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1、关于酶工程原理及其在食品工业中的应用第一页，讲稿共一百零二页哦第一节第一节 酶工程原理和方法酶工程原理和方法（一）酶工程的定义（一）酶工程的定义（一）酶工程的定义（一）酶工程的定义 利用酶、菌体细胞具有的特异催化功能，或对酶结构进行修饰改利用酶、菌体细胞具有的特异催化功能，或对酶结构进行修饰改造，并借助于生物反应器和工艺优化过程，有效地发挥酶的催化特性造，并借助于生物反应器和工艺优化过程，有效地发挥酶的催化特性来生产人类所需产品的技术。它包括酶、细胞固定化技术、酶化学修来生产人类所需产品的技术。它包括酶、细胞固定化技术、酶化学修饰技术和酶反应器设计等。饰技术和酶反应器设计等。一、酶工程概述一、
2、酶工程概述一、酶工程概述一、酶工程概述第二页，讲稿共一百零二页哦酶工程一般工艺流程示意图酶工程一般工艺流程示意图 胞外酶胞外酶 胞内酶胞内酶 菌菌种种基基因因改改造造发发酵酵发发酵酵酶酶液液预预处处理理细细胞胞分分离离细细胞胞破破壁壁碎片分离碎片分离提取提取精制精制酶制剂及其改造酶制剂及其改造 酶制剂酶制剂 原料原料前处理前处理杀菌杀菌酶反应器酶反应器反应液反应液产品提取产品提取成品成品 第三页，讲稿共一百零二页哦（二）酶工程的发展历程（二）酶工程的发展历程（二）酶工程的发展历程（二）酶工程的发展历程 1.201.20世纪世纪50506060年代早期的酶工程技术，主要是从动物、年代早期的酶工程
3、技术，主要是从动物、植物和微生物原料中提取、分离、纯化制造各种酶制剂，植物和微生物原料中提取、分离、纯化制造各种酶制剂，并将其应用于化工、食品和医药等工业领域。并将其应用于化工、食品和医药等工业领域。2.202.20世纪世纪7070年代后期，酶的固定化技术取得了突破，年代后期，酶的固定化技术取得了突破，使固定化酶、固定化细胞、生物反应器与生物传感器等酶使固定化酶、固定化细胞、生物反应器与生物传感器等酶工程技术迅速获得应用。工程技术迅速获得应用。3.3.目前，各种酶工程技术已用于制造多种精细化工产目前，各种酶工程技术已用于制造多种精细化工产品和医药产品，并且在食品工业、化学检测和环境保护等品和医
4、药产品，并且在食品工业、化学检测和环境保护等各个领域中得到了有效的应用。各个领域中得到了有效的应用。第四页，讲稿共一百零二页哦二、酶制剂的生产二、酶制剂的生产 1.1.包括包括菌种的来源菌种的来源菌种的来源菌种的来源、产酶菌种的分离产酶菌种的分离产酶菌种的分离产酶菌种的分离、筛选筛选筛选筛选、育种育种育种育种和和酶的酶的酶的酶的发酵生产发酵生产发酵生产发酵生产等。等。2.2.酶生产菌的要求酶生产菌的要求酶生产菌的要求酶生产菌的要求 （1 1）不能是致病菌，特别是对食品用酶和医药用酶。目）不能是致病菌，特别是对食品用酶和医药用酶。目前认为可用于食品工业和医药工业的生产菌种有：枯草杆菌、前认为可用
5、于食品工业和医药工业的生产菌种有：枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉、啤酒酵母和脆壁酵母。黑曲霉、米曲霉、啤酒酵母和脆壁酵母。（2 2）不易退化，不易感染噬菌体。）不易退化，不易感染噬菌体。（3 3）产酶量高，而且最好产生胞外酶。）产酶量高，而且最好产生胞外酶。（4 4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易培养。）能利用廉价的原料，发酵周期短，易培养。第五页，讲稿共一百零二页哦三、微生物细胞的破碎三、微生物细胞的破碎三、微生物细胞的破碎三、微生物细胞的破碎 胞外酶胞外酶胞外酶胞外酶：能分泌透过细胞壁到细胞外部的酶。：能分泌透过细胞壁到细胞外部的酶。胞内酶胞内酶胞内酶胞内酶：存在于细胞内部的酶。：存在于细胞内
6、部的酶。对于胞内酶的提取，需要破碎技术，胞外酶则无需破碎。破对于胞内酶的提取，需要破碎技术，胞外酶则无需破碎。破碎的目的是将细胞壁和细胞膜破坏掉，使胞内物质释放出来，包碎的目的是将细胞壁和细胞膜破坏掉，使胞内物质释放出来，包括机械破碎法和非机械破碎法。括机械破碎法和非机械破碎法。第六页，讲稿共一百零二页哦（一）机械破碎法（一）机械破碎法（一）机械破碎法（一）机械破碎法 1.1.高压匀浆法高压匀浆法 适合于细菌和酵母的破碎，不适合于丝状真菌及某些基因适合于细菌和酵母的破碎，不适合于丝状真菌及某些基因工程菌。工程菌。2.2.珠磨法珠磨法 适合于各种微生物细胞的破碎。适合于各种微生物细胞的破碎。3.
7、3.超声破碎法超声破碎法 对杆菌的破碎较容易，对酵母菌的破碎效果较差。对杆菌的破碎较容易，对酵母菌的破碎效果较差。第七页，讲稿共一百零二页哦（二）非机械破碎法（二）非机械破碎法（二）非机械破碎法（二）非机械破碎法 1.1.酶溶法酶溶法 加酶法加酶法加酶法加酶法:常用的有溶菌酶、蛋白酶、糖苷酶等，它们对细常用的有溶菌酶、蛋白酶、糖苷酶等，它们对细胞壁或细胞膜进行酶解，使细胞破碎。胞壁或细胞膜进行酶解，使细胞破碎。自溶法自溶法自溶法自溶法：在微生物生长代谢过程中，控制一定条件，诱发：在微生物生长代谢过程中，控制一定条件，诱发微生物产生少量的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细微生物产生少量的溶胞
8、酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。胞自溶的目的。2.2.化学渗透法化学渗透法 用用有有机机溶溶剂剂、变变性性剂剂、表表面面活活性性剂剂、抗抗生生素素或或金金属属螯螯合合物物等等处处理理，使使细细胞胞壁壁或或膜膜的的通通透透性性（渗渗透透性性）改改变变，从从而使胞内物质有选择地渗透出来。而使胞内物质有选择地渗透出来。第八页，讲稿共一百零二页哦四、酶的提取与纯化四、酶的提取与纯化 酶的提取酶的提取酶的提取酶的提取:在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称作酶的抽提，即初步纯化。常用的方充分溶解到溶剂中的过程，
9、也称作酶的抽提，即初步纯化。常用的方法：法：盐溶液提取盐溶液提取盐溶液提取盐溶液提取、酸溶液提取酸溶液提取酸溶液提取酸溶液提取、碱溶液提取碱溶液提取碱溶液提取碱溶液提取、有机溶剂提取有机溶剂提取有机溶剂提取有机溶剂提取。酶的精制酶的精制酶的精制酶的精制:即高度纯化。常用的方法：即高度纯化。常用的方法：沉淀法沉淀法沉淀法沉淀法、超滤法超滤法超滤法超滤法、色色色色谱分离法谱分离法谱分离法谱分离法、结晶法结晶法结晶法结晶法等。其中沉淀法和超滤法既可用于初步纯化，也等。其中沉淀法和超滤法既可用于初步纯化，也可用于精制。可用于精制。第九页，讲稿共一百零二页哦（一）根据酶分子溶解度不同的方法（一）根据酶分
10、子溶解度不同的方法（一）根据酶分子溶解度不同的方法（一）根据酶分子溶解度不同的方法 通过改变某些条件，使溶液中某种物质的溶解度降低，通过改变某些条件，使溶液中某种物质的溶解度降低，从溶液中沉淀析出，达到与其他物质分离的目的。从溶液中沉淀析出，达到与其他物质分离的目的。1.1.盐析沉淀法盐析沉淀法 通常采用的盐有硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、硫酸镁、氯化钠和通常采用的盐有硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用，因为它在水中的溶解度大而温磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用，因为它在水中的溶解度大而温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。度系数小，不影响酶的活性，
11、分离效果好，而且价廉易得。盐析沉淀所得到的产品常含有大量盐分，一般可用超滤或盐析沉淀所得到的产品常含有大量盐分，一般可用超滤或层析等方法脱盐，使酶进一步纯化。层析等方法脱盐，使酶进一步纯化。第十页，讲稿共一百零二页哦 2.2.等电点沉淀法等电点沉淀法 在酶的沉淀分离中，等电点沉淀法经常与盐析沉淀、有在酶的沉淀分离中，等电点沉淀法经常与盐析沉淀、有机溶剂沉淀和复合沉淀等方法一起使用，使其沉淀完全。机溶剂沉淀和复合沉淀等方法一起使用，使其沉淀完全。3.3.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 利用酶等物质在有机溶剂中的溶解度不同而使其分离。常用的利用酶等物质在有机溶剂中的溶解度不同而使其分离。常用的有机溶
12、剂有有机溶剂有乙醇乙醇乙醇乙醇、丙酮、异丙酮、甲醇等。、丙酮、异丙酮、甲醇等。4.4.复合沉淀法复合沉淀法 在酶液中加入某些高分子聚合物，例如，单宁，使它与酶在酶液中加入某些高分子聚合物，例如，单宁，使它与酶形成复合物而沉淀下来，分离出沉淀后，再用适当方法将酶从形成复合物而沉淀下来，分离出沉淀后，再用适当方法将酶从复合物中重新析出。复合物中重新析出。第十一页，讲稿共一百零二页哦（二）根据酶分子大小和形状不同的方法（二）根据酶分子大小和形状不同的方法（二）根据酶分子大小和形状不同的方法（二）根据酶分子大小和形状不同的方法 1.1.离心分离法离心分离法 在酶的提取分离纯化过程中，细胞的收集、细胞碎
13、片和在酶的提取分离纯化过程中，细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离以及酶的纯化等往往要使用离心分离。沉淀的分离以及酶的纯化等往往要使用离心分离。第十二页，讲稿共一百零二页哦 2.2.体积排阻法体积排阻法 利用具有一定大小网状的凝胶颗粒（固定相）填充柱的利用具有一定大小网状的凝胶颗粒（固定相）填充柱的分子筛作用，利用溶液中各组分的相对分子质量不同来进行分子筛作用，利用溶液中各组分的相对分子质量不同来进行层析分离的一种方法。常用的凝胶有琼脂糖凝胶层析分离的一种方法。常用的凝胶有琼脂糖凝胶（SepharoseSepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（）、聚丙烯酰胺凝胶（BiogelBiogel）和葡聚糖凝胶
14、）和葡聚糖凝胶（SephadexSephadex）等。）等。第十三页，讲稿共一百零二页哦第十四页，讲稿共一百零二页哦 3.3.透析透析 透析膜可用动物膜、羊皮纸、火棉胶或塞璐玢等制成。透析膜可用动物膜、羊皮纸、火棉胶或塞璐玢等制成。使用时可做成透析管、透析袋或透析槽等形式。使用时可做成透析管、透析袋或透析槽等形式。优点优点优点优点：设备简单，操作简便。：设备简单，操作简便。缺点缺点缺点缺点：时间长，若不更换水或缓冲液时，只扩散到膜内外：时间长，若不更换水或缓冲液时，只扩散到膜内外平衡为止。透析结束时，透析袋内的保留液体积较大，浓度较平衡为止。透析结束时，透析袋内的保留液体积较大，浓度较低。低。
15、透析主要用于酶、蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化，从透析主要用于酶、蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化，从中除去小分子物质。透析在酶纯化过程中极为常用，通过透析可以中除去小分子物质。透析在酶纯化过程中极为常用，通过透析可以除去酶液中的盐类、有机溶剂、低相对分子质量的抑制剂等。除去酶液中的盐类、有机溶剂、低相对分子质量的抑制剂等。第十五页，讲稿共一百零二页哦 4.4.超滤超滤 借助于超滤膜将不同相对分子质量的物质分离的技术，是在借助于超滤膜将不同相对分子质量的物质分离的技术，是在一定的正压力或负压力驱动下，将料液强制通过一定孔径的超滤一定的正压力或负压力驱动下，将料液强制通过一定孔径的超滤膜，
16、部分小分子的溶质和溶剂透过膜而成为超滤液，而大分子的膜，部分小分子的溶质和溶剂透过膜而成为超滤液，而大分子的酶和蛋白质等物质被截留，从而达到分离纯化的目的，也可用于酶和蛋白质等物质被截留，从而达到分离纯化的目的，也可用于酶液的浓缩和脱色。超滤膜截留的颗粒直径范围为酶液的浓缩和脱色。超滤膜截留的颗粒直径范围为2 2200nm200nm，相，相当于相对分子质量当于相对分子质量10001000500000500000。构成超滤膜的主要材料有醋酸纤维、尼龙、聚砜、陶瓷等。构成超滤膜的主要材料有醋酸纤维、尼龙、聚砜、陶瓷等。第十六页，讲稿共一百零二页哦（三）根据酶分子电荷性质的方法（三）根据酶分子电荷性
17、质的方法（三）根据酶分子电荷性质的方法（三）根据酶分子电荷性质的方法 1.1.离子交换层析离子交换层析 根据被分离物质与分离介质（离子交换剂）间异种电荷的静电根据被分离物质与分离介质（离子交换剂）间异种电荷的静电引力的不同来进行物质分离的。不同离子交换剂上的可解离基团对引力的不同来进行物质分离的。不同离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同，而使不同物质分离。各种离子的亲和力不同，而使不同物质分离。离子交换剂根据活性基团的性质分为离子交换剂根据活性基团的性质分为阳离子交换剂阳离子交换剂阳离子交换剂阳离子交换剂和和阴离子阴离子阴离子阴离子交换剂交换剂交换剂交换剂。酶具有两性性质，可用阳离子
18、交换剂，也可用阴离子交换。酶具有两性性质，可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。剂进行酶的分离纯化。第十七页，讲稿共一百零二页哦 2.2.电泳分离电泳分离 在外电场作用下，不同蛋白质离子所带净电荷的多少和性质不在外电场作用下，不同蛋白质离子所带净电荷的多少和性质不同，因而其向两极泳动的方向和速度也不相同，从而达到分离的目同，因而其向两极泳动的方向和速度也不相同，从而达到分离的目的。为了减少对流扩散，电泳过程一般在浸透了缓冲液的聚丙烯酰的。为了减少对流扩散，电泳过程一般在浸透了缓冲液的聚丙烯酰胺凝胶、淀粉胶等介质上进行。电泳分离的蛋白质量通常较小（约胺凝胶、淀粉胶等介质上进行。电
19、泳分离的蛋白质量通常较小（约数毫克），常用作分析用。但现在已发展了制备电泳，用这种方法数毫克），常用作分析用。但现在已发展了制备电泳，用这种方法制备的酶，可以在介质中洗脱或直接从电泳柱底部依次流出。制备的酶，可以在介质中洗脱或直接从电泳柱底部依次流出。第十八页，讲稿共一百零二页哦 3.3.等电聚焦电泳等电聚焦电泳 先从阳极顶端扩散装入一种酸（如磷酸），然后从阴极端扩散装先从阳极顶端扩散装入一种酸（如磷酸），然后从阴极端扩散装入一种碱（如乙醇胺），用具有不同等电点的脂肪族聚氨基聚羧基化入一种碱（如乙醇胺），用具有不同等电点的脂肪族聚氨基聚羧基化合物作为两性电介质载体，当阴阳两极通电以后电介质在一
20、定范围内合物作为两性电介质载体，当阴阳两极通电以后电介质在一定范围内便形成便形成pHpH值梯度，当该载体电介质同样品一起电泳时，蛋白质便朝值梯度，当该载体电介质同样品一起电泳时，蛋白质便朝其各自等电点相等的其各自等电点相等的pHpH值位置移动而被浓缩。值位置移动而被浓缩。优点优点优点优点：不但可将各种酶精确分开，通过测定各段的：不但可将各种酶精确分开，通过测定各段的pHpH值还可值还可以了解该酶的等电点。可以分离和检出等电点相差仅以了解该酶的等电点。可以分离和检出等电点相差仅0.020.02的两的两种蛋白质成分。种蛋白质成分。第十九页，讲稿共一百零二页哦（四）根据酶分子专一性结合的分离方法（四
21、）根据酶分子专一性结合的分离方法（四）根据酶分子专一性结合的分离方法（四）根据酶分子专一性结合的分离方法 1.1.亲和层析亲和层析 酶的底物、底物类似物及酶的竞争性抑制剂同酶之间有着较酶的底物、底物类似物及酶的竞争性抑制剂同酶之间有着较高的亲和力，可作为配基固定于不溶性载体，可选择性地将酶吸高的亲和力，可作为配基固定于不溶性载体，可选择性地将酶吸附而同杂质分离。然后可以通过改变缓冲液的离子强度和附而同杂质分离。然后可以通过改变缓冲液的离子强度和pHpH值的值的方法，也可以使用浓度更高的同一配体溶液或亲和力更强的配方法，也可以使用浓度更高的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液，将酶洗脱下来体溶液，
22、将酶洗脱下来。2.2.免疫吸附层析免疫吸附层析 利用抗原一抗体的高亲和性反应原理进行酶的分离纯化。利用抗原一抗体的高亲和性反应原理进行酶的分离纯化。第二十页，讲稿共一百零二页哦第二十一页，讲稿共一百零二页哦（五）酶分离纯化的原则（五）酶分离纯化的原则（五）酶分离纯化的原则（五）酶分离纯化的原则 一一般般来来说说，根根据据溶溶解解度度变变化化的的纯纯化化方方法法较较适适宜宜于于早早期期纯纯化化阶阶段段，规规模模较较大大；而而柱柱层层析析法法或或电电泳泳分分离离更更适适宜宜于于后后期期的的纯纯化化过过程程，规规模模较较小小。硫硫酸酸铵铵沉沉淀淀法法等等纯纯化化速速度度快快一一些些，柱柱层层析析纯纯
23、化化速速度度慢慢一一些些。某某些些价价格格昂昂贵贵的的层层析析介介质质及及方法，可只用于纯化过程的最后几步。方法，可只用于纯化过程的最后几步。第二十二页，讲稿共一百零二页哦（六）酶的分离纯化应注意的问题（六）酶的分离纯化应注意的问题（六）酶的分离纯化应注意的问题（六）酶的分离纯化应注意的问题 1.1.要注意防止酶变性失活要注意防止酶变性失活 低温、不能过酸、过碱等。低温、不能过酸、过碱等。2.2.酶分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能除去，因酶分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能除去，因此选择分离方法是应尽可能不破坏酶所需要的条件。此选择分离方法是应尽可能不破坏酶所需要的条件。3.3.
24、通过检测酶活性，为选择适当方法和条件提供了直接通过检测酶活性，为选择适当方法和条件提供了直接依据。依据。一个好的酶分离纯化的方法和措施是使酶的纯度提高倍数一个好的酶分离纯化的方法和措施是使酶的纯度提高倍数大，活力回收高，同时重复性好。大，活力回收高，同时重复性好。第二十三页，讲稿共一百零二页哦（七）酶的纯度与酶活力（七）酶的纯度与酶活力（七）酶的纯度与酶活力（七）酶的纯度与酶活力 许多分离方法都可用于检验酶的纯度，实验室常用聚丙许多分离方法都可用于检验酶的纯度，实验室常用聚丙烯酰胺凝胶电泳来检验酶的纯度。酶分子结构高度复杂，同烯酰胺凝胶电泳来检验酶的纯度。酶分子结构高度复杂，同一种酶制剂，采用
25、不同方法检验结果可能不一致，酶的纯度一种酶制剂，采用不同方法检验结果可能不一致，酶的纯度应注明达到哪种纯度，如电泳纯、应注明达到哪种纯度，如电泳纯、HPLCHPLC纯等。纯等。比活力比活力比活力比活力：每毫克酶蛋白具有的酶活力单位数。一般情况下，酶：每毫克酶蛋白具有的酶活力单位数。一般情况下，酶的比活力随酶的纯度的提高而提高。酶的纯度也可用酶的比活力来的比活力随酶的纯度的提高而提高。酶的纯度也可用酶的比活力来衡量。衡量。第二十四页，讲稿共一百零二页哦 测测定定酶酶活活力力可可采采用用中中中中止止止止反反反反应应应应法法法法、连连连连续续续续反反反反应应应应法法法法，或或采采用用自自自自动动动动
26、化化化化酶分析仪酶分析仪酶分析仪酶分析仪操作进行。操作进行。中止反应法中止反应法中止反应法中止反应法:在恒温反应系统中进行酶促反应，间隔一定的在恒温反应系统中进行酶促反应，间隔一定的时间，分几次取出一定容积的反应液，使酶停止作用，然后分析时间，分几次取出一定容积的反应液，使酶停止作用，然后分析产物的生成量或底物的消耗量。几乎所有的酶都可根据这一原理，产物的生成量或底物的消耗量。几乎所有的酶都可根据这一原理，设计出测定其活力的具体方法。设计出测定其活力的具体方法。连续反应法连续反应法连续反应法连续反应法:不需要取样中止反应，而是基于反应过程中光谱不需要取样中止反应，而是基于反应过程中光谱吸收、气
27、体体积、酸碱度、温度、黏度等的变化，用仪器跟踪检测反吸收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等的变化，用仪器跟踪检测反应进行的过程，记录结果，算出酶活力。连续法使用方便，一个样品应进行的过程，记录结果，算出酶活力。连续法使用方便，一个样品可多次测定，但很多酶反应不能用该法测定。可多次测定，但很多酶反应不能用该法测定。自动化酶分析仪自动化酶分析仪自动化酶分析仪自动化酶分析仪:从加样、启动反应、检测、数据记录及从加样、启动反应、检测、数据记录及结果处理等，整个过程均由仪器自动完成。结果处理等，整个过程均由仪器自动完成。第二十五页，讲稿共一百零二页哦六、酶的固定化六、酶的固定化（一）酶的固定化方法（一）酶
28、的固定化方法（一）酶的固定化方法（一）酶的固定化方法 1.1.吸附法吸附法 （1 1）物理吸附法。酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化）物理吸附法。酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方法。吸附的载体：包括方法。吸附的载体：包括无机载体无机载体无机载体无机载体（活性炭、石英砂、多孔玻（活性炭、石英砂、多孔玻璃、氧化铝、硅胶、磷酸钙）和璃、氧化铝、硅胶、磷酸钙）和有机载体有机载体有机载体有机载体（淀粉、谷蛋白、（淀粉、谷蛋白、纤维素、葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺）等。纤维素、葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺）等。优点优点优点优点：具有不破坏酶活性中心和酶高级结构变化少，若：具有不破坏酶活性中心和酶高级结
29、构变化少，若能找到适当的载体，这是简单的好方法。能找到适当的载体，这是简单的好方法。缺点缺点缺点缺点：酶与载体结合力弱、酶易脱落等。：酶与载体结合力弱、酶易脱落等。第二十六页，讲稿共一百零二页哦 （2 2）离子吸附法。通过离子效应，将酶分子固定到含有离）离子吸附法。通过离子效应，将酶分子固定到含有离子交换基团的固相载体上。子交换基团的固相载体上。常见的载体常见的载体常见的载体常见的载体：DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶、CM-CM-纤维纤维素、素、DOWEX-50DOWEX-50等。等。优点优点优点优点：操作简单，处理条件温和，能得到酶活回收率较：
30、操作简单，处理条件温和，能得到酶活回收率较高的固定化酶。高的固定化酶。缺点缺点缺点缺点：酶与载体的结合力较弱，当离子强度高、缓冲液：酶与载体的结合力较弱，当离子强度高、缓冲液种类或种类或pHpH值发生变化时，酶容易脱落。值发生变化时，酶容易脱落。第二十七页，讲稿共一百零二页哦 2.2.化学结合法化学结合法 （1 1）共价结合法。将载体有关基团活化、与酶分子上的）共价结合法。将载体有关基团活化、与酶分子上的功能团发生化学反应形成共价键的一种固定化方法，是研究功能团发生化学反应形成共价键的一种固定化方法，是研究得最多的固定化方法之一。得最多的固定化方法之一。可与载体结合的酶的功能团：可与载体结合的
31、酶的功能团：或或-NH-NH2 2，、或或-羧基，巯基，咪唑基，酚基等，但参与共价结合的氨基酸残基应当是羧基，巯基，咪唑基，酚基等，但参与共价结合的氨基酸残基应当是酶催化活性的非必需基因，否则可能会导致固定后酶活力完全丧失。酶催化活性的非必需基因，否则可能会导致固定后酶活力完全丧失。特点特点特点特点：反应条件苛刻，操作复杂，容易使酶的高级结构：反应条件苛刻，操作复杂，容易使酶的高级结构发生变化而破坏活性中心，操作时需注意。发生变化而破坏活性中心，操作时需注意。第二十八页，讲稿共一百零二页哦 （2 2）共共价价交交联联法法。通通过过双双功功能能或或多多功功能能试试剂剂（交交联联剂剂），在在酶酶分
32、分子子之之间间或或酶酶分分子子与与微微生生物物细细胞胞之之间间形形成成共共价价键键的的连连接接方方法法。它它与与共价结合法的区别是它使用交联剂而不用载体。共价结合法的区别是它使用交联剂而不用载体。常常用用的的交交联联剂剂：戊戊二二醛醛、异异氰氰酸酸酯酯、顺顺丁丁烯烯二二酸酸酐酐和和乙乙烯烯共共聚聚物等。物等。特点特点特点特点：反应条件比较激烈，固定化酶的活力回收率较低，：反应条件比较激烈，固定化酶的活力回收率较低，但尽量降低交联剂浓度和缩短反应时间，会有助于固定化酶但尽量降低交联剂浓度和缩短反应时间，会有助于固定化酶比活力的提高。比活力的提高。第二十九页，讲稿共一百零二页哦 3.3.包埋法包埋
33、法 可分为可分为凝胶网格型凝胶网格型凝胶网格型凝胶网格型和和微囊型微囊型微囊型微囊型。将酶或微生物包埋在高分。将酶或微生物包埋在高分子凝胶网格中的包埋法称为子凝胶网格中的包埋法称为凝胶网格包埋型凝胶网格包埋型凝胶网格包埋型凝胶网格包埋型，将其包埋在高分，将其包埋在高分子半透膜中的包埋法称为子半透膜中的包埋法称为微囊型微囊型微囊型微囊型。优点优点优点优点：一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基起结合反应，较：一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基起结合反应，较少改变酶的高级结构，酶活力的回收率较高。少改变酶的高级结构，酶活力的回收率较高。缺点缺点缺点缺点：仅适用于小分子底物和产物的酶，因为只有小分子：仅适用于小
34、分子底物和产物的酶，因为只有小分子物质才能扩散进入高分子凝胶的网格，并且这种扩散阻力还会物质才能扩散进入高分子凝胶的网格，并且这种扩散阻力还会导致固定化酶动力学行为的改变和酶活力的降低。导致固定化酶动力学行为的改变和酶活力的降低。第三十页，讲稿共一百零二页哦 （1 1）凝胶网格型。采用明胶、卡拉胶、海藻酸钠或淀粉）凝胶网格型。采用明胶、卡拉胶、海藻酸钠或淀粉等天然高分子化合物作为包埋剂时，可以将酶直接与溶胶等天然高分子化合物作为包埋剂时，可以将酶直接与溶胶态的包埋剂混合凝胶化。态的包埋剂混合凝胶化。缺点缺点缺点缺点：凝胶孔径不规则，有一部分大于平均孔径，时间稍：凝胶孔径不规则，有一部分大于平均
35、孔径，时间稍长时，酶容易泄漏。常与交联法结合达到加固的目的，如先用长时，酶容易泄漏。常与交联法结合达到加固的目的，如先用明胶包埋，再用戊二醛交联等。明胶包埋，再用戊二醛交联等。第三十一页，讲稿共一百零二页哦 （2 2）微囊型。利用各种类型的膜将酶封闭起来，这类膜能使）微囊型。利用各种类型的膜将酶封闭起来，这类膜能使小分子产物和底物通过，而酶和其他的高分子不能通过。小分子产物和底物通过，而酶和其他的高分子不能通过。缺点缺点缺点缺点：反应条件要求高，制备成本高。：反应条件要求高，制备成本高。第三十二页，讲稿共一百零二页哦第三十三页，讲稿共一百零二页哦（二）细胞的固定化方法（二）细胞的固定化方法（二
36、）细胞的固定化方法（二）细胞的固定化方法 细胞固定化的主要方法有用载体对细胞的细胞固定化的主要方法有用载体对细胞的包埋法包埋法包埋法包埋法和利用载体和利用载体与细胞之间吸引力的与细胞之间吸引力的吸附法吸附法吸附法吸附法两种。固定化细胞的制备方法类似两种。固定化细胞的制备方法类似于固定化酶的制备方法。于固定化酶的制备方法。优点优点优点优点：固定化后酶活基本没有损失，它还保留了细胞原有的多：固定化后酶活基本没有损失，它还保留了细胞原有的多酶系统，对于多步催化转换的反应，优势更加明显，而且勿需辅酶酶系统，对于多步催化转换的反应，优势更加明显，而且勿需辅酶的产生。的产生。缺点缺点缺点缺点：在选用固定化
37、细胞作为催化剂时，应考虑到底物和产：在选用固定化细胞作为催化剂时，应考虑到底物和产物是否容易通过细胞膜，膜内是否存在产物分解系统和其他副反应物是否容易通过细胞膜，膜内是否存在产物分解系统和其他副反应系统，或者说虽有这两种系统，但是否可事先用热处理或系统，或者说虽有这两种系统，但是否可事先用热处理或pHpH值调值调整等简单方法使之失效。整等简单方法使之失效。第三十四页，讲稿共一百零二页哦（三）固定化酶（细胞）的性质（三）固定化酶（细胞）的性质（三）固定化酶（细胞）的性质（三）固定化酶（细胞）的性质 1.1.酶活力的变化酶活力的变化 酶经固定化后，酶分子的构象可能改变，导致了酶与底酶经固定化后，酶
38、分子的构象可能改变，导致了酶与底物结合能力或催化底物转化能力发生变化；载体的存在给酶物结合能力或催化底物转化能力发生变化；载体的存在给酶的活性部位或调节部位造成某种空间障碍，影响酶与底物的的活性部位或调节部位造成某种空间障碍，影响酶与底物的作用；酶包埋于载体，底物必须扩散进入载体才能和酶分子作用；酶包埋于载体，底物必须扩散进入载体才能和酶分子接触，扩散速率的不同限制了酶与底物的作用。接触，扩散速率的不同限制了酶与底物的作用。第三十五页，讲稿共一百零二页哦 2.2.酶稳定性的变化酶稳定性的变化 经固定化后，大多数酶的稳定性提高，这对实际应用十分有利。经固定化后，大多数酶的稳定性提高，这对实际应用
39、十分有利。固定化酶的稳定性常用固定化酶的稳定性常用半衰期半衰期半衰期半衰期（t t1/21/2）表示，即固定化酶活力降为）表示，即固定化酶活力降为最初活力一半所经历的连续工作时间。它是衡量固定化酶操作稳定最初活力一半所经历的连续工作时间。它是衡量固定化酶操作稳定性的关键。性的关键。3.3.最适最适pHpH值的变化值的变化 氢氢离离子子在在溶溶液液和和固固定定化化酶酶之之间间的的分分配配效效应应，对对反反应应速速度度具具有有重重要要影影响响。如如果果酶酶反反应应产产生生酸酸或或消消耗耗酸酸时时，pHpH值值曲曲线线会会发发生生显显著著变变化（曲线向右移动或向左移动），最适化（曲线向右移动或向左移
40、动），最适pHpH值也会相应变化。值也会相应变化。第三十六页，讲稿共一百零二页哦 4.4.最适温度的变化最适温度的变化 酶反应的最适温度是酶失活速度与酶反应速度综合的结果。酶反应的最适温度是酶失活速度与酶反应速度综合的结果。在一般情况下，固定化后酶的失活速度下降，最适温度也随之在一般情况下，固定化后酶的失活速度下降，最适温度也随之提高。提高。5.5.动力学常数的变化动力学常数的变化 酶固定于酶固定于电中性载体电中性载体电中性载体电中性载体后，表观米氏常数往往比游离酶的米氏后，表观米氏常数往往比游离酶的米氏常数高，而最大反应速度变小；而当底物与带有常数高，而最大反应速度变小；而当底物与带有相反电
41、荷相反电荷相反电荷相反电荷的载体的载体结合后，表观米氏常数往往减小，这对固定化酶实际应用有利。结合后，表观米氏常数往往减小，这对固定化酶实际应用有利。此外，在高离子强度下，酶的动力学常数几乎不变。此外，在高离子强度下，酶的动力学常数几乎不变。第三十七页，讲稿共一百零二页哦（四）固定化酶（细胞）的评价指标（四）固定化酶（细胞）的评价指标（四）固定化酶（细胞）的评价指标（四）固定化酶（细胞）的评价指标 1.1.相对酶活力相对酶活力 具具有有相相同同重重量量酶酶蛋蛋白白的的固固定定化化酶酶与与游游离离酶酶活活力力的的比比值值。它它与与载载体体结结构构、颗颗粒粒大大小小、底底物物相相对对分分子子质质量
42、量及及酶酶的的结结合合效效率有关。相对酶活力低于率有关。相对酶活力低于75%75%的固定化酶，一般无实际应用价值。的固定化酶，一般无实际应用价值。2.2.酶的活力回收率酶的活力回收率 固定化酶的总活力与用于固定化的酶总活力的百分比。固定化酶的总活力与用于固定化的酶总活力的百分比。一般情况下，活力回收率应小于一般情况下，活力回收率应小于l l。第三十八页，讲稿共一百零二页哦（五）固定化酶的优缺点（五）固定化酶的优缺点（五）固定化酶的优缺点（五）固定化酶的优缺点 优点优点优点优点：极易将产物和底物分开；可以在较长时间内进行反复分：极易将产物和底物分开；可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应
43、；在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；批反应和装柱连续反应；在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；酶反应过程可以严格控制；产物中没有酶的残留，简化了工业设备；酶反应过程可以严格控制；产物中没有酶的残留，简化了工业设备；较水溶性酶更适合于多酶反应；可以增加产物的收得率，提高产物较水溶性酶更适合于多酶反应；可以增加产物的收得率，提高产物的质量；酶使用效率提高，成本降低。的质量；酶使用效率提高，成本降低。缺点缺点缺点缺点：固定化时，酶活力有损失；增加了固定化的成本，：固定化时，酶活力有损失；增加了固定化的成本，工厂投资开始增大；只能用于水溶性底物，而且较适用于小工厂投资开始增大；只能用于水溶性底物，而
44、且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜；与完整菌体相比，不适合分子底物，对大分子底物不适宜；与完整菌体相比，不适合多酶反应，特别是需要辅助因子的反应；胞内酶必须经过酶多酶反应，特别是需要辅助因子的反应；胞内酶必须经过酶的分离过程。的分离过程。第三十九页，讲稿共一百零二页哦第二节第二节 酶工程在食品工业中的应用酶工程在食品工业中的应用（一）（一）（一）（一）淀粉糖加工淀粉糖加工淀粉糖加工淀粉糖加工 1.1.-淀粉酶（淀粉酶（EC3.2.1.1EC3.2.1.1）淀粉内切酶，能随机水解直链或支链淀粉分子淀粉内切酶，能随机水解直链或支链淀粉分子-1,4-1,4-1,4-1,4-糖苷键糖苷键糖苷键糖
45、苷键生成不同长度的寡糖，液化淀粉速度快，最终产物为生成不同长度的寡糖，液化淀粉速度快，最终产物为-极限糊精和极限糊精和少量的葡萄糖及麦芽糖。少量的葡萄糖及麦芽糖。细菌细菌-淀粉酶热稳定性高，主要用于淀粉高温液化，作用淀粉酶热稳定性高，主要用于淀粉高温液化，作用条件一般为条件一般为8585，pH5.5pH5.57.07.0。一、酶工程与食品加工一、酶工程与食品加工第四十页，讲稿共一百零二页哦 2.-2.-淀粉酶（淀粉酶（EC3.2.1.2EC3.2.1.2）一种淀粉外切酶，在淀粉链非还原性末端水解一种淀粉外切酶，在淀粉链非还原性末端水解-1,4-1,4-1,4-1,4-糖糖糖糖苷键苷键苷键苷键，
46、产生麦芽糖。与，产生麦芽糖。与-淀粉酶相同，淀粉酶相同，-淀粉酶也不能水解淀粉酶也不能水解-1,6-1,6-糖苷键，形成糖苷键，形成-极限糊精，麦芽糖的含量仅为极限糊精，麦芽糖的含量仅为60%60%。如果将如果将-淀粉酶与脱支酶联合应用可将淀粉水解成麦芽糖。淀粉酶与脱支酶联合应用可将淀粉水解成麦芽糖。-淀粉酶较佳作用条件为淀粉酶较佳作用条件为pH6.5pH6.57.07.0，温度，温度5050。第四十一页，讲稿共一百零二页哦 3.3.葡萄糖淀粉酶（葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3EC3.2.1.3）也称糖化酶，主要催化淀粉和寡糖的也称糖化酶，主要催化淀粉和寡糖的-1,4-1,4-1,4-1,4
47、-糖苷键糖苷键糖苷键糖苷键水解，水解，从分子的非还原性末端释放出从分子的非还原性末端释放出-葡萄糖分子。此酶还可缓葡萄糖分子。此酶还可缓慢水解慢水解-1,6-1,6糖苷键和糖苷键和-1,3-1,3糖苷键，水解后生成糖苷键，水解后生成DEDEDEDE值为值为97979898，葡萄糖含量为，葡萄糖含量为95%95%97%(w97%(ww)w)的葡萄糖浆。生成的葡萄糖的葡萄糖浆。生成的葡萄糖浆也可以脱水得到结晶葡萄糖，或用作高果糖浆的原料。浆也可以脱水得到结晶葡萄糖，或用作高果糖浆的原料。在在pH4.5pH4.5、35356060时，可将时，可将-淀粉酶生成的糊精转变成葡淀粉酶生成的糊精转变成葡萄糖
48、。葡萄糖淀粉酶对萄糖。葡萄糖淀粉酶对-1,6-1,6糖苷键活性较低，这样达到所糖苷键活性较低，这样达到所需要的水解程度，要加大酶用量或延长保温时间，或将该需要的水解程度，要加大酶用量或延长保温时间，或将该酶与脱支酶联用。酶与脱支酶联用。第四十二页，讲稿共一百零二页哦 4.4.葡萄糖异构酶（葡萄糖异构酶（EC5.3.1.5EC5.3.1.5）能够将葡萄糖转化成果糖，它是加工果糖和高果糖浆（能够将葡萄糖转化成果糖，它是加工果糖和高果糖浆（HFCSHFCS）的重要酶类。能产生葡萄糖异构酶的微生物主要有芽孢杆菌、链霉的重要酶类。能产生葡萄糖异构酶的微生物主要有芽孢杆菌、链霉菌、密苏里游动放线菌等。菌、
49、密苏里游动放线菌等。在在pH7.5pH7.58.08.0、55556060下作用效果良好。下作用效果良好。MgMg2+2+是葡萄糖异是葡萄糖异构酶的稳定剂和激活剂，木糖可用于这种酶的诱导。构酶的稳定剂和激活剂，木糖可用于这种酶的诱导。第四十三页，讲稿共一百零二页哦 5.5.5.5.脱支酶脱支酶 （1 1）异淀粉酶）异淀粉酶:能够专一作用于支链淀粉中的能够专一作用于支链淀粉中的-1,6-1,6-1,6-1,6-糖苷糖苷糖苷糖苷键键键键，对于链结构中的，对于链结构中的-1,6-1,6-1,6-1,6-糖苷键糖苷键糖苷键糖苷键不能水解。将这种酶同葡萄糖不能水解。将这种酶同葡萄糖淀粉酶一起使用，可以产
50、生淀粉酶一起使用，可以产生DEDE9696的葡萄糖浆；与的葡萄糖浆；与-淀粉酶一淀粉酶一起使用，可将液化后的淀粉浆转化成麦芽糖浆，麦芽糖的产量比起使用，可将液化后的淀粉浆转化成麦芽糖浆，麦芽糖的产量比-淀粉酶单独作用时显著增加。淀粉酶单独作用时显著增加。（2 2）普鲁蓝酶）普鲁蓝酶:普鲁蓝为多聚麦芽三糖，是许多麦芽三糖经由普鲁蓝为多聚麦芽三糖，是许多麦芽三糖经由-1,6-1,6-1,6-1,6-糖苷键糖苷键糖苷键糖苷键聚合的多糖。聚合的多糖。第四十四页，讲稿共一百零二页哦 实例实例实例实例 果葡糖浆果葡糖浆果葡糖浆果葡糖浆 1.1.果葡糖浆的功能和应用果葡糖浆的功能和应用 以以淀淀粉粉为为原原