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1、关于病毒感染力的滴定第一页，本课件共有26页半数致死量半数致死量LDLD5050（50%lethal dose50%lethal dose）半数感染量半数感染量IDID5050(50%infective dose)(50%infective dose)半数鸡胚致死量半数鸡胚致死量ELDELD5050(egg 50%lethal dose)(egg 50%lethal dose)半数鸡胚感染量半数鸡胚感染量EIDEID5050(egg 50%infective dose)(egg 50%infective dose)半数细胞培养物感染量半数细胞培养物感染量TCIDTCID5050（tissue
2、culture tissue culture 50%infective dose)50%infective dose)蚀斑形成单位（蚀斑形成单位（plaque forming unitplaque forming unit，PFUPFU）u测定病毒感染力的方法测定病毒感染力的方法:第二页，本课件共有26页将将病病毒毒作作一一定定梯梯度度的的连连续续稀稀释释后后接接种种于于实实验验动动物物或或鸡鸡胚胚或或培培养养细细胞胞，每每一一稀稀释释度度作作多多个个重重复复，在在一一定定时时间间内内，记记录录动动物物（鸡鸡胚胚）发发病病或或死死亡亡的的数数量量或或细细胞胞病病变变的的情情况况，利利用用Ree
3、d-MuenchReed-Muench法法或或KarberKarber法计算病毒的感染力。法计算病毒的感染力。u测定病毒感染力的基本过程测定病毒感染力的基本过程:第三页，本课件共有26页一、病毒一、病毒TCIDTCID5050的测定的测定l操作步骤操作步骤l在在青青霉霉素素瓶瓶中中将将病病毒毒作作连连续续1010倍倍的的稀稀释释，从从1010-1-1-1010-10-10。l将将稀稀释释好好的的病病毒毒接接种种到到9696孔孔微微量量培培养养板板中中，每每一一稀稀释释度作度作8 8 孔，每孔接种孔，每孔接种100l100l。l在在每每孔孔加加入入细细胞胞悬悬液液100l100l，使使细细胞胞量
4、量达达到到3103105 5个个/ml/ml。第四页，本课件共有26页l设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。l逐日观察并记录结果，一般需要观察逐日观察并记录结果，一般需要观察5-75-7天。天。l结果的计算，按结果的计算，按Reed-MuenchReed-Muench两氏法或两氏法或KarberKarber法法第五页，本课件共有26页10-110-210-310-410-510-610-710-8TCIDTCID5050的计算方法的计算方法（Calculation of TCIDCalculation of TCID5050）第六页，本课件共有26页病毒
5、液病毒液 出现出现 无无CPE CPE 累累 计计 出现出现CPECPE孔孔稀释度稀释度 CPECPE孔数孔数 孔数孔数 CPECPE孔数孔数 无无CPECPE孔数孔数 所占的所占的%10-180510100（51/51）10-280430100（43/43）10-380350100（35/35）10-480270100（27/27）10-580190100（19/19）10-67111191.7（11/12）10-7354640（4/10）10-8171137.1（1/14）1、Reed-Muench法法CPE：Cytopathiceffect第七页，本课件共有26页距距离离比比例例（高高于
6、于50%50%病病变变率率的的百百分分数数-50%-50%）/（高高于于50%50%病变率的百分数病变率的百分数-低于低于50%50%病变率的百分数）病变率的百分数）（91.7-5091.7-50）/（91.7-4091.7-40）0.80.8第八页，本课件共有26页lgTCIDlgTCID5050=距距离离此此例例稀稀释释度度对对数数之之间间的的差差+高高于于50%50%病变率的稀释度的对数病变率的稀释度的对数 =0.8(-1)+(-6)=0.8(-1)+(-6)=-6.8 =-6.8 TCID TCID5050=10=10-6.8-6.80.1ml0.1ml含含义义：将将该该病病毒毒稀稀释
7、释10106.86.8倍倍接接种种9696孔孔细细胞胞培培养养板板，每孔每孔100l100l，可使，可使50%50%接种孔的细胞发生病变。接种孔的细胞发生病变。第九页，本课件共有26页2、Karber法法病毒液稀释度病毒液稀释度 出现出现CPECPE的孔数的孔数 出现出现CPECPE孔的比率孔的比率10-188/8=110-288/8=110-388/8=110-488/8=110-588/8=110-677/8=0.87510-733/8=0.37510-811/8=0.125第十页，本课件共有26页lgTCIDlgTCID5050=L-d(s-0.5)=L-d(s-0.5)L L：最高浓度
8、的稀释度的对数：最高浓度的稀释度的对数D D：稀释度对数之间的差：稀释度对数之间的差S S：阳性孔比率总和：阳性孔比率总和lgTCIDlgTCID5050=-1-1(6.375-0.5)=-1-1(6.375-0.5)=-6.875 =-6.875 TCID TCID5050=10=10-6.875-6.875/0.1ml/0.1ml 第十一页，本课件共有26页二、病毒蚀（噬）斑技术二、病毒蚀（噬）斑技术l病毒蚀斑（病毒蚀斑（plaque)plaque)又又称称空空斑斑，指指病病毒毒在在已已长长成成的的单单层层细细胞胞上上形形成成的局限性病灶。的局限性病灶。第十二页，本课件共有26页原原理理：
9、适适当当稀稀释释的的病病毒毒悬悬液液接接种种已已经经长长成成单单层层的的敏敏感感细细胞胞后后，在在覆覆盖盖的的固固体体或或半半固固体体介介质质（琼琼脂脂糖糖、甲甲基基纤纤维维素素）的的作作用用下下，病病毒毒在在最最初初感感染染的的细细胞胞内内增增殖殖后后，只只能能进进而而感感染染并并破破坏坏临临近近的的细细胞胞，经经过过几几个个增增殖殖周周期期后后，形形成成一一个个局局限限性性的的肉肉眼眼可可见见的的病病变变细细胞胞区区，即局限性的病灶。即局限性的病灶。plaques第十三页，本课件共有26页Procedures第十四页，本课件共有26页操作步骤操作步骤将敏感细胞在平皿或将敏感细胞在平皿或6
10、6孔板内培养成单层孔板内培养成单层吸弃培养液，加入含钙、镁的吸弃培养液，加入含钙、镁的PBSPBS（pH7.4pH7.4）洗）洗1-21-2次。次。用用维维持持液液将将病病毒毒液液作作连连续续1010倍倍的的稀稀释释，选选择择适适当当稀稀释释度度的的病病毒毒悬悬液液接接种种培培养养孔孔内内的的单单层层细细胞胞，接接种种量量约约为为原原培培养养液液的的1/10-1/51/10-1/5，以以覆覆盖盖住住细细胞胞单单层层为为宜宜，每每个个稀稀释度接种释度接种2-32-3孔。孔。l（一）用琼脂糖覆盖，中性红染色（一）用琼脂糖覆盖，中性红染色第十五页，本课件共有26页将将培培养养板板置置37 37 5%
11、5%COCO2 2培培养养箱箱吸吸附附1h1h，吸吸弃弃病病毒毒液液，用含钙、镁的用含钙、镁的PBSPBS（pH7.4pH7.4）洗）洗3 3次。次。取取1.6%-2%1.6%-2%的的低低熔熔点点琼琼脂脂糖糖，融融化化后后降降温温至至38-4238-42，与与等等量量预预热热至至38-4238-42含含6%-10%6%-10%犊犊牛牛血血清清的的无无酚酚红红DMEMDMEM混混合合，注入细胞培养板中。注入细胞培养板中。第十六页，本课件共有26页室室温温放放置置直直至至琼琼脂脂糖糖凝凝固固，或或于于44冰冰箱箱放放置置几几分分钟钟至至琼琼脂脂糖糖凝凝固固，然然后后于于37 37 5%5%COC
12、O2 2培培养养箱箱继继续续培培养。养。每天于显微镜下观察细胞病变情况。每天于显微镜下观察细胞病变情况。出出现现空空斑斑后后（2-32-3天天），用用含含钙钙、镁镁的的PBSPBS将将0.1%0.1%的的中性红贮存液中性红贮存液1010倍稀释后滴加到细胞培养板上。倍稀释后滴加到细胞培养板上。于于37 37 5%5%COCO2 2培培养养箱箱中中作作用用1h1h，吸吸弃弃染染液液，继继续续于温箱中培养于温箱中培养2-3h2-3h。第十七页，本课件共有26页TKTK-突变株与野毒形成的空斑的比较突变株与野毒形成的空斑的比较第十八页，本课件共有26页l（二）用甲基纤维素覆盖，结晶紫染色（二）用甲基纤
13、维素覆盖，结晶紫染色将敏感细胞在平皿或将敏感细胞在平皿或6 6孔板内培养成单层。孔板内培养成单层。吸弃培养液，加入含钙、镁的吸弃培养液，加入含钙、镁的PBSPBS（pH7.4pH7.4）洗）洗1-21-2次。次。用用维维持持液液将将病病毒毒液液作作连连续续1010倍倍的的稀稀释释，选选择择适适当当稀稀释释度度的的病病毒毒悬悬液液接接种种培培养养孔孔内内的的单单层层细细胞胞，接接种种量量约约为为原原培培养养液液的的1/10-1/51/10-1/5，以以覆覆盖盖住住细细胞胞单单层层为为宜宜，每每个个稀稀释释度接种度接种2-32-3孔。孔。将将培培养养板板置置37 37 5%5%COCO2 2培培养
14、养箱箱吸吸附附1h1h，吸吸弃弃病病毒毒液液，用用含钙、镁的含钙、镁的PBSPBS（pH7.4pH7.4）洗）洗3 3次。次。第十九页，本课件共有26页覆盖配好的覆盖配好的4%4%羧甲基纤维素钠（含羧甲基纤维素钠（含3%3%新生牛血清）。新生牛血清）。48-72h48-72h后后，待待细细胞胞出出现现病病变变或或蚀蚀斑斑时时，各各孔孔补补满满10%10%中中性甲醛，固定性甲醛，固定4h4h以上。以上。弃掉孔中液体，流水侧板冲洗数次。弃掉孔中液体，流水侧板冲洗数次。各各孔孔补补加加配配好好的的结结晶晶紫紫溶溶液液（0.35%0.35%、w/vw/v），作作用用15min15min。弃弃掉掉染染液
15、液，继继续续冲冲洗洗数数次次，在在3737温温箱箱中中敞敞口口烘烘干干，显显微镜下计空斑数。微镜下计空斑数。第二十页，本课件共有26页第二十一页，本课件共有26页蚀斑技术的应用：蚀斑技术的应用：用于病毒纯化：挑选病毒的克隆株用于病毒纯化：挑选病毒的克隆株测定病毒悬液中感染病毒的含量测定病毒悬液中感染病毒的含量第二十二页，本课件共有26页如果是作病毒纯化如果是作病毒纯化 挑挑取取空空斑斑于于200L200L维维持持液液中中，反反复复冻冻融融3 3次次，接接种种于于PK-15PK-15细细胞胞已已长长成成单单层层的的2424孔孔细细胞胞培培养养板板，再再于于37 5%CO37 5%CO2 2培养箱
16、培养至完全发生病变。培养箱培养至完全发生病变。第二十三页，本课件共有26页一一般般的的毒毒种种纯纯化化：收收集集病病变变的的细细胞胞悬悬液液，通通过过PCRPCR或或其其它它方方法法进进行行鉴鉴定定，并并测测定定TCIDTCID5050，然然后后选选TCIDTCID5050较较高高者者再再作作几几轮轮空空斑斑纯纯化化，获获得得高高滴滴度度的的病病毒，扩大培养后作种用。毒，扩大培养后作种用。筛筛选选重重组组病病毒毒：收收集集病病变变的的细细胞胞或或病病毒毒悬悬液液，通通过过PCRPCR或或其其它它方方法法进进行行鉴鉴定定，取取阳阳性性者者再再作作下下一一轮轮空空斑斑纯纯化化。如如此此3-53-5轮轮空空斑斑纯纯化化后后即即可可得得到到纯纯化化的的病毒粒子。病毒粒子。第二十四页，本课件共有26页如如果果是是测测定定PFUPFU，则则直直接接记记取取一一定定稀稀释释度度的的病病毒毒所所形形成成的空斑数，然后计算的空斑数，然后计算PFUPFU。蚀蚀斑斑形形成成单单位位（plaque plaque forming forming unit,unit,PFUPFU）：每每毫毫升升病病毒毒悬悬液液中中所所含含的的蚀蚀斑斑数数，即即病病毒毒悬悬液液中中的的感感染染性性病病毒浓度。毒浓度。第二十五页，本课件共有26页感感谢谢大大家家观观看看第二十六页，本课件共有26页