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1、关于血清球蛋白的分离纯化与鉴定(2)现在学习的是第1页，共30页层析技术实验原理实验思路实验流程及操作注意事项现在学习的是第2页，共30页1 1层析法：层析法：层析法也称色谱法，层析法也称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术技术,是是19031903年俄国植物学家年俄国植物学家Michael TswettMichael Tswett发现并命名的。将发现并命名的。将植物色素溶液通过装有植物色素溶液通过装有CaCOCaCO3 3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。洗，各种
2、色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。用色彩（用色彩（chromachroma）和）和 图谱（图谱（graphsgraphs）组成）组成 色谱一词色谱一词 （Chromatography)Chromatography)层层 析析 技技 术术现在学习的是第3页，共30页2.2.依据依据：利用混合物中各组分的理化性质：利用混合物中各组分的理化性质差异（吸附力、分子形状、大小、酸碱性差异（吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分配系数等）或分子极性、分子亲和力以及分配系数等），而最终达到对物质进行分离纯化和分析，而最终达到对物质进行分离纯化和分析鉴定的目的。鉴定的目的。现在
3、学习的是第4页，共30页固定相固定相固定不动固定不动流动相流动相对固定相作单向相对运动，推动样品中对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。各组分理化性质不各组分通过固定相向前移动。各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。3 3基本原理基本原理：固定相和流动相：固定
4、相和流动相现在学习的是第5页，共30页4 4分类分类：流动相的物理状态：气相和液相流动相的物理状态：气相和液相 气液气液/固，固，液固液固/液液方式：纸、薄层、方式：纸、薄层、柱柱原理：吸附、分配、原理：吸附、分配、凝胶凝胶、离子交换、亲、离子交换、亲和、金属螯合、疏水、反相和、金属螯合、疏水、反相现在学习的是第6页，共30页5 5凝胶层析凝胶层析(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析分子排阻层析)定义定义：指混合物随流动相流经固定相：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。大
5、小不同而被分离的技术。现在学习的是第7页，共30页基本原理：基本原理：固定相固定相：凝胶，惰性三维空间多孔网：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、交交联葡聚糖联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡葡聚糖复合凝胶。聚糖复合凝胶。流动相流动相：洗脱液：洗脱液现在学习的是第8页，共30页交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构球多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构球状颗粒，商品名为状颗粒，商品名为Sephadex GSephadex G系列系列GG交联度：交联度：G G后面的阿拉伯数字表示不同的规后面的阿拉
6、伯数字表示不同的规格型号，有格型号，有G-10G-10，G-15G-15，G-25G-25，G-50G-50，G-75G-75，G-G-100100，G-150G-150，和，和G-200G-200八种，具体含义为吸水量八种，具体含义为吸水量（g g）/10g/10g干胶干胶交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔径交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔径越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸水越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸水性大。因此，性大。因此，“G”G”反映凝胶的交联程度，膨胀反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。程度及分离范围。现在学习的是第9页，共30页凝胶层析的基本原理
7、凝胶层析的基本原理 样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，同时作垂直向下样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，同时作垂直向下运动和不定向扩散运动运动和不定向扩散运动小分子可进入凝胶空内部，流程长，速度慢，小分子可进入凝胶空内部，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶空内部，颗粒间移动，流程短，先流出后流出；大分子不能进入凝胶空内部，颗粒间移动，流程短，先流出大小分子彼此分开大小分子彼此分开 现在学习的是第10页，共30页现在学习的是第11页，共30页影响因素影响因素层析柱的选择及装填：层析柱的选择及装填：柱大小柱大小分离样品量分离样品量 凝胶型号凝胶型号分辨率：各种分子筛的孔隙
8、大小分布有一分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之外定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子。完全渗透分子。洗脱液：溶解待分离物质，不变性洗脱液：溶解待分离物质，不变性加样量：加样量：1%1%5%5%凝胶的再生凝胶的再生现在学习的是第12页，共30页凝胶型号凝胶型号颗粒大小（颗粒大小（m)m)溶胀体积溶胀体积(ml/g)(ml/g)分离范围（分离范围（MrMr）G-10G-1040401201202 23 37 710102 2G-15G-155
9、0501501502.52.53.5 3.5 1.51.510103 3G-25G-2550501501504 46 61 110103 3 5 510103 3G-50G-5040401201209 911111.51.510103 3 3 310104 4G-75G-754040120120121215153 310103 3 8 810104 4G-100G-1004040120120151520204 410103 3 1 110105 5交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数现在学习的是第13页，共30页实验原理实验原理透析及超滤法盐析、有机溶剂/免
10、疫沉淀电泳凝胶层析离子交换层析超离心现在学习的是第14页，共30页共性共性：*生命高分子：透析、超滤、超离心、生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析凝胶层析 *蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化膜和电荷蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化膜和电荷盐析盐析/有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀*两性电解质和等电点：两性电解质和等电点：pH pI，蛋白质带负电；反蛋白质带负电；反之带正电之带正电电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析*有一定的功能：抗原性有一定的功能：抗原性 免疫沉淀免疫沉淀 个性个性：蛋白质的分子量、等电点、亲水程度、形状不蛋白质的分子量、等电点、亲水程度、形状不同同分离依据：蛋白质理化性
11、质的共性和个性分离依据：蛋白质理化性质的共性和个性现在学习的是第15页，共30页实验思路实验思路盐析去除杂蛋白盐析去除杂蛋白凝胶层析脱盐凝胶层析脱盐交联葡聚糖吸水浓缩交联葡聚糖吸水浓缩醋酸纤维素薄膜电泳鉴定醋酸纤维素薄膜电泳鉴定上午完成下午完成先先粗粗后后细细现在学习的是第16页，共30页l 取血清1.0ml于小试管中，加入洗脱液 1.0mL摇匀，再逐滴加入1.0mL pH7.2饱和(NH4)2SO4溶液边加边摇。静置5min后，3000rpm/min 离心10min。倾去上清液。l 将沉淀用1.0mL 洗脱液搅拌溶解，再逐滴加入0.5mL饱和(NH4)2SO4溶液，混匀，于室温放置5min。
12、3000rpm/min 离心10min。倾去上清液。沉淀用0.3mL洗脱液溶解，即为初步纯化的-球蛋白溶液。饱和饱和(NH4)(NH4)2 2SO4SO4溶液边加边摇溶液边加边摇(逐滴加入！逐滴加入！),),使用小试管。使用小试管。实验流程及操作注意事项实验流程及操作注意事项1.初步纯化：盐析现在学习的是第17页，共30页盐析的原理：蛋白质溶液中，加入高浓度中性盐，破坏蛋白质溶解的2大因素（电荷，水化膜），使其沉淀析出。中性盐：硫酸铵，硫酸钠等蛋白质复溶：加入低盐浓度缓冲液控制盐溶液的浓度可以沉淀出不同的蛋白现在学习的是第18页，共30页影响因素：影响因素：温度温度：温度与溶解度成正比。一般室
13、温即可：温度与溶解度成正比。一般室温即可,少少数温度敏感型蛋白质需数温度敏感型蛋白质需44操作，而血红蛋白、操作，而血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在肌红蛋白、清蛋白在2525比比00时溶解度低，时溶解度低，更易盐析。更易盐析。pHpH值值：大多数蛋白质在：大多数蛋白质在pIpI时溶解度最低。时溶解度最低。pH=pIpH=pI效果更好。效果更好。蛋白质浓度蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐析前血清加：浓度高时产生共沉。盐析前血清加等量等量生理盐水稀释生理盐水稀释，控制蛋白质含量在，控制蛋白质含量在2.5-3.0%2.5-3.0%。现在学习的是第19页，共30页2.2.凝胶层析脱盐：凝胶层析脱盐：常用透
14、析，需时较长，最好低常用透析，需时较长，最好低温。也可用葡萄糖凝胶温。也可用葡萄糖凝胶G-25/50G-25/50过柱，用时较短。过柱，用时较短。固定相：固定相：sephadex G-25sephadex G-25流动相：流动相：pH7.4pH7.4的的0.01M0.01M磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液原理同前，蛋白质大分子，硫酸铵小分子。原理同前，蛋白质大分子，硫酸铵小分子。现在学习的是第20页，共30页3.3.浓缩：浓缩：sephadex G-25sephadex G-25吸水，利用吸水，利用高分子性质。高分子性质。现在学习的是第21页，共30页4.4.鉴定：鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄
15、膜电泳 电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。相反的电极移动的现象。电泳技术：利用电泳现象对混合物进行分离分析电泳技术：利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。的技术。电泳系统：电泳支持介质、电泳缓冲液、电场电泳系统：电泳支持介质、电泳缓冲液、电场现在学习的是第22页，共30页 COO-COO-COOH +H+H+Pr Pr Pr +OH-+OH-NH2 NH3+NH3+PHPI PH=PI PHPI电泳用于分离物质的原理：电泳用于分离物质的原理：现在学习的是第23页，共30页蛋白质为两性电解质，有一定的等电点，在大于其等蛋白
16、质为两性电解质，有一定的等电点，在大于其等电点的溶液中带负电，在电场中向正极移动，由于各电点的溶液中带负电，在电场中向正极移动，由于各种蛋白质的分子大小与结构不同，所带表面电荷的多种蛋白质的分子大小与结构不同，所带表面电荷的多少不同，因而在电场中向正极移动的速度不同。经过少不同，因而在电场中向正极移动的速度不同。经过一定的电泳时间后可形成许多蛋白质区带，每一个区一定的电泳时间后可形成许多蛋白质区带，每一个区带代表一组迁移率相近似的蛋白质。带代表一组迁移率相近似的蛋白质。现在学习的是第24页，共30页醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳介质：醋酸纤维素薄膜，纤维素的羟基经介质：醋酸纤维素薄膜，纤
17、维素的羟基经乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。溶于有机乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。溶于有机溶剂后涂成薄膜，具均一的泡沫状结构，溶剂后涂成薄膜，具均一的泡沫状结构，有强渗透性。有强渗透性。电泳缓冲液：电泳缓冲液：pH8.6pH8.6的巴比妥缓冲液的巴比妥缓冲液现在学习的是第25页，共30页血清蛋白质参考值等电点分子量占总蛋白的百分数(%)清蛋白1球蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白4.645.065.065.126.857.369 000200 000300 00090 000150 000156 000950 000577225496.5121220清蛋白清蛋白 1 1 2 2 现在学习的是第26页，共30页
18、 清蛋白清蛋白 1 2 加样线加样线加样线加样线纯化蛋白纯化蛋白对照对照样品样品现在学习的是第27页，共30页【操作步骤操作步骤】1 1点样点样：取经巴比妥缓冲液浸透的：取经巴比妥缓冲液浸透的28cm28cm薄膜，滤纸吸薄膜，滤纸吸去表面多余水分，在去表面多余水分，在无光泽面无光泽面距一端距一端2cm2cm处用铅笔划一加样线，处用铅笔划一加样线，写上编号。小滤纸片蘸取血清写上编号。小滤纸片蘸取血清/样品，垂直压在加样线上，待样品，垂直压在加样线上，待样品渗入薄膜，样品渗入薄膜，无光泽面向下无光泽面向下平贴在电泳槽支架的盐桥上，平贴在电泳槽支架的盐桥上，静置静置5 51010分钟平衡。分钟平衡。
19、点样端置阴极点样端置阴极，盖上盖子。，盖上盖子。2 2通电通电：接通电源，调节电压为：接通电源，调节电压为8 815V/cm15V/cm，通电约，通电约1h1h，关，关闭电源，停止电泳。闭电源，停止电泳。3 3染色染色：薄膜浸入氨基黑：薄膜浸入氨基黑B B染色液染色液2 25 5分钟。分钟。4 4漂洗漂洗：取出薄膜在漂洗液中漂洗：取出薄膜在漂洗液中漂洗4 45 5次，至无蛋白区完次，至无蛋白区完全脱色为止。取出，用滤纸吸干液体。观察。全脱色为止。取出，用滤纸吸干液体。观察。现在学习的是第28页，共30页预试结果现在学习的是第29页，共30页2022/10/1感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第30页，共30页