值的的产产品品。小小规规模模的的细细胞胞培培养养通通常常在在培培养养瓶瓶中中完完成成，而而大
17、大规规模模的的培培养养可可在在发发酵酵罐罐中中进进行。行。植植物物细细胞胞培培养养基基通通常常包包括括无无机机盐盐、碳碳源源、维维生生素素、生长调节素和有机添加剂生长调节素和有机添加剂等。等。无机盐类无机盐类 包括：包括：无机盐浓度一般为多少？无机盐浓度一般为多少？微微量量元元素素主主要要包包括括碘碘、硼硼、锰锰、锌锌、钼钼、铜铜、钴钴、铁等。铁等。碳源和能源碳源和能源 维维生生素素 植植物物细细胞胞的的生生长长都都需需要要硫硫胺胺素素。可可在在植植物物细细胞胞培培养养基基中中加加入入烟烟酸酸、吡吡哆哆醇醇、泛泛酸酸、生生物物素素和叶酸等。和叶酸等。原生质体培养原生质体培养通常需要大多数必需维
18、生素。通常需要大多数必需维生素。1、植物细胞培养基的组成、植物细胞培养基的组成 植植物物生生长长激激素素 大大多多数数植植物物细细胞胞培培养养基基中中都都含含有有天天然然的的或或合合成成的的植植物物生生长长激激素素。生生长长激激素素包包括括了了植植物物生长素、细胞激动素、赤霉素和脱落酸生长素、细胞激动素、赤霉素和脱落酸等四大类。等四大类。有有机机氮氮源源 通通常常采采用用的的有有机机氮氮源源有有蛋蛋白白质质水水解物、谷氨酰胺或氨基酸混合物解物、谷氨酰胺或氨基酸混合物等。等。有有机机酸酸 加加入入丙丙酮酮酸酸，或或者者柠柠檬檬酸酸、苹苹果果酸酸和和琥琥珀珀酸酸等等三三羟羟酸酸循循环环的的中中间间
19、产产物物，能能够够保保证证植植物物细细胞胞在在以以铵铵盐盐作作为为单单一一氮氮源源的的培培养养基基上上生生长长，并并且且使使细细胞胞对对钾钾盐盐的的耐耐受受能能力力至至少少提提高高到到10mmol/l。除除此此之之外外，这这些些有有机机酸酸还还能能提提高高低低密密度度接接种种的的细细胞胞和和原原生生质质体的生长。体的生长。复复合合物物质质 在在植植物物细细胞胞的的培培养养过过程程中中，酶酶母母抽抽提提液液、麦麦芽芽抽抽提提液液、椰椰子子汁汁和和水水果果汁汁等等复复合合物物质质通通常常可以作为细胞的生长剂。可以作为细胞的生长剂。类型和方法类型和方法:悬浮培养和固定培养悬浮培养和固定培养悬浮培养方
20、法悬浮培养方法 要求要求:材料材料(疏松易碎的愈伤组织疏松易碎的愈伤组织,经过破碎经过破碎的颈部组织的颈部组织)条件条件:水平震荡水平震荡,合适的气体组成合适的气体组成/pH 特点特点:对剪切力敏感对剪切力敏感 结团结团 生长速度慢生长速度慢 多多泡沫泡沫 光照光照 无菌培养无菌培养 图图12-2大规模植物细胞固定化装置大规模植物细胞固定化装置含含CaCl2的培养基的培养基盖子盖子空气出口空气出口海藻酸钠海藻酸钠+细胞悬浮液细胞悬浮液喷嘴喷嘴无菌空气入口无菌空气入口 大大规规模模固固定定化化植植物物细细胞胞的的大大规规模模固固定定化化原原则则上上可可根根据据上上述述方方法法进进行行，但但是是不
21、不能能再再用用塑塑料料注注射射器器，而而需需要要采采用用如如图图12-2所所示示的的大大规规模模细细胞胞固固定定化化装装置置进进行行细细胞胞的的固固定定化。化。动物细胞工程动物细胞工程应用应用动物细胞培养动物细胞培养动物细胞融合动物细胞融合单克隆抗体技术单克隆抗体技术核移植核移植动物动物细胞细胞工程工程常用常用技术技术人耳鼠“人耳鼠”再出风头 2001年，一只特别的活老鼠在北京引起轰动这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的小白鼠。值得一提的是，这只小白鼠的背上，竟长着一只几乎与身子一般大小的“人耳”。这只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民医院副院长、整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技
22、术复制出来的。在京展出的数天，尽管门票高达20元，但还是有将近20万人，心甘情愿地掏钱一睹“人耳鼠”的风采。人耳鼠的出现，透露了怎样的信息？1.1.发展历史发展历史:20 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。19071907年，美国生物学家哈里森年，美国生物学家哈里森(Harrison)(Harrison)从蝌蚪的从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在
23、青蛙的凝固的淋巴液脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。并逐渐发展成为动物细胞培养。2、动物细胞培养的应用和概念：、动物细胞培养的应用和概念：动物细胞培动物细胞培养就是从动物有养
24、就是从动物有机体中取出相关机体中取出相关的组织的组织,将它分散将它分散成单个细胞成单个细胞,然后然后,放在适宜的培养放在适宜的培养基中基中,让这些细胞让这些细胞生长和增殖生长和增殖.动物细胞的培养过程动物细胞的培养过程幼龄动物取动物器官和组织剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培养养单个细胞动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础剪碎组织剪碎组织的目的？的目的？胰蛋白酶处胰蛋白酶处理的目的？理的目的？3、动物细胞培养过程：、动物细胞培养过程：动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞悬浮液细胞悬浮液胰蛋白酶胰蛋白酶10代细胞代细胞原代培养原代培养50代细胞代细胞传代培养传代培养细
25、胞株细胞株无限传代无限传代细胞系细胞系单个细胞单个细胞加培养液加培养液遗传物质遗传物质未改变未改变遗传物质遗传物质已改变已改变动物组织细胞间隙中动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织定弹性和韧性的组织和器官。和器官。（分解弹性纤维）（分解弹性纤维）有关概念有关概念v原代培养原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。（分装前的细胞培养）原代细胞。（分装前的细胞培养）v传代培养传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，
26、分装到两个或两个以上的制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。培养瓶中继续培养，称为传代培养。有关概念有关概念细胞株：细胞株：传代培养的细胞一般传至传代培养的细胞一般传至10代左代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞系：细胞株传代至细胞株传代至50代后又出现细胞代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这改变，使其在培养条件下可以无限制传代
27、，这种传代细胞为细胞系。种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。容易传代培养。动物组织细胞培养要求动物组织细胞培养要求一一 体外培养特点体外培养特点:大多数动物细胞要附在物体上表面生长，大多数动物细胞要附在物体上表面生长，动物细胞培养对营养要求更严格，除氨基动物细胞培养对营养要求更严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖外，还需要血酸、维生素、盐类、葡萄糖外，还需要血清。对环境适应性差，对环境敏感，包括：清。对环境适应性差，对环境敏感，包括：PH、溶解氧、
28、温度、剪切力等比微生物要、溶解氧、温度、剪切力等比微生物要求更高。求更高。二二 培养工具培养工具:v培养瓶、培养皿、培养培养瓶、培养皿、培养管、多孔培养板等。管、多孔培养板等。细胞培养以玻璃器皿为主。细胞培养以玻璃器皿为主。器皿应选择透明度好、无毒、器皿应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品。中性硬度玻璃制品。v根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异，用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀，便于细胞贴壁生长和观察，瓶口要大小一致，口径一般不小于1cm，允许吸管伸入瓶内任何部位。vv 三三、培养条件培养条件细胞在体外培养中所需的条件细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。与体内细胞基本相
29、同。【讨论】【讨论】多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，讨论以下问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？体外培养细胞时需要提供哪些物质？提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的提示：充足的营养供给、适宜的温度、适宜的pH和气体环境。和气体环境。2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？体外培养的细胞需要什么样的环境条件？提示：无菌、无毒的环境。提示：无菌、无毒的环境。1）恒定的温度恒定的温度:37，v维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为体细胞培养的标准温度为36.50.536.50.5，偏离这一温度，偏离这一温度
30、范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过3939时，细时，细胞代谢与温度成正比；胞代谢与温度成正比；v人体细胞在人体细胞在39-40139-401小时，即能受到一定损伤，但仍有可小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；能恢复；v在在40-41140-411小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；恢复；v41-42141-421小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别
31、细胞仍有恢复可能；别细胞仍有恢复可能；v当温度在当温度在4343以上以上1 1小时，细胞全部死亡。低温下会使细小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降低胞代谢速率降低2）PHPH：7.2-7.7.2-7.v当当PHPH低于低于6 6或高于或高于7.67.6时的生长会受到影响，时的生长会受到影响，甚至死亡。甚至死亡。用来检测PH的变化：红色-pH7.4，v橙色-pH7.0，黄色-pH6.5，蓝红色-pH7.6，紫色-pH7.8。3)气体：气体：v有调节有调节PH的作用。的作用。v气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和
32、合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。4）营养）营养培养基：培养基：v 在保证细胞渗透压的情况下，培养在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养，如包括十几种必需氨基酸的各种营养，如包括十几种必需氨基酸及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳及其他多种非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机盐类等。只有满足了这水化合物及无机盐类等。只有满足了这些基本条件，细胞才能在体外正常存活、些基本条件，细胞才能在体外正常存活、生长。生长。v 动物细胞的培养基一般分为天然、合动物细胞的培养基一般
33、分为天然、合成、无血清培养基几种，此外细胞培养成、无血清培养基几种，此外细胞培养还需要一些常用的溶液。还需要一些常用的溶液。合成合成培养基培养基v 1951年厄尔开发了供动物细胞体外生年厄尔开发了供动物细胞体外生长的人工合成培养基长的人工合成培养基(MEM)。合成培养基。合成培养基的种类相当多。合成培养基成分已知，便的种类相当多。合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。但与天然培养基相于对实验条件的控制。但与天然培养基相比，有些天然的未知成分尚无法用已知的比，有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代，因此，细胞培养中使用化学成分所替代，因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定
34、量的天的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。然培养基成分，以克服合成培养基的不足。最普遍的作法是加入小牛血清。最普遍的作法是加入小牛血清。v人工合成培养基，如人工合成培养基，如109培养液、培养液、DMEM、199、RPMI-1640，IMEM，MEM培养液等。培养液等。天然天然培养基培养基v 直接采用取自动物体液或从组织中提取的成直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分作培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚分作培养液，主要有血清、组织提取液、鸡胚汁等。汁等。v 血清是天然培养基中最有效和最常用的培养成血清是天然培养基中最有效和最常用的培养成分。它含有许多维
35、持细胞生长繁殖和保持细胞分。它含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的未知成分。生物学性状不可缺少的未知成分。使用最普遍的天然培养基是血清，基本以使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培因子、促贴附因子及其多活性物质。与合成培养基合用，能使细胞硕利增殖生长。养基合用，能使细胞硕利增殖生长。v常用的动物血清主要有牛血清和马血清。牛常用的动物血清主要有牛血清和马血清。牛血清分为血清分为胎牛血清和犊牛血清胎牛血清和犊牛血清，前者来源少，前者来源少，价格高；后者要求刚产下尚
36、未哺乳的小牛，价格高；后者要求刚产下尚未哺乳的小牛，因为哺乳后的小牛血清中可能含有更复杂的因为哺乳后的小牛血清中可能含有更复杂的成分。血清中已知的成分主要有蛋白质、氨成分。血清中已知的成分主要有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白质主要是白蛋基酸、葡萄糖、激素等。蛋白质主要是白蛋白和球蛋白。白和球蛋白。v氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分，氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分，氨基酸中有氨基酸中有1212种是细胞本身不合成的，种是细胞本身不合成的，必须由培养液提供。激素有胰岛素、生必须由培养液提供。激素有胰岛素、生长激素和多种生长因子如表皮生长因子、长激素和多种生长因子如表皮生长因子、成纤维细胞生长
37、因子、增殖刺激因子成纤维细胞生长因子、增殖刺激因子(MSA)(MSA)、类胰岛素生长因子、类胰岛素生长因子(IGFl(IGFl、IGF2)IGF2)等。等。v 水解乳蛋白、胶原水解乳蛋白、胶原是另外两种较好的天然培养基是另外两种较好的天然培养基成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解产物，呈蛋黄色成分。水解乳蛋白是乳白蛋白的水解产物，呈蛋黄色粉末状，富含氨基酸。一般配制成粉末状，富含氨基酸。一般配制成0 05 5溶液，微酸溶液，微酸性。胶原是从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特性。胶原是从动物真皮中提取的，具改善细胞表面特性促使其附着生长的作用。性促使其附着生长的作用。无血清培养基无血清培养基v动物血
38、清成分复杂，各种生物大小分子混合动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清对在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清对细胞生长很有效，但后期对培养产物的分离、细胞生长很有效，但后期对培养产物的分离、提纯以及检测造会成一定困难。另外高质量提纯以及检测造会成一定困难。另外高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用。大量使用。无血清培养基不加动物血清，在基础培养无血清培养基不加动物血清，在基础培养基中加入细胞生长有效因子，激素等。基中加入细胞生长有效因子，激素等。5)细胞细胞培养溶液培养溶液v平衡盐水（平衡盐水（BSSBSS
39、）：）：Hanks Hanks 液和液和EarleEarle液是常用的液是常用的BSSBSS基础溶液。基础溶液。vPH调整液：调整液：NaHCO3溶液、溶液、HEPES溶液溶液（二羟乙基哌嗪二羟乙基哌嗪乙烷磺酸乙烷磺酸）v细胞消化液细胞消化液:胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液EDTAEDTA溶液胶原酶溶液溶液胶原酶溶液v抗生素溶液：抗生素溶液：1)1)青、链霉素青、链霉素:每毫升培养液含每毫升培养液含100U100U青霉素和青霉素和100ug100ug链霉素链霉素.2)2)卡那霉素：终浓度为卡那霉素：终浓度为50ug/ml50ug/ml培养液。培养液。3 3）制霉菌素：浓度制霉菌素：浓度25U/ml2
40、5U/ml，小瓶分装，每瓶一，小瓶分装，每瓶一次用完。次用完。6)、无污染环境、无污染环境v培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。是维持细胞生存的基本条件。四 细胞
41、培养设施细胞培养设施1、实验室设计细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。v细胞培养室的设计实施原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，而洗刷消毒在另一室。细胞培养实验室细胞培养实验室1.准备室准备室2.缓冲室缓冲室 准备室风淋3.培养室培养室培养室培养室v专用于组织细胞培养的空间，应包括更衣间、专用于组织细胞培养的空间，应包括更衣间、缓冲间、操作间。缓冲间、操作间。v内设超净工作台、培养箱等细胞培养的必
42、要内设超净工作台、培养箱等细胞培养的必要设备，应具备紫外消毒、通风及温控设施。设备，应具备紫外消毒、通风及温控设施。v操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机及倒置显微镜等。离心机及倒置显微镜等。v缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及毒好的无菌缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及毒好的无菌物品等物品等风淋室风淋室：风淋室是生物洁净室的理想配套设备，它不仅可以清除人体和物品表面附着的尘埃，减少带入洁净室的灰尘量，而且兼有气闸室的功能，可防止非洁净空气的侵入。风淋室的板壁采用轻质隔热夹芯钢板，吹淋板采用进口不锈钢制作，吹淋口方向可调，风淋时间可在30-99秒间的调整。风淋
43、室可以配合加热器，冬天可以加热，温度可调，一般控制温度在30-35较为适宜。超净工作台超净工作台n也称净化工作台，分也称净化工作台，分为侧流式、直流式和外为侧流式、直流式和外流式三大类。流式三大类。CO2培养箱培养箱v哺乳动物离体细胞培养和体内细胞一样哺乳动物离体细胞培养和体内细胞一样,需要在恒足温度下才能生存需要在恒足温度下才能生存,温差变化一般温差变化一般不应超过不应超过0.5度，因此培养箱对温度应具有度，因此培养箱对温度应具有较高灵敏度。较高灵敏度。CO2培养箱的优点在于能恒定地供应一培养箱的优点在于能恒定地供应一定量的定量的CO2,一般一般5%即可即可维持培养液维持培养液PH值值稳定稳
44、定。冰箱冰箱v细胞培养的冰箱应特别注意清洁，细胞培养的冰箱应特别注意清洁，防止污染。防止污染。v水纯化装置水纯化装置细胞培养对水的质量要求较高。一般需要使用重蒸或三蒸水配置各种培养用液。过滤装置过滤装置v各种培养用液只能用过滤的方法进行除菌消毒处理。微化滤膜滤器是目前应用最广泛的过滤装置。v细胞冷冻贮存器细胞冷冻贮存器细胞冷冻贮存具有经济、省力和较好保持细胞生物学特性的优点，目前各实验室主要使用液氮容器贮存细胞。v培养器皿培养器皿培养器皿包括各种规格的玻璃、塑料培养瓶，培养皿，吸管，离心管等。v洗刷消毒间：洗刷消毒间：烤箱、消毒锅、蒸烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸馏水处理器及酸缸等。等。v分
45、析间：分析间：显微镜、计算机及显微镜、计算机及打印机等。打印机等。无菌操作的要领无菌操作的要领v由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切由于体外培养的细胞缺乏机体抗感染功能，所以在一切操作中要努力作到最大限度的无菌，防止污染。操作中要努力作到最大限度的无菌，防止污染。v超净工作台消毒超净工作台消毒打开紫外线杀菌灯照射消毒打开紫外线杀菌灯照射消毒2030分钟，然后关闭紫外分钟，然后关闭紫外灯，打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作灯，打开风机，流入的空气是经过除菌板过滤的空气，工作台可保持无菌环境。台可保持无菌环境。v洗手洗手 操作时因整个前臂伸入工作台内，所以洗手一定要刷洗操
46、作时因整个前臂伸入工作台内，所以洗手一定要刷洗到肘部，然后用到肘部，然后用0.2%新洁尔灭或新洁尔灭或75%的酒精棉球擦拭。的酒精棉球擦拭。火焰消毒火焰消毒v所使用物品均应经过烧灼，所用瓶口等开所使用物品均应经过烧灼，所用瓶口等开启或封盖时均需迅速旋转过火焰进行消毒。启或封盖时均需迅速旋转过火焰进行消毒。注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长。注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长。v烧过的用具均要待冷却后再接触组织细胞。烧过的用具均要待冷却后再接触组织细胞。v 吸取营养液后的吸管不能再经火焰烧灼吸取营养液后的吸管不能再经火焰烧灼,否否则会烧焦形成炭膜则会烧焦形成炭膜,再用时会将有害物质带入再用时
47、会将有害物质带入培养液。培养液。v合理布局合理布局右手使用方便的用品放右侧，左手使用方右手使用方便的用品放右侧，左手使用方便的用品放左侧。便的用品放左侧。酒精灯置于中央，打开的培养液、培养酒精灯置于中央，打开的培养液、培养瓶等应保持斜立或平放（瓶口长时间开口直瓶等应保持斜立或平放（瓶口长时间开口直立立,易增加落菌机会）。易增加落菌机会）。v吸取各种用液应分别使用吸管，不能混用。吸取各种用液应分别使用吸管，不能混用。3.动物细胞培养动物细胞培养 的条件的条件1.无菌无毒的环境无菌无毒的环境2.营养营养3.温度和温度和pH4.气体环境气体环境 应该加入哪些物质？这应该加入哪些物质？这些物质如何调配
48、？些物质如何调配？在使用合成培养基时通常在使用合成培养基时通常需加入血清、血浆等天然需加入血清、血浆等天然成分，目的是什么？成分，目的是什么？4.动物细胞培养技术的应用动物细胞培养技术的应用v蛋白质生物制品的生产蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体v健康细胞培养健康细胞培养 培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植v细胞的生理、药理、病理研究细胞的生理、药理、病理研究 用于筛选抗癌药物用于筛选抗癌药物 动物细胞培养技术动物细胞培养技术 条件要求条件要求:工艺方式工艺方式:分批分批 流加式流加式 半连续式半连续式 连续式连续式
49、 培养技术培养技术:悬浮培养技术悬浮培养技术 贴壁培养技术贴壁培养技术 微载体培养技术微载体培养技术 多孔载体培养技术多孔载体培养技术 微囊化培养技术微囊化培养技术 中空纤维细胞培养技术中空纤维细胞培养技术植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较比比较项较项目目植物植物组织组织培养培养动动物物细细胞培养胞培养原理原理培养基性培养基性质质培养基特有成分培养基特有成分培养培养结结果果培养目的培养目的细胞的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基蔗糖蔗糖 植物激素植物激素 葡萄糖葡萄糖 动物血清动物血清植物体植物体细胞株、细胞系细胞株、细胞系
50、快速繁殖、培育无快速繁殖、培育无病毒植株病毒植株获得细胞或细胞分获得细胞或细胞分泌蛋白泌蛋白思考：思考：2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？培养材料？1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？何独特之处？3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？体？主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维