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1、Westernblot技术原理及常用产品介绍目录Western Blot一般流程Western Blot简介及原理Western Blot常见问题分析Western Blot简介及原理*Western Blot 简介简介*印迹法blotting是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反响来检测样品的一种方法。*1975年，Southern将DNA转移到硝酸纤维素膜NC膜上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段，称为Southern印迹法。*而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进展印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为West
2、ern印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。*Western Blot根本原理根本原理 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针是抗体，“显色用标记的二抗。经过PAGE别离的蛋白质样品，转移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳别离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反响，再与酶或同位素标记的第二抗体起反响，经过底物显色或放射自显影以检测电泳别离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的We
3、stern是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。*Western Blot应用应用q研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中q蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。q目的蛋白的表达特性分析q目的蛋白与其它蛋白的互作q目的蛋白的组织定位q目的蛋白的表达量分析*Western Blot检测对照照成功进展Western Blot检测，设置适宜正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到Western Blot的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞
4、，用于检测抗体的工作效率阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性内参对照：检测标本的质量和二抗系统空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果Western Blot一般流程*Western Blot 流程流程*WB第第1步：组织或细胞蛋白提取、样本处理步：组织或细胞蛋白提取、样本处理一、蛋白提取一、蛋白提取 蛋白提取的质量直接决定着蛋白提取的质量直接决定着WB结果的好坏，因此，根据结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择适宜的蛋白制备方法是至关重要的标本类型和检测类型选择适宜的蛋白制备方法是至关重要的！使用适当的裂解液
5、裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用商业化的试剂盒进展抽提。蛋白，也可以使用商业化的试剂盒进展抽提。线粒体/细胞浆蛋白别离试剂：该试剂盒提供独特的试剂可从多种哺乳动物细胞包括凋亡和非凋亡细胞中别离出线粒体局部和胞浆局部，得到的蛋白保持了原有的生物学活性，可直接用于分析线粒体组份在胞浆和线粒体中分布的变化，如：WB，ELIS
6、A等。操作过程简单、方便，不使用有毒的物质，无需超速离心。该试剂盒也可用于别离完整的线粒体架构。3、在检测时使用内参抗体，以检测蛋白提取的质量、在检测时使用内参抗体，以检测蛋白提取的质量 作为最大的抗体供给商，abcam可以为您提供19种不同内参的抗体。分子量覆盖从15KD到130KD，可以满足您不同样品的需求 同时，abcam提供一系列检测内参的兔单克隆抗体RabMAb。兔单克隆抗体兼具兔免疫系统的高抗原识别能力和单克隆抗体的高特异性。abcam 兔单克隆抗体的亲和力较高，有的抗体稀释度可以高达1:20000，仍能获得清晰的条带。提取蛋白后进展蛋白的定量，以对后续操作进展监控比方半定量，确定
7、蛋白上样量等蛋白质的快速定量方法主要依靠蛋白质本身的发色基团，或其与其它显色剂反响产生的紫外吸收来进展定量。目前常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三种。也有市售的商业化的蛋白定量试剂盒，可直接购置使用。4、蛋白的定量、蛋白的定量1.Western Blot采用的是什么凝胶进展电泳？被检采用的是什么凝胶进展电泳？被检测物是？测物是？2.Western Blot应用？应用？3.Western Blot应用一般需要设置的对照？应用一般需要设置的对照？4.Western Blot一般流程？一般流程？5.组织或细胞蛋白提取注意哪些事项？组织或细胞蛋白提取注意哪些事项？6.提取蛋
8、白后进展蛋白的定量常用的用哪些？提取蛋白后进展蛋白的定量常用的用哪些？*WB第第2步：步：SDS-PAGE电泳别离蛋白电泳别离蛋白聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体acrylamide，简称ACR和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺N,N-methylene bisacrylsmide 简称BIS在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状构造的凝胶。通过改变单体浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，用于别离分子量大小不同的物质。参加离子去污剂和强复原剂(SDS即十二烷基硫酸钠)后，蛋白质亚基的电泳迁移率不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。1、电泳样品制备试剂盒及工具、电泳样品制
9、备试剂盒及工具2、制备凝胶、制备凝胶凝胶的浓度取决于目的蛋白的分子量大小，目的蛋白分子量越大，那么凝胶浓度越低。M丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺 神经毒素！MSDSM配胶的Tris缓冲液MTEMED 神经毒素！M过硫酸铵(AP 神经毒素！MTris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成分凝胶成分需严密固定！2、制备凝胶、制备凝胶电泳电泳上样 每孔上样量为20-50 g蛋白；根据目的蛋白的表达情况的不同而有所变化。浓缩胶分离胶 主要型号：SE250/260/300/600等垂直电泳，其中特别推荐250和260，可同时跑2块10X8/10X10.5的胶此3款标准套件里包含SE245的灌胶槽市场价市场价经销商
10、价经销商价7061494291935976133478676其他配件：梳子，隔条、灌胶槽名称货号牌价经销商价格电泳梳子，10孔，长度10cm，厚度;0.75mm,宽度：4.8mm，加样原则是1mm深度=3.6ul样品SE211A-10-.75499349电泳梳子，10孔，长度10cm，厚度;1mm,宽度：4.8mm，加样原则是1mm深度=4.8ul样品SE211A-10-1.0499349电泳梳子，10孔，长度10cm，厚度;1.5mm,宽度：4.8mm，加样原则是1mm深度=7.2ul样品SE211A-10-1.5499349电泳梳子，15孔，长度10cm，厚度;0.75mm,宽度：2.9m
11、m，加样原则是1mm深度=2.2ul样品SE211A-15-.75499349电泳梳子，15孔，长度10cm，厚度;1.5mm,宽度：2.9mm，加样原则是1mm深度=4.4ul样品SE211A-15-1.5499349电泳梳子，18孔，长度10cm，厚度;1mm,宽度：2.9mm，加样原则是1mm深度=2.9ul样品SE211A-18-1.0507355隔条:垫于玻璃板之间，是两块玻璃板之间形成灌胶的空间，厚度0.75mm，长度8cm,2个包装SE2119T-2-.75499349隔条:垫于玻璃板之间，是两块玻璃板之间形成灌胶的空间，厚度1mm，长度8cm,2个包装SE2119T-2-1.0
12、499349隔条:垫于玻璃板之间，是两块玻璃板之间形成灌胶的空间，厚度1.5mm，长度8cm,2个包装SE2119T-2-1.5499349SE245的灌胶槽SE27551263588考马斯亮蓝染胶考马斯亮蓝染胶转膜转膜Western Blot实验实验SDS-PAGE电泳实电泳实验验SDS-PAGE胶的考马斯亮蓝染色*WB第第3步：转膜步：转膜*WB第第3步：转膜步：转膜原理：蛋白因结合原理：蛋白因结合SDS而带电荷，转膜即在电场而带电荷，转膜即在电场作用下从胶中转至膜上的过程。作用下从胶中转至膜上的过程。要将电泳后别离的蛋白质从凝胶中转移到固相载要将电泳后别离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体例
13、如体例如NC膜上，通常有两种方法：毛细管膜上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全一样，只是用于固定胶理完全一样，只是用于固定胶/膜叠层和施加电膜叠层和施加电场的机械装置不同。场的机械装置不同。半干转半干转湿湿 转转半干式转膜速度快，适合与小分子量蛋白湿式成功率高并特别适合用于分子量大于 100KD的蛋白两种方法的转膜液不同！*湿湿转系系统本卷须知：1.胶在负极，膜靠近正极3.转膜过程产生大量热量，需冰浴夹板海绵滤纸凝胶膜滤纸海绵正极负极*半干半干转印系印系统注意：防止短路！3.
14、转膜转膜 转膜准备制作“三明治3.转膜转膜 *最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素Nitrocellulose，NC膜和聚偏二氟乙烯 Polyvinylidene Fluoride,PVDF膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。转膜后，确定转膜效率至为重要，可通过以下方法检测：1、在转膜后使用丽春红可逆染色对杂交膜染色，同时使用考马斯亮蓝对转膜后的凝胶进展染色，检测凝胶上的蛋白是否已经完全充分的转移到杂交膜上。膜有很清晰的蛋白条带，而凝胶上无蛋白存在。2、使用预染蛋白Marker，检测Marker的转移情况，当和目的蛋
15、白大小相当的Marker完全转移后即可停顿，但是有时需要相对延长一些时间，因为Marker相对目的蛋白会比较容易转移。名称及货号规格价格Prism Ultra Protein Ladder(10-245 kDa)(ab116028)500 l RMB1,258.00 Prism Ultra Protein Ladder(10-180 kDa)(ab116027)500 lRMB1,144.00Prism Protein Ladder(10-175 kDa)(ab115832)500 lRMB1,144.00Prism Ultra Protein Ladder(3.5-245 kDa)(ab11
16、6029)500 l RMB1,258.00蛋白质分子量蛋白质分子量Marker蛋白质分子量Marker的使用，是检测电泳效果和确定待测靶蛋白分子量大小和正确与否的保证！预染Marker更方便直接观察电泳和转膜效果。*WB第第4步：封闭步：封闭杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有穿插反响。封闭完成后要进展洗膜，以去除膜上未结合的封闭试剂。洗涤液使用TBST或者PBST，其中的T
17、ween有助于去除非特异性的结合，减少背景。同时短时间屡次的洗膜如5-6次，每次3分钟比长时间少次数的洗膜更有效。S封闭剂：S5%脱脂奶粉或牛血清白蛋白BSA，或3%明胶溶于TBSTTris-Hcl,NaCl,tween20。S Western Blot 膜封闭液生物试剂公司Sab64226 Protein Block 125ml RMB1,544.00：专门设计的即用型封闭试剂，适用于IHC，WB，ELISA。组份：BSA,Casein,PBS,Sodium Azide,pH 7.4。注：Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。在选择封闭剂时，要注意一些特殊情况：1
18、)脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素。2)如果封闭剂中含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白会受到影响，因为磷酸酶与印迹膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化。3)检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭试剂。*WB第第5步：免疫反响步：免疫反响-抗体孵育抗体孵育1.把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量参加一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。2.用TBST漂洗膜3-5次，每次5-10min。3.参加用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。4.用TBST漂洗
19、膜3次，每次5-10min。5.最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。6.参加显色底物进展显色反响。加入一抗，室温孵育1-2小时或4过夜洗膜加入二抗，室温孵育1-2小时或4过夜洗膜显色*WB第第5步：免疫反响步：免疫反响-抗体孵育抗体孵育1.按照抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST稀释抗体；2.抗体孵育时间：室温下孵育12h或4过夜一般不超过18小时；3.保持适当的摇动使抗体与膜的结合均匀；一抗孵育一抗孵育一抗的选择成功与否，是整个一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键：选择一实验成功的关键：选择一抗有以下几个注意点：抗有以下几个注意点：1、选择适合检测标本种属的一抗说明书有验证、选择
20、适合检测标本种属的一抗说明书有验证2、选择适用于、选择适用于WB实验方法的一抗说明书有验证实验方法的一抗说明书有验证3、选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体、选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体*WB第第5步：免疫反响步：免疫反响-抗体孵育抗体孵育内参的使用WB 过程监测以及目的蛋白定量的标准！在WB试验中，最重要和最不可或缺的对照就是内参照Loading Control，Internal Control。内参照的使用有两个方面的作用：1.是检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，如果一个实验连内参照都出不了阳性结果的话在内参抗体有效的情况下，那么这个体系就是存在问题的了2.半定量
21、的标准：内参一般选择管家基因编码表达的蛋白，在很多组织和细胞中都是稳定表达的，因此可以作为检测靶蛋白表达量的标准。Abcam提供种类齐全的内参抗体，完全满足您的所需！上二抗上二抗摆床上，二抗杂交，室温25左右1h，或4过夜。PBST(TBST)洗涤3次，每次10分钟。二抗孵育二抗孵育二抗选择：根据一抗来源种属以及抗体Ig亚型选择适宜的二抗。比方，如果一抗是小鼠IgG来源的抗体，二抗需选择抗小鼠IgG的；如果一抗是小鼠 IgM 来源的抗体，那么二抗要选择抗小鼠IgM的。根据说明书推荐浓度使用TBST稀释二抗：如果说明书没有推荐浓度，可进展多个稀释比例进展摸索最正确稀释度1:1000-1:2000
22、0。孵育条件一般为室温1-2小时。不同二抗稀释浓度的效果图Abcam提供针对多个种属、多种亚型、多种标记的二抗，配套Abcam的一抗使用，是非常理想的搭配！*WB第第6步：底物孵育和检测步：底物孵育和检测 显色方法显色方法代表类型代表类型特点特点酶促底物发光法 DAB显色法稳定性好，灵敏度较高（250pg），背景一般，成像性较差，药品疑有一定致癌性。化学发光法（推荐使用）ECL发光法稳定性好，灵敏度高（10-12g），背景可以很低，成像性好，且可以重复标记。暗室操作！A液B液11:膜混合ECL工作液滴加ECL工作液 显影、定影碱式磷酸酶AP标记 化学发光示意图辣根过氧化物酶HRP标记化学发光示意图HRP（辣根过氧化酶)AP（碱性磷酸酶）大小40Kd140Kd最佳酶活性PH：57PH：810酶活和二抗特异性好于AP抑制剂氰化物，硫化物叠氮钠氰化物，砷酸盐，有机磷，二价阳离子螯合剂稳定性零度以下稳定零度以下不稳定底物很多部分动力学特性快速慢价格便宜昂贵发光底物 ECL显色底物TMB，CN，DABNBT，BCIP，NBT/BCIP两种常用检测酶系统的比较两种常用检测酶系统的比较