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1、工工业化植物化植物细胞培养系胞培养系统主要有两大主要有两大类：悬浮浮细胞培养系胞培养系统和固定化和固定化细胞培养系胞培养系统植物细胞植物细胞植物细胞制备机械法机械法酶法酶法愈伤组织诱导法愈伤组织诱导法不断继代培养愈伤组织，通过流体剪切不断继代培养愈伤组织，通过流体剪切力和振动，使植物细胞从结构非常松散的愈伤力和振动，使植物细胞从结构非常松散的愈伤组织中释放出来，得到悬浮的植物细胞组织中释放出来，得到悬浮的植物细胞植物细胞分离植物细胞分离 -悬浮培养系建立悬浮培养系建立调节培养基组分调节培养基组分 疏松的愈伤组织疏松的愈伤组织在液体培养基中继代培养若干次在液体培养基中继代培养若干次建立稳定的悬浮
2、培养植物细胞系建立稳定的悬浮培养植物细胞系植物细胞特性植物细胞特性叶绿体叶绿体液泡液泡细胞核细胞核细胞膜细胞膜内网质膜内网质膜线粒体线粒体高尔基体高尔基体与微生物的比较与微生物的比较植物细胞培养的人工环境植物细胞培养的人工环境物理因素物理因素光光：光光照照时时间间与与光光照照强强度度视视具具体体的的植植物物细胞的生理特性而定细胞的生理特性而定 温度温度：通常在：通常在25 C-28 C之间之间 pH：56之间之间 氧：氧：好氧好氧溶氧溶氧：溶氧浓度往往有最适范围：溶氧浓度往往有最适范围碳源碳源：蔗糖作为碳源。：蔗糖作为碳源。氮源氮源：含无机氮，如硝酸盐和铵盐等。有的细胞株还需要加入：含无机氮，
3、如硝酸盐和铵盐等。有的细胞株还需要加入有机氮，如酵母提取液。有机氮，如酵母提取液。植物激素植物激素：调节细胞生长、分化和次生物质代谢，：调节细胞生长、分化和次生物质代谢，IAA和和2,4-D 其它成分其它成分：如金属离子和有机添加物：如金属离子和有机添加物植物细胞培养的人工环境植物细胞培养的人工环境化学因素化学因素植物细胞培养与次生代谢植物细胞培养与次生代谢类似于青霉素的生产，大多植物有效成分积累类似于青霉素的生产，大多植物有效成分积累与细胞生长非关联，而往往在细胞生长达平衡与细胞生长非关联，而往往在细胞生长达平衡时开始时开始次生代谢物积累于细胞胞内的液泡中，分离提次生代谢物积累于细胞胞内的液
4、泡中，分离提取首先需要破碎细胞取首先需要破碎细胞培养基培养基一、无机盐一、无机盐二、碳源二、碳源三、植物生长激素三、植物生长激素四、有机氮源四、有机氮源五、有机酸五、有机酸六、复合物质六、复合物质培养基培养基MediumMurashige-Skoog(1962)White(1963)Heller(1953)Schenk Hildebrandt(1972)MgSO4 7H2O370720250400Na2SO4-200-KC1-65750-CaC12 2H2O440-75200NaNO3-600-KNO31,90080-2,500Ca(NO3)2 4H2O-300-NH4NO31,650-NaH
5、2PO4 H2O-16.5125-NH4H2PO4-300KH2PO4170-_-Sucrose(g)30202030大量元素大量元素主碳源主碳源Myo-Inositol100-1,000Nicotinic Acid0.50.5-0.5Pyridoxine HC10.50.1-0.5Thiamine HC10.1-10.115Ca-Pantothenate-1-Glycine23-微量有机物或氨基酸微量有机物或氨基酸组分组分Murashige-Skoog(1962)White(1963)Heller(1953)Schenk Hildebrandt(1972)FeSO4 7H2)27.8-15N
6、a2EDTA37.3-20MnSO4 4H2O22.370.110 ZnSO4 7H2O8.6310.1CuSO4 5H2O0.025-0.030.2Fe2(SO4)3-2.5-NiC12 6H2O-0.03-CoC12 6H2O0.025-0.1A1C13-0.03-FeC13 6H2O-1-K10.830.750.011.0H3BO36.21.515Na2M0O4 2H2O0.25-0.1微量无机盐微量无机盐组分组分Murashige-Skoog(1962)White(1963)Heller(1953)Schenk Hildebrandt(1972)植物生长激素2,4-D：10to50MN
7、AA：1to50MKinetin：0.1to10MIAA：0.1to10M植物细胞悬浮培养反应器植物细胞悬浮培养反应器反应器类型反应器类型 植物细胞体系植物细胞体系搅拌式反应器搅拌式反应器Catharanthus roseus（长长 春春 花花）；Daucus CarotaDigitalis lanta（毛地黄）；（毛地黄）；Dioscorea deltoideaMorinda citrifolia（海海 巴巴 戢戢）；Nicotiana tabacum（烟草）（烟草）鼓泡柱反应器鼓泡柱反应器Glycine max；Nicotiana tabacum气升式反应器气升式反应器Berberis w
8、ilsone；Catharanthus roseus；Tirptergium wildordii（雷公藤）（雷公藤）转鼓式反应器转鼓式反应器Lithospermum erythrorhizon（紫紫草草）；Vinca rosea传统反应器传统反应器转筒反应器转筒反应器适合于慢反应适合于慢反应ABC大规模植物细胞培养大规模植物细胞培养提高次生代谢物产量的策略提高次生代谢物产量的策略高产细胞系的建立和选择：克隆选择、抗性选择和诱导选择克隆选择、抗性选择和诱导选择组织化培养：根系培养根系培养固定化细胞技术：凝胶包埋法、吸附法凝胶包埋法、吸附法 产物促进释放技术：改变培养基组成、电刺激法、二甲基亚砜（
9、改变培养基组成、电刺激法、二甲基亚砜（DMSO）类物质的化学渗透法、由培养基与萃取剂组成的双液类物质的化学渗透法、由培养基与萃取剂组成的双液相培养相培养原生质体的制备原生质体的制备去除细胞壁的植物细胞去除细胞壁的植物细胞转基因构建转基因构建体细胞融合育种体细胞融合育种用途用途功能功能繁殖繁殖代谢代谢分化分化1960年英国年英国诺丁丁汉大学大学Cocking教授教授领导的小的小组率先利用率先利用真菌真菌纤维素素酶，成功地制，成功地制备出了大量具有高度活性可再生的出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根番茄幼根细胞原生胞原生质体体,开辟了原生开辟了原生质体融合研究的新体融合研究的新阶段。段。植物植物细
10、胞胞杂交的主要交的主要过程如下：程如下：1.原生原生质体的制体的制备2.原生原生质体的融合体的融合3.杂合体的合体的鉴别与与筛选原生质体的应用原生质体的应用植物植物细胞胞杂交交细胞育种细胞育种诱导突变，筛选新品系、新品种诱导突变，筛选新品系、新品种次生代谢产物生成次生代谢产物生成从培养的植物细胞中提取所需的代谢产物。从培养的植物细胞中提取所需的代谢产物。优点优点 比栽培原料作物更易控制最佳生产条件；比栽培原料作物更易控制最佳生产条件；培养物为无菌、无虫材料，能保证产品质量；培养物为无菌、无虫材料，能保证产品质量；工艺操作较为简单，可减少劳动费用，提高工艺操作较为简单，可减少劳动费用，提高生产率
11、。生产率。植物植物细胞胞培养培养的的应用用化合物化合物植物品系植物品系得率得率(%干重干重)培养类型培养类型细胞培养植物植物紫草宁紫草宁紫草紫草201.5s人参皂甙人参皂甙西洋参西洋参Panaxginseng274.5c蒽醌蒽醌Morindacitrifolia180.3sAjmalicine长长 春春 花花 Catharanthusroseus1.00.3sRosmarinicacidColeusblumeii153sUbiquinone-10Nicotianatabacum0.0360.003sDiosgeninDioscoreadeltoides22sBenzylisoquinoline
12、AlkaloidsCoptisjaponica115-10sBerberineThalictrumminor100.01sBerberineCoptisjaponica102-4sAnthraquinonesGaliumverum5.41.2sAnthraquinonesGaliumaparine3.80.2s尼古丁尼古丁烟草烟草Nicotianatabacum3.42.0cBisoclaurineStephaniacepharantha2.30.8sTripdiolideTripteryqiumwilfordii0.050.001s*s=suspension;c=callus植物细胞产生的次
13、生代谢物植物细胞产生的次生代谢物植物细胞培养产物植物细胞培养产物药品及生物活性物质药品及生物活性物质生物碱生物碱Alkaloids吗啡楠碱吗啡楠碱Morphinanalkaloids小檗碱小檗碱Berbeirine莨菪烷莨菪烷Tropanealkaloids强心苷强心苷Cardinolides*毛地黄毒苷是一种强心苷类。毛地黄细胞培养物能够进行植毛地黄毒苷是一种强心苷类。毛地黄细胞培养物能够进行植 株所不能够或能株所不能够或能 极微量进行的生物合成过程。极微量进行的生物合成过程。抗癌化合物抗癌化合物（Antitumorcompounds）喜树碱喜树碱CamptothecinHomoharrin
14、gtonine鬼臼毒鬼臼毒Podophyllotoxin紫杉醇（紫杉醇（Taxol）西洋参（西洋参（Ginseng）*迷迭香酸迷迭香酸Rosmarinicacid对苯二酚葡糖苷对苯二酚葡糖苷Arbutin植物细胞培养产物植物细胞培养产物食品添加剂食品添加剂Foodadditives色素色素Pigments紫草宁紫草宁shikonincompounds*花青素花青素Anthocyanins$1,250-2,000/kg红花黄色素，红花素红花黄色素，红花素carthamin是其主要成分是其主要成分 藏红花藏红花Saffron Saffron 茜草色素茜草色素Madder ColorantsMadd
15、er Colorants 其它其它 糖胶树胶糖胶树胶ChicleChicle （口香糖树胶）（口香糖树胶）香豆素香豆素紫草宁的生产（紫草宁的生产（1）8种衍生物的总称种衍生物的总称传统中药与天然色素传统中药与天然色素悬浮紫草细胞的制备悬浮紫草细胞的制备采用种子萌动法诱导紫草愈伤组织采用种子萌动法诱导紫草愈伤组织 紫草种子在紫草种子在2525 C C黑暗中萌动，然后转移于黑暗中萌动，然后转移于LSLS培养基进行培养基进行固体培养，激素水平为固体培养，激素水平为2,4-D102,4-D10-6-6mol/Lmol/L，KT 10KT 10-5-5mol/Lmol/L。一星期后在芽的下端产生了乳黄色
16、愈伤组织。一星期后在芽的下端产生了乳黄色愈伤组织。紫草宁分泌紫草宁分泌 愈伤组织若在固体愈伤组织若在固体LSLS培养基上进行继代培养，并将激素培养基上进行继代培养，并将激素改为添加改为添加IAAIAA，4 4周后可发现细胞变为深红色，此物质即紫周后可发现细胞变为深红色，此物质即紫草宁草宁悬浮细胞系建立悬浮细胞系建立 将愈伤组织继代培养在液体将愈伤组织继代培养在液体LSLS培养基中，经多次培养后培养基中，经多次培养后可得到悬浮的小颗粒细胞（几个到几十个细胞聚集团）可得到悬浮的小颗粒细胞（几个到几十个细胞聚集团）紫草宁的生产（紫草宁的生产（2）LS细细胞生长胞生长White紫草宁积累紫草宁积累两阶
17、段两阶段LS-White培养培养改进的优化两阶改进的优化两阶段培养基段培养基M5-M9发根系发根系培养培养高密度流高密度流加培养加培养紫草宁的生产（紫草宁的生产（2）发展与开发历史发展与开发历史日本三井石油公司日本三井石油公司：确定生长确定生长-生产两阶段培养生产两阶段培养流加高密度培养流加高密度培养育种，高产细胞株筛选育种，高产细胞株筛选1983年年750L气升式反应器气升式反应器1987年，年，1m3的转鼓式反应器的转鼓式反应器中国：中国：南京大学生物系南京大学生物系浙江大学材料与化工学院浙江大学材料与化工学院人参（人参（Panax ginseng）细胞）细胞有效成分有效成分皂甙（皂甙（s
18、aponins）和皂甙配基（）和皂甙配基（sapogenins）研究与开发历史研究与开发历史1日本日本MeijiSeikaKaisha1973年专利年专利大规模培养反应大规模培养反应器器后放弃后放弃2美国美国UniversityofMinnesota发现发现2,4-D和和kinetin对细对细胞生长与次生代谢有着不同的调节作用胞生长与次生代谢有着不同的调节作用3日本日本NittoDenkoCorporation80年代中期年代中期20立方米立方米罐罐细胞质产量达细胞质产量达700mg/L/dayIn1988,被被theMinistryofWelfareandHealthinJapan准许以食品
19、添加剂（酒、汤、饮料和草药提取液）准许以食品添加剂（酒、汤、饮料和草药提取液）生产西洋参细胞质生产西洋参细胞质现在正等待西洋参细胞质作为药的审批现在正等待西洋参细胞质作为药的审批红豆杉细胞培养红豆杉细胞培养有效成分有效成分：紫杉醇紫杉醇药效：药效：卵巢癌、乳腺癌、肺癌的高效、低毒、广谱卵巢癌、乳腺癌、肺癌的高效、低毒、广谱的抗癌药物的抗癌药物 需求：需求量极大但自然产量有限，最迫切需需求量极大但自然产量有限，最迫切需要通过细胞培养来提供要通过细胞培养来提供 研究开发：美国：美国：Catalytic Inc.Catalytic Inc.和和 ESCAgenetics ESCAgenetics 几
20、年前宣布建立几年前宣布建立taxoltaxol生产过程，但后来未生产过程，但后来未见进一步报道见进一步报道 （DT DT 十几天）十几天）我国：我国：短叶红豆杉短叶红豆杉(T.Brevifolia)(T.Brevifolia)和东北红和东北红豆杉（豆杉（T.CetenhumT.Cetenhum）中进行诱导愈伤组织、）中进行诱导愈伤组织、筛选得到的细胞在培养筛选得到的细胞在培养4 4周增殖了周增殖了5 5倍，紫杉倍，紫杉醇含量达到醇含量达到0.05%0.05%，比原来的红豆杉皮紫杉，比原来的红豆杉皮紫杉醇含量高出醇含量高出1010倍倍植物细胞培养的应用大规模组织培养大规模组织培养试管苗试管苗铁皮石斛铁皮石斛（铁皮枫斗晶）（铁皮枫斗晶）次生代谢物次生代谢物（中药有效成分如抗癌、消（中药有效成分如抗癌、消炎等炎等食品添加剂食品添加剂化妆品）化妆品）重组植物细胞生产医用蛋白质重组植物细胞生产医用蛋白质（疫苗（疫苗抗抗体等）体等）