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1、基因工程的基本操作程序(精华)基因工程基本操作的四个步骤：基因工程基本操作的四个步骤：第一步：第一步：目的基因的获取目的基因的获取第二步：第二步：基因表达载体的构建基因表达载体的构建第三步：第三步：将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞第四步：第四步：目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取一、目的基因的获取1.1.什么是目的基因什么是目的基因？主要是指主要是指编码蛋白质编码蛋白质的结构基因。的结构基因。2.2.获取方法：获取方法：(1)(1)从基因文库中获取：从基因文库中获取：获取目的基因的根据：获取目的基因的根据：根据目的基因的有关信息根据目的基因的有关信息，例如，
2、根据，例如，根据基基因的核苷酸序列因的核苷酸序列、基因的功能基因的功能、基因在染色体基因在染色体上的位置上的位置、基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA，以及，以及基因基因的表达产物蛋白质的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。等特性来获取目的基因。建立基因文库的目的：建立基因文库的目的：为了在为了在不知目的基因序列的情况下不知目的基因序列的情况下，便于，便于获得所需的目的基因。获得所需的目的基因。(1)(1)从基因文库中获取：从基因文库中获取：基因文库的构建：基因文库的构建：基因组文库的构建：基因组文库的构建：直接分离法直接分离法(鸟枪法鸟枪法)提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNA
3、DNA用适当的限制酶切用适当的限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库注意：注意：基因文库的组建过程基因文库的组建过程就包含了基因工程的步骤。就包含了基因工程的步骤。目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞(1)(1)从基因文库中获取：从基因文库中获取：基因文库的构建：基因文库的构建：cDNAcDNA文库的构建：文库的构建：反转录法反转录法某种生物的单链某种生物的单链mRNAmRNA单链互补单链互补DNADNA双链双链cDNAcDNA
4、片段片段导入受体菌中储存导入受体菌中储存与载体连接与载体连接cDNA文库反反(逆逆)转录酶转录酶DNADNA聚合酶聚合酶(1)(1)从基因文库中获取：从基因文库中获取：基因文库的构建：基因文库的构建：基因组文库和基因组文库和cDNAcDNA文库的区别：文库的区别：文库类型文库类型cDNA文库文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小小小大大基因中启动子基因中启动子无无有有基因中内含子基因中内含子无无有有基因多少基因多少某种生物的某种生物的部部分基因分基因某种生物的某种生物的全部基因全部基因物种间的基因交流物种间的基因交流可以可以部分基因可部分基因可以以一、目的基因的获取一、目的基因的获取1.1.
5、什么是目的基因什么是目的基因？主要是指主要是指编码蛋白质编码蛋白质的结构基因。的结构基因。2.2.获取方法：获取方法：(1)(1)从基因文库中获取：从基因文库中获取：从基因文库中获取目的基因的优点：从基因文库中获取目的基因的优点：操作简便操作简便。从基因文库中获取目的基因的缺点：从基因文库中获取目的基因的缺点：工作量大，具有一定的盲目性工作量大，具有一定的盲目性。一、目的基因的获取一、目的基因的获取2.2.获取方法：获取方法：(2)(2)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因：技术扩增目的基因：什么是什么是PCRPCR？PCRPCR全称为全称为聚合酶链式反应聚合酶链式反应，是一项在生物，是一项在
6、生物体外复制体外复制特定特定DNADNA片段片段的核酸合成技术。的核酸合成技术。PCRPCR的原理：的原理：利用利用DNADNA双链复制双链复制的原理。的原理。条件：条件：要有一段要有一段已知目的基因的核苷酸序列已知目的基因的核苷酸序列【前提条件】、四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸、引物引物、热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶(TaqTaq酶酶)等。等。(2)(2)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因：技术扩增目的基因：过程：过程：脱氧脱氧胞苷胞苷三磷酸三磷酸 脱氧脱氧腺苷腺苷三磷酸三磷酸 脱氧脱氧鸟苷鸟苷三磷酸三磷酸 脱氧脱氧胸苷胸苷三磷酸三磷酸 (2)(2)利用利用PCRPCR技术扩增目的基
7、因：技术扩增目的基因：过程：过程：A.A.变性变性(90-95)(90-95)：双链双链DNADNA模板在模板在热作用热作用下，下，氢键断裂氢键断裂，形成，形成单链单链DNADNA。B.B.退火退火(55-65)(55-65)：系统温度降低，引物与系统温度降低，引物与DNADNA模板结合，形成模板结合，形成局部双链局部双链。C.C.延伸延伸(70-75)(70-75)：在在TaqTaq酶的作用下，从引物的酶的作用下，从引物的55端端33端延伸，端延伸，合成与模板互补的合成与模板互补的DNADNA链。链。D.D.多次重复：多次重复：一、目的基因的获取一、目的基因的获取2.2.获取方法：获取方法：
8、(2)(2)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因：技术扩增目的基因：方式：方式：以以指数方式扩增指数方式扩增，即，即2 2n n(n(n为扩增循环的次数为扩增循环的次数)。PCRPCR技术扩增与技术扩增与DNADNA复制的比较：复制的比较：PCRPCR技术技术技术技术DNADNA复制复制复制复制相相相相同同同同点点点点原理原理原理原理原料原料原料原料条件条件条件条件不不不不同同同同点点点点解旋解旋解旋解旋方式方式方式方式场所场所场所场所酶酶酶酶结果结果结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNADNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解
9、旋酶催化体外复制体外复制细胞核内细胞核内热稳定的热稳定的DNADNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNADNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNADNA片段片段形成整个形成整个DNADNA分子分子2.2.获取方法：获取方法：(2)(2)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因：技术扩增目的基因：一、目的基因的获取一、目的基因的获取2.2.获取方法：获取方法：(3)(3)化学方法人工合成：化学方法人工合成：如果如果基因比较小基因比较小，核苷酸序列又已知核苷酸序列又已知，也可以通过也可以通过DNADNA合成仪合成仪用用化学方法直接人化学方法直接人工合成工合成。一、目的基因的获取一、目的基因的获取练一练：练一练
10、：1.多聚酶链式反应多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增DNA片段片段的技术。的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：过程一般经历下述三十多次循环：95下下使模板使模板DNA变性、解链变性、解链55下复性下复性(引物与引物与DNA模板模板链结合链结合)72下引物链延伸下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关下列有关PCR过程的叙述中不正确的是过程的叙述中不正确的是()A变性过程中破坏的是变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现氢键，也可利用解旋酶实现B复性过程中引物与复性过程中引物与DNA模板链的
11、结合是依靠碱模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成基互补配对原则完成C延伸过程中需要延伸过程中需要DNA聚合酶、聚合酶、ATP、四种核糖、四种核糖核苷酸核苷酸DPCR与细胞内与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温复制相比所需要酶的最适温度较高度较高C一、目的基因的获取一、目的基因的获取练一练：练一练：2.获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是基因获取方法的是()A从基因组文库中获取从基因组文库中获取B从从cDNA文库中获取文库中获取 C从含目的基因生物细胞中获取从含目的基因生物细胞中获取D利用利用PCR技术获取技术获取C3.PCR技术扩
12、增技术扩增DNA，需要的条件是，需要的条件是()目的基因目的基因 引物引物 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸DNA聚合酶等聚合酶等 mRNA 核糖体核糖体A BC DA一、目的基因的获取一、目的基因的获取练一练：练一练：4.有关基因工程的叙述正确的是有关基因工程的叙述正确的是()A限制酶只在获取目的基因时才用限制酶只在获取目的基因时才用B重组质粒的形成是在细胞内完成的重组质粒的形成是在细胞内完成的C质粒都可以作为运载体质粒都可以作为运载体D蛋白质的氨基酸排列顺序可以为合成目的基蛋白质的氨基酸排列顺序可以为合成目的基因提供线索因提供线索D5.在基因工程技术中，下列方法与目的基因获得在基因工程技术中，
13、下列方法与目的基因获得无关的是无关的是()A辐射诱变法辐射诱变法 B从基因文库中获取从基因文库中获取 C反转录法反转录法 D人工合成法人工合成法A一、目的基因的获取一、目的基因的获取练一练：练一练：6.下列关于基因工程的说法中，正确的是下列关于基因工程的说法中，正确的是()A基因工程的设计和施工都是在细胞水平上进基因工程的设计和施工都是在细胞水平上进行的行的B目前基因工程所有的目的基因都是从供体细目前基因工程所有的目的基因都是从供体细胞中直接分离得到的胞中直接分离得到的C只要检测出受体细胞中含有目的基因，那么只要检测出受体细胞中含有目的基因，那么目的基因一定能成功进行表达目的基因一定能成功进行
14、表达D基因工程能使科学家打破物种界限，定向改基因工程能使科学家打破物种界限，定向改造生物性状造生物性状D一、目的基因的获取一、目的基因的获取练一练：练一练：7.下列获取目的基因的方法中需要模板链的是下列获取目的基因的方法中需要模板链的是()从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因 利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因反转录法反转录法通过通过DNA合成仪利用化学方法人工合成合成仪利用化学方法人工合成A B C DD二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建1.1.构建目的：构建目的：使使目的基因在受体细胞中稳定存在目的基因在受体细胞中稳定存在，并且并且可以遗传给下一代可以遗传
15、给下一代，同时，使，同时，使目的基目的基因能够表达和发挥作用因能够表达和发挥作用。2.2.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：目的基因目的基因启动子启动子终止子终止子标记基因标记基因二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建1.1.构建目的：构建目的：使使目的基因在受体细胞中稳定存在目的基因在受体细胞中稳定存在，并且并且可以遗传给下一代可以遗传给下一代，同时，使，同时，使目的基目的基因能够表达和发挥作用因能够表达和发挥作用。2.2.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：想一想：想一想：启动子、终止子和标记基因分别有什么作用？启动子、终止子和标记基因分别有什么作用？启动子：启动子：位于位
16、于基因的首端基因的首端的一段特殊的的一段特殊的DNA片断，是片断，是RNARNA聚合酶识别和结合的部位聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转，有了它才能驱动基因转录出录出mRNA，最终获得蛋白质，但启动子本身不被转录。，最终获得蛋白质，但启动子本身不被转录。终止子：终止子：位于位于基因的尾端基因的尾端的一段特殊的的一段特殊的DNA片断，能片断，能终终止止mRNAmRNA的转录的转录。标记基因：标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将，从而将有目的基因的细胞筛选出来。有目的基因的细胞筛选出来。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建3.3.构建表达
17、载体：构建表达载体：同一种同一种 限制酶限制酶载体载体(如质粒如质粒)DNADNA分子分子(含目的基因含目的基因)一个一个切口切口两个两个黏性末端黏性末端两个两个切口切口(两个黏性两个黏性末端末端)的目的基因的目的基因基因表达载体基因表达载体(如重组质粒如重组质粒)DNA DNA 连接酶连接酶二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建3.3.构建表达载体：构建表达载体：(1)(1)用一定的用一定的_切割质粒，使其出现一个切切割质粒，使其出现一个切口，露出口，露出_。(2)(2)用用_切断目的基因，使其产生切断目的基因，使其产生_。(3)(3)将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段
18、插入质粒的_处，处，黏性末端因黏性末端因_而相连，再加入而相连，再加入适量适量_，形成了一个重组，形成了一个重组DNADNA分子分子(重重组质粒组质粒)。限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶切口切口碱基互补配对原则碱基互补配对原则相同的黏性末端相同的黏性末端DNADNA连接酶连接酶二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建3.3.构建表达载体：构建表达载体：特别提醒：特别提醒：(1)(1)用限制酶切割载体和含目的基因的用限制酶切割载体和含目的基因的DNADNA分子分子时，时，可以使用不同的限制性核酸内切酶可以使用不同的限制性核酸内切酶,但是但是必须切出必须切出相同黏性末端相同
19、黏性末端。(2)(2)不同基因可以拼接的原因：不同基因可以拼接的原因：不同生物的基不同生物的基因具有相同的结构和化学组成因具有相同的结构和化学组成，都是双螺旋结，都是双螺旋结构，都由四种脱氧核糖核苷酸组成，都遵循相构，都由四种脱氧核糖核苷酸组成，都遵循相同的碱基互补配对原则：同的碱基互补配对原则：ATAT，GCGC。(3)(3)目的基因与载体的结合过程，实际上是目的基因与载体的结合过程，实际上是不不同来源的基因重组的过程同来源的基因重组的过程。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建练一练：练一练：1.如如图图为为基基因因表表达达载载体体的的模模式式图图，下下列列有有关关基基因因工工程程中
20、中载载体的体的说说法法错误错误的是的是()A基基因因工工程程的的核核心心步步骤骤是是基因表达基因表达载载体构建体构建B任任何何基基因因表表达达载载体体的的构构建都是一建都是一样样的，没有差的，没有差别别C图图中中启启动动子子位位于于基基因因的的首首端端，是是RNA聚聚合合酶酶识识别别和和结结合的部位合的部位D抗抗生生素素抗抗性性基基因因的的作作用用是是作作为为标标记记基基因因，用用于于鉴鉴别别受受体体细细胞胞中中是是否否导导入入了了目目的的基因基因B二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建练一练：练一练：2.2.下下列列操操作作中中不不属属于于基基因因表表达达载载体体构构建建过过程程的的是
21、是()()A.A.用一定的限制用一定的限制酶酶切割切割质质粒露出黏性末端粒露出黏性末端B.B.用同一种限制用同一种限制酶酶切割目的基因露出黏性末端切割目的基因露出黏性末端C.C.将切下的目的基因片段插入将切下的目的基因片段插入质质粒切口粒切口处处D.D.将重将重组组DNADNA导导入受体入受体细细胞中胞中D D3.3.下列哪下列哪项项不是基因表达不是基因表达载载体的体的组组成部分成部分()()A.A.启启动动子子 B.B.终终止子止子C.C.标记标记基因基因 D.D.复制原点复制原点D D二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建练一练：练一练：4.4.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是下
22、列关于基因表达载体的叙述不正确的是()()A A启动子是与启动子是与RNARNA聚合酶识别和结合的部位，是聚合酶识别和结合的部位，是起始密码起始密码B B启动子和终止子都是特殊结构的启动子和终止子都是特殊结构的DNADNA短片段，短片段，对对mRNAmRNA的转录起调控作用的转录起调控作用C C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选基因从而便于筛选D D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别不同而有所差别A三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1.1.什么是转化？什么是转化？
23、目的基因进入受体细胞目的基因进入受体细胞内，并且内，并且在在 受体细胞内维持稳定和表达受体细胞内维持稳定和表达的过程。的过程。2.2.常用的受体细胞：常用的受体细胞：大肠杆菌大肠杆菌、枯草杆菌、枯草杆菌、农杆菌农杆菌、酵母酵母菌菌和和动植物细胞动植物细胞等。等。3.3.将目的基因导入受体细胞的原理：将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞4.4.将目的基因导入植物细胞：将目的基因导入植物细胞：适用范围：适用范围：(1)(1)农杆菌转化法：农杆菌转化法：双子叶植物双子叶植物和和裸子植物裸子植物。小
24、知识：小知识：植物的分类植物的分类依据是否依据是否形成种子形成种子种子种子植物植物裸子植物：裸子植物：松、杉、柏、银杏松、杉、柏、银杏被子植物被子植物双子叶植物：双子叶植物：花生、大豆花生、大豆单子叶植物：单子叶植物：水稻、玉米水稻、玉米孢子孢子植物植物藻类植物：藻类植物：衣藻、水绵、海带衣藻、水绵、海带苔藓植物：苔藓植物：葫芦藓、地钱葫芦藓、地钱蕨类植物：蕨类植物：肾厥、满江红肾厥、满江红三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞4.4.将目的基因导入植物细胞：将目的基因导入植物细胞：农杆菌特点：农杆菌特点：(1)(1)农杆菌转化法：农杆菌转化法：在自然条件下在自然条件下感染双子叶
25、植物和裸子感染双子叶植物和裸子植物植物，而对大多数单子叶植物没有感染能，而对大多数单子叶植物没有感染能力。当植物力。当植物受到损伤时受到损伤时，伤口处的细胞会伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞这些细胞，这时农杆菌的，这时农杆菌的TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体色体DNADNA上。上。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞4.4.将目的基因导入植物细胞：将目的基因导入植物细胞：转化过程：转化过程：(1)(1)农杆菌转化法：农杆菌转化法：
26、三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞4.4.将目的基因导入植物细胞：将目的基因导入植物细胞：(2)(2)基因枪法：基因枪法：适用范围：适用范围：适用于适用于单子单子叶植物叶植物，但，但成本成本较高较高。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞4.4.将目的基因导入植物细胞：将目的基因导入植物细胞：(3)(3)花粉管通道法：花粉管通道法：适用范围：适用范围：适用于适用于被子植物被子植物，且十分简便经济。，且十分简便经济。胚珠胚珠花药花药花丝花丝柱头柱头花柱花柱子房壁子房壁子房子房雄雄蕊蕊雌雌蕊蕊三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞5.5.将目的基因导入
27、动物细胞：将目的基因导入动物细胞：(1)(1)导入方法：导入方法：显微注射法显微注射法。(2)(2)过程：过程：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯从雌性动物内从雌性动物内取出卵取出卵(卵在体内或体外受精卵在体内或体外受精)并进行并进行显微注射显微注射 含目的基因的受精卵含目的基因的受精卵胚胎早期培养胚胎早期培养至囊至囊胚期再胚期再移植移植到雌性动物到雌性动物输卵管或子宫输卵管或子宫，使其，使其发育发育成具有成具有新性状的动物新性状的动物。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞6.6.将目的基因导入微生物：将目的基因导入微生物：(1)(1)原核生物特点：原核生物特点：繁殖快繁
28、殖快、单细胞单细胞、遗传物质少遗传物质少。(2)(2)方法：方法：用用CaCa2+2+处理细胞处理细胞感受态细胞表达感受态细胞表达载体与感受态细胞混合载体与感受态细胞混合感受态细胞吸感受态细胞吸收收DNADNA分子分子。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞知识拓展：知识拓展：(1)不不同同生生物物的的受受体体细细胞胞不不同同：植植物物一一般般为为体体细细胞胞(也也可可以以受受精精卵卵)，动动物物一一般般为为受受精精卵卵，微生物一般为大肠杆菌微生物一般为大肠杆菌。(2)上上图图中中发发生生与与发发生生相相比比，会会使使目目的的基基因因的的遗遗传传特特性性得得以以稳稳定定维维持持和
29、和表表达达，原原因因是是在在进进行行细细胞胞分分裂裂时时，细细胞胞核核上上的的DNA经经复复制制后后平平均均分分配配到到两两个个子子细细胞胞中中，保保证证了了亲亲子子代代遗遗传传性性状状的的稳稳定定性性，而而细细胞胞分分裂裂时时，细细胞胞质质是是不不均均分分的的，子子细细胞不一定含有目的基因胞不一定含有目的基因。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞练一练：练一练：1.1.基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，主要原因是物作为受体细胞，主要原因是()()A A结构简单，操作方便结构简单，操作方便B B繁殖速度快繁殖速度快C
30、 C遗传物质含量少、简单遗传物质含量少、简单D D性状稳定性状稳定,变异少变异少B2.2.在培育下列作物的转基因品种时，适合用农杆在培育下列作物的转基因品种时，适合用农杆菌转化法导入目的基因的是菌转化法导入目的基因的是()()A A小麦小麦 B B玉米玉米 C C大豆大豆 D D水稻水稻C三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞练一练：练一练：3.3.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是的基因的做法正确的是()()将毒素蛋白注射到棉受精卵中将毒素蛋白注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，注射
31、到棉受精卵中序列，注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，与质粒重组，导人细序列，与质粒重组，导人细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，与细菌质粒重组，注序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵射到棉的子房并进入受精卵A.B.C.D.A.B.C.D.C三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞练一练：练一练：4.4.回答有关基因工程的问题：回答有关基因工程的问题：(1)(1)构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割构建基因工程表达载体时，用不同类型
32、的限制酶切割DNADNA后，可能产生黏性末端，也可能产生后，可能产生黏性末端，也可能产生_末端。若要在限制末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生二者产生_(_(相同、不同相同、不同)黏性末端的限制酶。黏性末端的限制酶。(2)(2)利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是_。在表达载体转。在表达载体转化大肠杆菌时，常用化大肠杆菌时，常用_处理大肠杆菌，以利于表达载处理大
33、肠杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNAmRNA，可用标记，可用标记的胰岛素基因片段作探针与的胰岛素基因片段作探针与mRNAmRNA杂交，该杂交技术称为杂交，该杂交技术称为_。为了检测胰岛素基因转录的。为了检测胰岛素基因转录的mRNAmRNA是是否翻译成否翻译成_，常用，常用_杂交技术。杂交技术。平平相同相同RNA聚合聚合酶酶识别识别和和结结合的位点，有了它才能合的位点，有了它才能驱动驱动基因基因转转录录出出mRNA，最，最终获终获得所需要的蛋白得所需要的蛋白质质人胰人胰岛岛素素Ca2DNA分子分子杂杂交技交技术术抗原抗原抗体抗体
34、三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞练一练：练一练：4.4.回答有关基因工程的问题：回答有关基因工程的问题：(3)(3)如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌先要将目的基因插入农杆菌TiTi质粒的质粒的_中，然后用中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过该农杆菌感染植物细胞，通过DNADNA重组将目的基因插入植物重组将目的基因插入植物细胞的细胞的_上。上。TDNA染色体的染色体的DNA四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1.1.分子水平的检测：分子水平的检测：(1)(1)导入检测：即检测导
35、入检测：即检测转基因生物的转基因生物的DNADNA上上是否插入了目的基因是否插入了目的基因。这是这是目的基因能够在受体细胞中稳定遗目的基因能够在受体细胞中稳定遗传的关键传的关键。方法：方法：DNADNA分子杂交技术分子杂交技术。过程：过程：将转基因生物的将转基因生物的DNADNA提取出来提取出来，在，在含有目含有目的基因的的基因的DNADNA片段片段上用上用放射性同位素等作标记放射性同位素等作标记，以此作为以此作为探针，使探针与基因组使探针与基因组DNADNA杂交杂交，如，如果果显示出杂交带显示出杂交带，就表明目的基因已插入染色，就表明目的基因已插入染色体体DNADNA中。中。过程：过程：放射
36、性同放射性同 位素标记位素标记目的基因的目的基因的DNADNA片段片段TACGGTCATGTCGCATGCTAGTACGGTCATGTCGCATGCTAGATGCCAGTACAGCGTACGATCATGCCAGTACAGCGTACGATCGTACAGCGTAGTACAGCGTA基因探针基因探针待测转基因生物待测转基因生物1 1染色体染色体DNADNA单链单链TACGGTCATGTCGCATGCTAGTACGGTCATGTCGCATGCTAG待测转基因生物待测转基因生物2 2染色体染色体DNADNA单链单链ATCCGGTGTAGGTCATGCTCGATCCGGTGTAGGTCATGCTCGGTA
37、CAGCGTAGTACAGCGTA基因探针基因探针GTACAGCGTAGTACAGCGTA基因探针基因探针显示出杂交带不能显示出杂交带四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1.1.分子水平的检测：分子水平的检测：(1)(1)导入检测：即检测导入检测：即检测转基因生物的转基因生物的DNADNA上上是否插入了目的基因是否插入了目的基因。方法：方法：DNADNA分子杂交技术分子杂交技术。过程：过程：检测受体细胞检测受体细胞是否具有标记基因所控制的是否具有标记基因所控制的性状性状，如果具有标记基因所控制的性状，就表，如果具有标记基因所控制的性状，就表明受体细胞中含有目的基因，从而可以明受体细
38、胞中含有目的基因，从而可以筛选筛选出出含有目的基因的受体细胞。含有目的基因的受体细胞。想一想：想一想：欲检测受体细胞中是否含有目的基因，欲检测受体细胞中是否含有目的基因，除了除了DNADNA分子杂交法外，可以如何检测？分子杂交法外，可以如何检测？四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1.1.分子水平的检测：分子水平的检测：(2)(2)转录检测：即检测转录检测：即检测目的基因是否转录出目的基因是否转录出了了mRNAmRNA。这是这是检测目的基因是否发挥功能作用的检测目的基因是否发挥功能作用的第一步第一步。方法：方法：(DNA-RNA)(DNA-RNA)分子杂交技术分子杂交技术。过程：过
39、程：从转基因生物中从转基因生物中提取出提取出mRNAmRNA，在，在含有目含有目的基因的的基因的DNADNA片段片段上用上用放射性同位素等作标记放射性同位素等作标记，以此作为以此作为探针，使探针与使探针与mRNAmRNA杂交杂交，如果，如果显显示出杂交带示出杂交带，就表明目的基因在转基因生物中，就表明目的基因在转基因生物中已经转录出了已经转录出了mRNAmRNA。过程：过程：放射性同放射性同 位素标记位素标记目的基因的目的基因的DNADNA片段片段TACGGTCATGTCGCATGCTAGTACGGTCATGTCGCATGCTAGATGCCAGTACAGCGTACGATCATGCCAGTACA
40、GCGTACGATCGTACAGCGTAGTACAGCGTA基因探针基因探针待测转基因生物待测转基因生物1 1中的中的mRNAmRNAUACGGUCAUGUCGCAUGCUAUACGGUCAUGUCGCAUGCUAGG待测转基因生物待测转基因生物2 2中的中的mRNAmRNAAUCCGGUGUAGGUCAUGCUAUCCGGUGUAGGUCAUGCUCGCGGTACAGCGTAGTACAGCGTA基因探针基因探针GTACAGCGTAGTACAGCGTA基因探针基因探针显示出杂交带不能显示出杂交带四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1.1.分子水平的检测：分子水平的检测：(3)(3)
41、翻译检测：即检测翻译检测：即检测目的基因是否翻译成目的基因是否翻译成相应的蛋白质相应的蛋白质。这是这是检测目的基因是否发挥功能作用的检测目的基因是否发挥功能作用的第二步第二步。方法：方法：抗原抗原抗体杂交技术抗体杂交技术。过程：过程：从转基因生物中从转基因生物中提取出蛋白质提取出蛋白质，用，用相应的相应的抗体进行抗原抗体进行抗原抗体杂交抗体杂交，如果，如果显示出杂交带显示出杂交带，就表明目的基因已形成蛋白质产品。就表明目的基因已形成蛋白质产品。过程：过程：目的基因目的基因动物动物(如小鼠如小鼠)体内体内抗体抗体转基因生物转基因生物中蛋白质中蛋白质抗原蛋白质蛋白质表达表达显示出杂交带目的基因已形
42、成蛋白质四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定2.2.个体生物学水平的鉴定：个体生物学水平的鉴定：(1)(1)实例实例1 1：一个抗虫或抗病的基因导入植物一个抗虫或抗病的基因导入植物细胞后，是否赋予了抗虫或抗病的特性，需细胞后，是否赋予了抗虫或抗病的特性，需要做要做抗虫或抗病的接种实验抗虫或抗病的接种实验，以确定是否具，以确定是否具有抗性以及抗性的程度。有抗性以及抗性的程度。(2)(2)实例实例2 2：有的基因工程产品需要与天然产有的基因工程产品需要与天然产品品进行功能活性比较进行功能活性比较，以确定转基因产品的，以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。功能活性是否与天然产品相
43、同。四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定练一练：练一练：1.19761.1976年年,美国的科学家首次将人的生长抑制素美国的科学家首次将人的生长抑制素释放因子的基因转移到大肠杆菌释放因子的基因转移到大肠杆菌,并获得了表达，并获得了表达，此文中的表达是指该基因在大肠杆菌此文中的表达是指该基因在大肠杆菌()()A.A.能进行能进行DNADNA复制复制B.B.能传递给细菌后代能传递给细菌后代C.C.能合成生长抑制素释放因子能合成生长抑制素释放因子D.D.能合成人的生长素能合成人的生长素C C四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定练一练：练一练：2 2利用外源基因在受体细胞中表达
44、，可生产人利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因完类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是成了在受体细胞中表达的是()A A棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因B B大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAmRNAC C山羊乳腺细胞中检测到人生长激素山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNADNA序列序列D D酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白D D五、课堂练习五、课堂练习1.1.基因工程是在基因工程是在DNADNA分子水平上进行设计施工的分
45、子水平上进行设计施工的,在基因操作的基本步骤中在基因操作的基本步骤中,不进行减基互补配对不进行减基互补配对的步骤是的步骤是 ()()A.A.人工合成目的基因人工合成目的基因B.B.目的基因与载体结合目的基因与载体结合C.C.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞D.D.目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达C C五、课堂练习五、课堂练习2.2.下列关于基因工程的叙述，错误的是下列关于基因工程的叙述，错误的是()A A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物生物B B限制性核酸内切酶和限制性核酸内切酶和DNADNA连接酶是两类常用连接酶是两类常用的
46、工具酶的工具酶C C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性原无生物活性D D载体上的抗性基因有利于筛选含重组载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNADNA的的细胞和促进目的基因的表达细胞和促进目的基因的表达D D五、课堂练习五、课堂练习3.为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。(1)获得耐盐基因后，构建重组获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的分子所用的
47、限制性内切酶作用于图中的限制性内切酶作用于图中的_处，处，DNA连接连接酶作用于酶作用于_处。处。(填填“a”或或“b”)a aa a五、课堂练习五、课堂练习3.为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。(2)将重组将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方分子导入水稻受体细胞的常用方法有法有_、基因枪法、花粉管通道法。、基因枪法、花粉管通道法。(3)由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要由导入目的基因的水稻
48、细胞培养成植株需要利用利用_技术，该技术的核心是技术，该技术的核心是_和和_。(4)为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的要用放射性同位素标记的_作探针进行作探针进行分子杂交检测，又要用分子杂交检测，又要用_方法方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。农杆菌转化法农杆菌转化法植物组织培养植物组织培养脱分化脱分化再分化再分化耐盐基因耐盐基因一定浓度盐水浇灌一定浓度盐水浇灌五、课堂练习五、课堂练习4.4.水稻种子中水稻种子中7070的磷以植酸形式存在。植酸易的磷以植酸形式存在。植酸易同同铁铁、钙钙等金属离子或蛋
49、白等金属离子或蛋白质结质结合排出体外，易合排出体外，易引起水引起水华华。为为从根本上解决水稻中的高植酸从根本上解决水稻中的高植酸问题问题，可将植酸可将植酸酶酶基因基因导导入水稻，培育低植酸入水稻，培育低植酸转转基因水基因水稻品种。下稻品种。下图图是是获获取植酸取植酸酶酶基因的流程。基因的流程。五、课堂练习五、课堂练习图图中基因中基因组组文文库库_(_(小于小于/等于等于/大于大于)cDNA)cDNA文文库库。B B过过程需要的程需要的酶酶是是_；A A、C C过过程中程中_(_(可可以不可以以不可以)使用同一种探使用同一种探针筛选针筛选含目的基因的菌株。含目的基因的菌株。目的基因目的基因和和除
50、从构建的文除从构建的文库库中分离外，中分离外，还还可以分可以分别别利用利用图图中中_和和_为为模板直接模板直接进进行行PCRPCR扩扩增，增，该过该过程中所用程中所用酶酶的的显显著特点是著特点是_。大于大于反转录酶反转录酶可以可以DNADNAcDNAcDNA耐高温耐高温五、课堂练习五、课堂练习 5.1970年，特明和巴年，特明和巴尔尔的摩的摩证实证实了了RNA病毒能依病毒能依赖赖RNA合成合成DNA的的过过程，并程，并发现发现了催化此了催化此过过程的程的酶酶。下面。下面为为形成形成cDNA的的过过程和程和PCR扩扩增增过过程示程示意意图图。请请根据根据图图解回答下列解回答下列问题问题：五、课堂